Caracterização de Metabolic Estado em não-humanos Primatas com o Teste de Tolerância à glicose intravenosa

Resumo

O objetivo deste protocolo é o de apresentar um método padrão para executar testes de tolerância à glicose intravenosa (IVGTTs) para avaliar o controle glicêmico em primatas não humanos e avaliar o seu estado metabólico do saudável dismetabólica.

Resumo

O teste de tolerância à glucose intravenosa (IVGTT) desempenha um papel fundamental na caracterização da homeostase da glucose. Quando tomados em conjunto com exames laboratoriais, inclusive dos níveis de glicose no sangue, tanto no alimentados e em jejum estado, HbA1c, níveis de insulina, história clínica de dieta, composição corporal e peso corporal, uma avaliação do controle glicêmico normal e anormal pode ser feita . Interpretação de um IVGTT é feito através da medição de alterações nos níveis de glucose e insulina ao longo do tempo em relação ao desafio de dextrose. Os componentes críticos a ser considerados são: os níveis de glucose de pico de insulina e chegaram em relação ao T0 (final da infusão de glucose), a taxa de eliminação da glucose K derivado a partir do declive de uma rápida eliminação de glucose no primeiro 20 min (T1 a T20), o tempo de para voltar à linha de base de glicose, e a área sob a curva (AUC). Estas medidas IVGTT irá mostrar alterações características à medida que a homeostase de glicose a partir de uma saudável toa estado metabólico doente ^5. Aqui descrevemos a caracterização de primatas não humanos (macacos rhesus e cynomolgus), que são o modelo mais relevante animais de diabetes do tipo II (DT2) em seres humanos e a IVGTT e quadro clínico desses animais a partir de uma magra saudável, para dismetabólica obesos, e T2D estado ^{8, 10, 11.}

Introdução

O IVGTT é um ensaio funcional conveniente que é rotineiramente utilizada para determinar a função das células-β em seres humanos em diferentes estados metabólicos ^{5, 7.} Em modelos animais de diabetes tipo 2, é bem reconhecido como uma ferramenta para caracterizar animais que mostram a progressão da doença metabólica de um saudável para um estado hiperglicémico dismetabólica ^{8, 9.} O modelo animal mais próximo de DT2 é demonstrada em primatas não humanos (PNH), dos quais rhesus e cynomolgus macacos são exemplos notáveis. Estes animais desenvolvem naturalmente T2D com os mesmos fatores de risco de idade e obesidade contribui para sua incidência como em humanos ^10. Além disso, há uma progressão da doença e patologia semelhante pancreática, apresentando depósitos amilóides medida que a doença progride dismetabólica ^11.

Aqui nós relatamos em nosso método padrão de realizar uma IVGTT em NHPs como parte de nossa caracterização colônia de estado metabólico nestes animais. Este método éfácil de executar em relação à outra mais demorado, e técnicas dispendiosas ^2. O IVGTT é útil para a caracterização de uma grande colônia de animais rápida e frequentemente. Quando tomados em consideração com o nível de hemoglobina glicosilada (HbA1c), história dietética e ingestão de alimentos do animal, bem como a sua magra massa gorda e do corpo por cento, o IVGTT é normalmente suficiente para caracterizar o estado metabólico de um animal e a progressão para a diabetes declarada ^{6 , 8.}

HbA1C representa o nível glicêmico média ao longo da vida de um glóbulo vermelho, proporcionando uma medida confiável dos níveis de glicose ao longo das seis semanas anteriores a três meses. Quando medido a partir da amostra de sangue de linha de base em jejum do IVGTT, este valor fornece uma janela para o controlo da glicemia durante os meses entre procedimentos. Se o animal tem a transição de dismetabólica para diabéticos desde a sua última IVGTT, um valor de HbA1C muito superior ao seu valor anterior indicariaque a transição começou logo após a sua última IVGTT, ao passo que, um valor de HbA1C mais perto de seu valor anterior indicaria que eles têm apenas recentemente transferida. De um modo geral, em macacos rhesus, a HbA1C valores superiores a 6% são considerados anormais, e indicam mau controlo glicémico ^{10, 23.}

glicemia devem ser interpretados dentro do contexto do comportamento e estado geral de saúde do animal como um todo. macacos diabéticos - como seres humanos - hiperfagia exposição, polidipsia e poliúria. habitação grupo de animais fornece desafios significativos para a medição desses indicadores e do cuidado individual necessários para dismetabólica e macacos diabéticos. Recomendamos isoladamente abrigando os animais, a fim de que o cuidado mais personalizado pode ser fornecido, e os marcadores comportamentais da saúde do macaco mais facilmente ser monitorado ^8. Além disso, os macacos diabéticos irá apresentar perda de peso, assim como um perfil lipídico elevado (maiorcolesterol, hipertrigliceridemia) e metabolismo mineral perturbado na química do soro. É importante para medir marcadores da função hepática e renal na química do soro, como danos a estes órgãos são frequentemente complicações de avançar metabólica distúrbio / diabetes, e podem ser co-determinantes do glicêmico, lipídico e desequilíbrios minerais ^{9, 11, 18, 24} .

