Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas ^1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para muitos patogénios intracelulares, e uma série de proteínas efectoras que modulam a apoptose foram identificadas ^2-9. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da actividade permanece indeterminada em muitos casos.

A apoptose, uma forma de morte celular programada, desempenha um papel importante nas respostas imunitárias à infecção ^{de 10.} Duas vias principais que conduzem à apoptose têmforam identificados: alvo as mitocôndrias (apoptose intrínseca) ou transdução directa do sinal via receptores de morte celular na membrana plasmática (apoptose extrínseca). A via intrínseca ou mediada por mitocôndrias morte celular é desencadeada por sinais intracelulares e envolve a activação do Bax e Bak, dois membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Esta família está composta por proteínas reguladoras pro- e anti-apoptóticas que controlam a morte celular ^11-14. A activação da apoptose conduz a oligomerização de Bax e Bak, seguido por subsequente permeabilização da membrana mitocondrial externa, resultando na libertação do citocromo C para o citoplasma. Liberação do citocromo C inicia a ativação das caspases efetoras 3 e 7 a ativação de caspase 9 no apoptossomo ^15. Isto leva à proteólise de substratos seleccionados que, entre outros, resulta na exposição de fosfatidilserina à superfície da célula ¹⁶ e liberta um ADNase dedicado que fragmenta chromatin ^17,18.

A fim de determinar onde dentro da cascata apoptótica uma proteína efectora indivíduo interfere, um sistema de expressão indutível foi empregado ^19. Os sistemas de regulação para a expressão dos transgenes condicionais têm sido uma ferramenta inestimável na análise de função de uma proteína dentro da célula ou a sua importância para o tecido, órgão e desenvolvimento organismo, bem como durante a iniciação, progressão e manutenção de doença ^20-23. Tipicamente, sistemas de controlo indutíveis, tais como o sistema Tet ²⁴ empregue aqui, formar uma unidade de transcrição artificial (ver Figura 1). Um componente é um factor de transcrição manipulado artificialmente chamado tTA (dependente da tetraciclina activador da transcrição), formado através da fusão do repressor de transcrição bacteriana TetR ²⁵ a um domínio de proteína de mamífero que medeia a activação da transcrição ou silenciamento ^24,26. O segundo componente é um híbridopromotor, denominada TRE (elemento de resposta a tetraciclina), que consiste de um promotor mínimo eucariótica, contendo, pelo menos, uma caixa TATÁ e um local de iniciação da transcrição, juntou-se a repetições múltiplas do local de ligação de ADN cognato para TetR, tetO ^24,25. O terceiro componente é o ligando natural de TetR, tetraciclina ou um dos seus derivados, tais como anidrotetraciclina ou doxiciclina ^25. Após a adição do ligando para o meio de cultura, TetR perde a sua afinidade para tetO e dissocia-se do TRE. Como resultado, a transcrição do gene alvo é abolida. A expressão de transgenes pode, assim, ser rigorosamente controladas de forma tempo e dependente da dose tanto na cultura de células e em animais ^20,23,24. Com tTA, a expressão do transgene ocorre constitutivamente, excepto na presença de uma tetraciclina. Isto pode ser uma desvantagem no estudo de proteínas citotóxicas ou oncogénicas porque tetraciclina primeiro tem de ser removido do sistema, antes do transgene expression ocorre e os efeitos da proteína alvo na célula pode ser monitorado. Isto pode ser demorado e nem sempre é completa, especialmente em animais transgénicos ^27. Para resolver esta limitação, um mutante TetR com uma resposta inversa à presença de doxiciclina foi utilizado para gerar um novo factor de transcrição, rtTA (reverso tTA) ^28. Só se liga ao TRE e, concomitantemente, activa a transcrição na presença de doxiciclina. Leakiness residual do sistema, isto é., A expressão do transgene, na ausência de factor de transcrição TRE-ligado, originando quer (i) a partir de efeitos de posição a um sítio de integração genómico, (ii) a partir do próprio TRE ^29, ou (iii) a partir non espec�ico ligação de tTA / rtTA ^28, foi abordado através da introdução de um silenciador da transcrição adicional, denominado TTS (dependente da tetraciclina silenciador da transcrição) ³⁰ para o sistema. Ele forma uma rede dupla juntamente com o regulador rtTA (ver Figura 1).Na ausência de doxiciclina, TTS se liga ao TRE e ativamente encerra qualquer transcrição restante. Na presença de doxiciclina, dissocia-se do TTS TRE e rtTA se liga simultaneamente induzir a expressão do gene alvo. Esta camada adicional de severidade é muitas vezes necessário para expressar proteínas citotóxicas altamente activas ^31-34.