Ao utilizar este método, os valores históricos gerado a partir de várias caracterizações, frequentes ao longo da vida de um macaco são de particular valor. Se outros procedimentos, como uma braçadeira de glicose ou classificados infusão de glicose (GGI), são necessários para avaliar plenamente a saúde de um animal, é comumente sobre caracterização inicial, quando sua história não está disponível. IVGTTs No entanto, uma vez que uma linha de base foi estabelecida, repetidas de uma frequência de três em três meses são normalmente suficiente para acompanhar o progresso de um animal. Isto é particularmente importante quando os animais estão inscritos em vários estudos ao longo de umano civil com base em seu estado metabólico. Embora a sua saúde pode permanecer relativamente estável por ano de cada vez, quando o estado metabólico de um animal piora, um aumento dramático na resistência à insulina e intolerância à glucose pode ocorrer muito rapidamente. os valores de HbA1c permitir alguma interpolação do declínio ou a melhoria do estado de saúde do animal entre os procedimentos agendados três meses de intervalo. Por esta razão, este método é ideal para a caracterização de animais utilizados em vários estudos longitudinais, ao longo do seu tempo de vida natural.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Instituto David H. Murdock Research IACUC localizado no Campus North Carolina Research (NCRC), sob o protocolo 14-017, Caracterização de um modelo de primata não humano de diabetes e pré-diabetes / resistência à insulina e eficácia da terapêutica para melhorar a sensibilidade à insulina e a função metabólica.

1. Seleção de animais e preparação do estudo

1. Select dieta e peso dos animais estáveis ​​com base em registros mensais de consumo alimentar e peso corporal.
   NOTA: Os animais que exibiram um declínio recente no apetite não devem ser caracterizadas até sua ingestão de alimentos tenha se estabilizado.
   1. Para os animais maduros (> 5-6 anos), não selecione animais cujos pesos entre meses consecutivos corpo diferem em mais de 10%, sem antes examinar o macaco e exclusão de outras do que mudar de estado metabólico para a mudança dramática no peso causas.
2. Para a glucose, insulina e c-Peptide analitos, prepare-se K ₂ EDTA tubos de coleta de amostra com inibidor de protease (aprotinina e DPP4I).
   NOTA: O cocktail DPP4I + Aprotinina proporciona um amplo espectro de inibição da protease caso seja necessário para analitos adicionais (glucagon, GLP-1). No caso de analitos adicionais não são recolhidos, os tubos de sangue devem ser preparados da mesma maneira de manter a coerência na recolha de amostras. As amostras para os ensaios não validados para este método devem ser recolhidos separadamente, de acordo com as recomendações do fabricante.
   1. Prepara-se o cocktail de inibidores de protease através da mistura de 100 mg de liofilizado de aprotinina com 10 ml de DPP4I. Adicionar 10 uL da mistura de aprotinina + DPP4I a cada tubo de sangue para cada mililitro de sangue recolhido.
   2. Adicionar um adicional de 10 ul do cocktail inibidor de protease a cada tubo para uma possível sobrecarga de recolha. Armazenar os tubos de sangue tratado a -20 ° C até à sua utilização. Mantenha os tubos sobre gelo molhado durante o procedure e centrifugação a 4 ° C.
   3. Use um tubo separador de soro para recolher uma amostra de sangue na linha de base para a análise química do soro padrão. Para o hemograma completo (CBC), use um padrão de K ₂ EDTA sem inibidores da protease. Use cryovials a plasma alíquota e soro após as amostras de sangue foram centrifugadas.
   4. Rotular os tubos de sangue e os criotubos de forma adequada com a identificação dos animais, a data, o procedimento, ponto de tempo e volume da amostra. Rotular os criotubos com o analito (s) no plasma para o ensaio apropriado.
3. Preparar a solução salina heparinizada através da injeção de 0,15 ml de 1.000 unidades USP por ml de heparina em um saco de 250 ml de solução salina normal. Se obter uma solução de 0,06 mg de heparina / ml. Desenhar 40 - 60 ml desta solução para uma solução salina de bloqueio para a lavagem entre as amostras. Desenhar um adicional de 1 ml e 5 ml em seringas separadas para a descarga do porto de infusão de dextrose antes e depois da infusão, respectivamente.