Usando este sistema de duplo-regulador rigidamente controlado, a cascata apoptótica pode ser iniciado com um passo definido, que permita a análise de se o dada proteína efectora pode interferir com a indução de apoptose. Este método não só pode ser utilizado para estudar a actividade anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas, mas também para a expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicos, ou para dissecar a interferência com outras vias de sinalização.

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse

1. Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose.
2. Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO _2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml para um novo frasco de cultura de células ² 75 centímetros e adicione 14 ml de mídia.
3. Analisar o número de células usando um hemocitômetro.
4. Semente células HEK293 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células por cavidade e incubar durante 24 horas.
5. Para a transfecção utilizar o protocolo fornecido pelo fabricante do reagente de transfecção. Transfectar células com pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CaeB usando o reagente de transfecção. Antes da utilização, aquecer a Reag transfecçãoent e os meios necessários para RT. Usar uma proporção de 3: 1 de reagente de transfecção de ADN.
   1. Em detalhe, pipeta 1,5 ul de reagente de transfecção directamente em 50 uL de meio DMEM isento de soro. Para a formação do complexo, pipetar 0,5 ug de ADN que codifica GFP ou GFP-CaeB à mistura contendo o reagente de transfecção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
   2. Transfectar as células por adição da mistura reaccional de uma forma gota a gota, e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 24 horas.
6. Adicionar 1 mg / mL de geneticina para selecção de clones GFP-positiva, a 37 ° C em 5% de CO _2.
7. Após 6 dias, isolar células individuais por citometria de fluxo de triagem numa placa de 96 poços e abrigando forma HEK293 sobrenadante numa proporção de 1: 1. Gerar HEK293 sobrenadante a partir de células confluentes cultivadas HEK293 que foram centrifugadas durante 15 min a 4966 x g.
8. No dia seguinte, substituir o meio de cultura com meio contendo 1,50; mg / mL de geneticina. Mudança de mídia uma vez por semana. Se as células formam uma monocamada confluente, transferi-los para uma placa de 24 poços. Sub-cultivar as células duas vezes por semana, numa proporção de 1: 5 em meios contendo 1,5 mg / mL de geneticina. Finalmente, analisar a percentagem de células positivas para GFP por análise de imunotransferência e citometria de fluxo.

2. Análise de linhas celulares estáveis ​​por análise de imunotransferência

1. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
2. Carregar cerca de 4 x 10 ⁴ culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
3. Blot proteínas para membranas de PVDF (diâmetro dos poros de 0.45 uM) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
4. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
5. Dilui-se 4 ul de anticorpo anti-GFP em 4 ml de TMF e incubar as membranas o / n a 4 ° C.
6. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
7. Incubar as membranas com 0,8 uL de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 4 ml de TMF.
8. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 2.6) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.

3. Analisar as células usando um citômetro de fluxo.

1. Ressuspender as células em PBS. Use células HEK293 como controle negativo para ajustar a frente scatter (FSC) e de dispersão lateral (SSC) de forma que as células estão em escala. Desenhe um portão em células vivas ao excluir dupletos celulares, agregados e restos celulares.
2. Ajuste o ganho tubo fotomultiplicador (PMT) para que as células não coradas estão na extrema esquerda do histograma do canal FL1 (488 nm laser de argônio).
3. Para analisar a intensidade de fluorescência de células HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB abrir o histograma do canal FL1 e adquirir 10.000 eventos na população fechado.
4. Analisar os dados usando FACS comerciais software de análise.

4. A transfecção da linha de células estável com o sistema de vector de expressão induzível

1. Semente células HEK293 que expressam estavelmente GFP ou GFP-CaeB numa placa de 12 poços a uma densidade de 1 x 10 ⁵ células / poço.
2. 19 horas após a semeadura, co-transfectar as células com plasmídeo regulador e plasmídeo resposta ou que codifica Bax ou caspase 3 activada.
   1. Co-transfectar as células HEK293 estáveiscom 100 ng de pWHE125-P plasmídeo regulador (Figura 2) e 100 ng dos plasmídeos de resposta pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ul de polietilenimina.
   2. Prepara-se o ADN e o reagente de transfecção de polietilenimina em cada 75 uL de meio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min à temperatura ambiente. Para a formação do complexo, incubar ambas as misturas em conjunto durante 15 minutos à TA.
3. Adicionar a polietilenimina / ADN solução gota a gota às células e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO _2.

5. Indução de Apoptose

1. 5 horas após a transfecção, induzir a expressão das proteínas pró-apoptóticas por adição de 1 ug / ml de doxiciclina ao meio de cultura. Incubar as células durante 18 h a 37 ° C em 5% de CO _2.

6. Análise da Célula Hospedeira A apoptose por análise de imunotransferência

1. Inspecione células antes da harvesting sob o microscópio de luz para verificar se há indução de morte celular. As células apoptóticas são detectáveis ​​pela presença de corpos apoptóticos que rodeiam a célula morrer.
2. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
3. Carregar cerca de 4 x 10 ⁴ culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
4. Proteínas Blot em membranas de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
5. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
6. Diluir 4 μl de anticorpo anti-clivada poli ADP-ribose-polimerase (PARP) em 4 ml de TMF e incubar O / N a 4 ° C.
7. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
8. Incubar as membranas com 0,8 rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase ul diluídas em 4 ml MPT.
9. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.
10. Remover anticorpos ligados por 30 minutos de incubação à temperatura ambiente com 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
11. Após três lavagens com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7), sondar as membranas com 4 ul de anticorpo anti-actina em 4 ml de TMF O / N a 4 ° C.
12. Depois de três passos de lavagem com MPT (como descrito em 6.7), incubar as membranas com 0,8 ul de hoOs anticorpos secundários conjugados com peroxidase rseradish diluído em 4 ml de TMF.
13. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7, e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar o equipamento padrão para o desenvolvimento do filme de visualizar as bandas de proteína.
    Nota: Todos os passos de incubação foram realizadas num agitador de placas durante o tempo e temperatura indicada.

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se todas as células expressam GFP ou GFP-CaeB. Portanto, as linhas celulares HEK293 transfectadas de forma estável foram também analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4B, mais de 90% das células em ambas as linhas celulares expressaram a GFP. Assim, estas linhas de células estáveis ​​pode ser usado para analisar a função de CaeB. No passo seguinte, a actividade anti-apoptótica de CaeB foi ensaiada por análise de imunotransferência utilizando um anticorpo contra a PARP clivada. A clivagem proteolítica da PARP nuclear inactiva a actividade de reparação de ADN e é um marcador típico da termiestágios finais da apoptose. A clivagem de PARP não é detectada em células HEK293-GFP ou células HEK293-GFP-CaeB, demonstrando que nem a expressão de GFP, nem de GFP-CaeB é tóxico para as células. No entanto, quando as células foram tratadas com estaurosporina, um potente indutor da apoptose intrínseca, a clivagem de PARP foi detectada (Figura 5). Importante, células HEK293-GFP-CaeB exibem clivagem de PARP reduzida, indicando a actividade anti-apoptótica do burnetii tipo IV proteína efectora sistema de secreção Coxiella CaeB 7.

Para analisar em que passo CaeB interfere na via apoptótica, o sistema Tet-On foi empregado. Em detalhe, as células HEK293-GFP ou HEK293-GFP-CaeB foram transfectadas com um plasmídeo regulador que expressam constitutivamente um repressor de configuração dupla controlado com doxiciclina / activador (Figura 2) e um plasmídeo que codifica PTRE resposta ou de comprimento total humano Bax ou a forma activada de caspase 3 humano, denominado revCasp 3 (A Figura 3). Este sistema é fortemente regulada, tal como demonstrado pela falta de PARP clivagem sob condições não-indução (Figura 6). A adição de doxiciclina para as células transfectadas resultou na expressão do Bax ou revCasp 3. Se CaeB interfere com a via de apoptose a jusante da Bax, em seguida, o sinal apoptótico gerado por expressão e activação subsequente de Bax deve ser bloqueada por expressão CaeB. De facto, células HEK293 que expressam estavelmente GFP-CaeB profundamente inibir a indução de apoptose por controlada doxiciclina-expressão do Bax, ao passo que as células HEK293-GFP exibida óbvio clivagem de PARP. Este resultado indica que a indução de apoptose a jusante CaeB blocos de activação Bax. Em seguida, foi analisado se CaeB pode interferir com a ativação de caspase 3 - um evento no final da via apoptótica. Células HEK293-GFP, bem como células HEK293-GFP-CaeB, clivagem exibem PARP (Figura 6), indicando que uma vez que a caspase efectora 3 é activated, CaeB não pode impedir a apoptose ocorra. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que actua entre CaeB Bax e caspase 3 activação.