2.Sedação Animal e Preparação

1. Retire os alimentos de gaiola do animal não menos do que 14 horas antes do procedimento, e não mais do que 18 horas.
   NOTA: É importante que os animais ser submetidos a jejum durante o procedimento, para evitar qualquer variação pós-prandial em valores de glicemia. Também é uma precaução para evitar a regurgitação e aspiração do conteúdo do estômago, enquanto anestesiados.
2. sedar animais para a duração do procedimento de IVGTT com cetamina administrada por via intramuscular como uma anestesia geral, a 10 mg / kg. Administrar cetamina adicional (5 - 10 mg / kg) em intervalos de 20-30 minutos, ou conforme necessário, durante o procedimento.
   1. Pesar o animal sedado. Colocar o animal numa posição reclinada lateralmente sobre uma mesa aquecida procedimento.
   2. Monitorar os parâmetros clínicos a cada 15 a 20 minutos para assegurar que o animal está situado num plano estável de anestesia. Medir a frequência cardíaca (100-200 bpm) e SPO ₂ (> 92%) com um oxímetro de pulso. Medir a frequência respiratória (20 - 50 respirações / min) w om um cronômetro, contando respirações visual ou à mão mais de quinze segundos e multiplicando por quatro. temperatura medida (> 97 ° F) por via retal. Monitorar a cor da mucosa ao redor da gengiva e lábios (húmidas, rosa).
3. Preparar dois locais cânula. Use cortadores de cabelo para cortar o cabelo da área de interesse, onde o cateter será inserido, e esterilizar toda a região com a alternância de scrubs de clorexidina e álcool 70%.
   1. Coloque um cateter na região das veias esquerda ou direita cefálica ou safena e anexá-lo para um flush heparina salina (0,06 mg de heparina / ml) com uma torneira de três vias. Este é o site coleta de sangue amostragem.
   2. Coloque o segundo cateter em outra perna ou braço na região das veias cefálica ou safena e anexar uma porta. Utilize este site para a infusão de dextrose. Use uma pequena, 1 ml rubor de solução salina heparinizada para manter a patente cânula antes da infusão de dextrose.

e_title "> 3. IVGTT Procedimento

NOTA: O procedimento IVGTT é composto por 8 pontos temporais sorteio de amostragem de sangue (Tabela 1).

1. Tome o exemplo de linha de base e usar um glicosímetro portátil para medir o nível de glicose no sangue em jejum. Obter uma amostra de soro para análise química padrão, assim como uma amostra de sangue para hemograma completo, a fim de avaliar a saúde em geral do animal. Recolha de amostras de plasma para ensaiar os níveis de glucose e de insulina a partir da amostra de base utilizando um kit validado para utilização em macacos, conforme as instruções do fabricante ^{8, 9.}
   NOTA: É importante ter uma pré-estiragem de 0,5 ml tomados a partir da cânula antes de tomar qualquer amostra para a recolha de sangue para remover o sangue residual ou heparina no espaço morto da cânula.
2. Após a obtenção da amostra de linha de base, infundir a dose de 50% de dextrose (250 mg / kg) ao longo de 30 seg para o porto de infusão de dextrose.
   NOTA: Os modelos de dose mais elevada (500 mg / kg) pode ser usado,embora a dose deve ser fixado através de procedimentos, a fim de fazer comparações longitudinais.
   1. Lavar o porto de infusão com 5 ml de soro fisiológico heparinizado para certificar-se de que não há dextrose deixado no porto. O final da infusão é a T0. Tem o técnico substitua as luvas, como dextrose residual a partir da infusão podem contaminar amostras de sangue subseqüentes.
3. O primeiro pós-infusão ponto de tempo de amostragem é em T3 min, a partir do final da infusão de dextrose, seguido de T5 minutos, T7 minutos, T10 minutos, T15 minutos, T20 minutos, e o último ponto de tempo de amostra é em T30 min. Recolha plasma de cada ponto de tempo a níveis de glicose no ensaio e insulina com a amostra de base (veja o passo 3.1).
   1. No T3 min ponto de tempo, use o segurou a mão glicosímetro para verificar mais uma vez o nível de glicose no sangue.
      NOTA: As leituras glicosímetro na linha de base e T3 são apenas para confirmar a infusão da dextrose. O nível de glucose no sangue no ponto de tempo T3 min deve ser ~ 100 mg / dl maior compared para o nível de glicose no plasma em jejum basal.

4. Recuperação de Animais e processamento de amostras

1. Retirar as cânulas e aplicar pressão para os locais sondados para hemostasia após a T30 min ponto de tempo. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência e está sentando-se. alimentação oferta uma vez que o animal está totalmente recuperado.
2. Imediatamente coloque cada amostra de sangue total em K ₂ tubos de EDTA em gelo. Centrifugar a 3000 rpm a uma temperatura de 4 ° C no decurso de 10 min de colheita. Partes alíquotas de plasma em criotubos, congelar e armazenar a -80 ° C até análise.
   1. Deixar o sangue para dentro do tubo de soro para análise química do soro padrão em repouso à temperatura ambiente durante não menos do que 20 minutos e a não mais do que 30 minutos antes de centrifugação a 3000 rpm à temperatura ambiente. Congelar as amostras de soro até analisadas num período de 48 horas de coleta.
      NOTA: Refrigerar toda a amostras de sangue coletadas para análise CBC até comosayed no prazo de 24 horas da coleta.