Figura 1. Visão esquemática do sistema regulatório tetraciclina. O sistema Tet-On é composta de dois plasmídeos diferentes, os plasmídeos reguladores e de resposta. O plasmídeo regulador codifica a transsilencer Tet-responsiva (TTS; círculo preenchido) e do Tet-responsivo transactivator reversa (rtTA, círculo aberto). Ambas as proteínas são constitutivamente expressos sob o controlo do forte, constitutivo factor de alongamento 1-alfa promotor (P EF-1a). TTS e rtTA são factores de transcrição quiméricos consistindo de um domínio de regulação da transcrição eucariótica (silenciador ou activador, respectivamente) e um repressor da tetraciclina bacteriana (TetR). TetR medeia a ligação de ADN a sete tet (tetO) sequências no plasmídeo de resposta. TetO está localizado a montante do promotor indutível mínima de citomegalovírus (CMV P), formando em conjunto o elemento de Tet-responsivo (TRE). Em condições não indutoras de, TTS é obrigado a TRE evitar a expressão. Após a adição de doxiciclina (Dox, cheio de diamantes), rtTA interage com Dox levando a mudanças de conformação e ativação. Activado rtTA substitui TTS no plasmídeo resposta, permitindo a transcrição dos genes-alvo respectivo Bax e caspase 3, levando a indução de apoptose e morte celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Visão esquemática do plasmídeo pWHE125 regulamentar. Elementos essenciais para a propagação no CCBTeria, incluindo uma origem de replicação (ori pBR) e uma cassete de resistência a antibióticos contra ampicilina (Amp R), e para a expressão das Tet-transregulators, tais como o forte, constitutivo imediato promotor / potenciador precoce do citomegalovírus humano (P / E hCMV), um sítio de ligação do ribossoma interno da pólio-vírus (PV-IRES) e um poli-site a partir de vírus Simian 40 (SV40 poliA) são exibidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Visão esquemática do plasmídeo de resposta. Os elementos essenciais para a propagação em bactérias, incluindo uma origem de replicação (ori pBR) e uma cassete de resistência aos antibióticos (Amp R), e para a expressão indutível em eucariotas, tais como o transgene expressina cassete com o promotor Tet-dependente TREtight mínima (P TREtight), o gene de interesse humano Bax (hBax) e um local de poliA de vírus de símio 40 (SV40 poliA), estão representados. A cassete de expressão do transgene é em tandem flanqueada por repetições directas de duas cópias do frango HS4 sequência núcleo isolante (HS4 núcleo). Além disso, uma cassete de resistência G418 consistindo de um murino fosfoglicerato quinase 1 promotor (P mPGK), um gene de resistência à neomicina (G418 R) e um local de poliA humano timidina quinase (TK poliA) está presente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior este valor.

Figura 4. HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB estavelmente expressam proteínas fluorescentes verdes. (A) Os lisados ​​de células inteiras de células HEK293-GFP eCélulas HEK293-GFP-CaeB foram imunotransferidas para GFP para mostrar a expressão estável. (B) citometria de fluxo Representante (FACS) de HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB é mostrado para demonstrar a intensidade da expressão de GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Efeitos da expressão de GFP-CaeB na apoptose induzida por estaurosporina. HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB foram tratados com 4 uM estaurosporina durante 6 horas para induzir a apoptose intrínseca. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. PARP clivagem foi reduzida em células HEK293-GFP-CaeB em comparação com células HEK293-GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.

Figura 6. Uso do sistema de Teton para diminuir o ponto de ação da CaeB. (A) A apoptose foi induzida pela expressão do Bax em HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. Clivagem de PARP foi reduzida em células HEK293-GFP-CaeB em comparação com células HEK293-GFP. (B) A apoptose foi induzida por expressão de revCasp 3 em HEK293-GFP e células HEK293-GFP-CaeB. A apoptose foi analisada por análise de imunotransf erência de PARP clivada. PARP clivagem foi comparável em células HEK293-GFP-CaeB e HEK293-GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.