5. Tratamento de Dados

1. Depois de estabelecer as curvas de insulina no plasma e de glucose, determinar a velocidade de eliminação da glucose a partir do declive K do logaritmo natural de valores de glicose acima da linha de base ^{16, 17.}
   NOTA: A NHP saudável pode vir a ter uma taxa de depuração de glicose K bem acima de 1, muitas vezes maior do que 2 ou mais, como um animal saudável, muitas vezes, retornar aos seus valores de glicose basais dentro de 30 min. Como a produção de insulina cai, a taxa de eliminação da glucose K vai cair mais drasticamente, caindo abaixo de 1.
2. Calcula-se a AUC no seu conjunto, como a soma dos totais da área dos trapézios representando a área sob a curva de cada segmento de linha entre os pontos de tempo, através de T30 ^{16, 17.}
   NOTA: Tradicionalmente, a AUC dos primeiros dez minutos do procedimento é considerado o acute a resposta da insulina à glicose (AR), enquanto a AUC do último 20 min do processo é considerada a resposta tardia de insulina (LIR). Como o animal torna-se mais dismetabólica, a AUC de insulina irá aumentar, reflectindo a compensação para o aumento da insensibilidade à insulina. Como as transições para animais de diabetes, no entanto, a AUC irá diminuir, muitas vezes inicialmente na fase aguda de insulina, capturado pelo ar.

Resultados

Os resultados mostrados na Figura 1 são demonstrativas de curvas típicas de glucose e de insulina a partir maduros, saudáveis e diabéticos macacos cynomolgus ao longo de 30 min uma IVGTT. Os dados de macacos diabéticos saudáveis ​​e avançados são mostrados, a fim de contrastar as diferenças óbvias entre animais de ambos os extremos do intervalo de caracterização metabólica. Este protocolo IVGTT tem sido utilizado com sucesso pelos autores em macacos rhesus, com resultado...

Discussão

O IVGTT avalia a capacidade de libertação estimulada por glicose insulina por uma única infusão de dextrose com base no peso do corpo ^{5, 12, 13.} A partir do ensaio, a glucose no sangue em jejum e o nível de insulina é alcançada, e que permite uma avaliação da capacidade do animal para libertação de insulina e retornar o nível de glucose elevada no sentido da linha de base. Isto proporciona ao utilizador informação para caracterizar o animal como um normal de glicose e de controlo saudável nível de insulina, u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		Allegra X-15R	plasma: 4 ° C a 3.000 rpm por 10 min
Soro centrífugo			: 22 ° C a 3.000 rpm por 10 min
Thermo Scientific -86 ° C Freezer, Série Forma 88000	Modelo: 88500A
			entrega de esponjas de gaze I.V. D50
2 x 2	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	Usado seco, com 70% de álcool e solução de clorohex a 2%
ml tubos separadores de soro	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4	tubo de coleta de sangue para painel superquímico
K2EDTA, 2 ml	VWR	95057-239	tubos de coleta de sangue
Aprotinina, 100 mg	Sigma	A1153-100MG	tubo de coleta de sangue aditivo protease
22 G x 1" Cateteres	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	Cateter I.V.
Plugue de Injeção W/ Tampa	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	%50 porta de infusão de dextrose
Porus Tape, 1/2" x 10 yd	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	mantém a aderência de cateteres e hep. Fechaduras
Solução de clorexidina 2%	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	local do cateter de preparação
70% Etanol	VWR	71001-654
torniquete	Webster	07-8003432
torneira de 3 vias	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4	hep. bloqueio
37 "conjunto de extensão	Webster	07-8454200	hep. lock
Exel 50-60cc LL Seringas	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	Lavagem de solução salina heparinizada
250 ml saco 0.9% solução salina	Webster	07-8365593	lavagem
1.000 U Heparina, 10 ml	Webster	07-883-4916
Cetamina (Ketaset) 100  mg / ml	Fort Dodge	(AV encomendado)
Tiras de teste de glicose Precision Xtra 50 / bx	Abbott (American Diabetes Wholesale)	9381599728K7	teste de linha de base / níveis de glicose no sangue
T3 Masimo Rad 57	DRE	6052057V	oxímetro de pulso
Pavia termômetro retal	Patterson	07-8391335
Precision Xtra Glucometer	Abbott	9381599728K7	Glicosímetro portátil