Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Summary

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Abstract

A técnica aqui apresentada permite analisar em que o passo a proteína alvo, ou, alternativamente, uma molécula pequena, interage com os componentes de uma via de sinalização. O método baseia-se, por um lado, sobre a expressão indutível de uma proteína específica para iniciar um evento de sinalização a um passo definido e predeterminado na cascata de sinalização seleccionado. Expressão concomitante, por outro lado, do gene de interesse, em seguida, permite que o investigador para avaliar se a actividade da proteína alvo expressa está localizada a montante ou a jusante do evento de sinalização iniciada, de acordo com a leitura da via de sinalização que é obtido. Aqui, a cascata apoptótica foi seleccionado como uma via de sinalização definido para demonstrar a funcionalidade do protocolo. As bactérias patogénicas, tais como, Coxiella burnetii translocar proteínas efectoras que interferem com a indução da morte da célula hospedeira na célula hospedeira para assegurar a sobrevivência na célula bacteriana e para promover a suadisseminação no organismo. A C. proteína efectora burnetii CaeB inibe eficazmente a morte da célula hospedeira após indução da apoptose com luz UV ou com estaurosporina. Para diminuir no qual o passo CaeB interfere com a propagação do sinal apoptótico, as proteínas seleccionadas com actividade pro-apoptótica bem caracterizados foram expressos transitoriamente em forma doxiciclina-indutível. Se CaeB actua a montante destas proteínas, apoptose irá continuar sem obstáculos. Se CaeB actua a jusante, a morte celular é inibida. As proteínas de ensaio seleccionados foram Bax, que actua ao nível das mitocôndrias, e caspase 3, que é a principal protease verdugo. CaeB interfere com a morte celular induzida por expressão da Bax, mas não por caspase 3 expressão. CaeB, assim, interage com a cascata apoptótica entre estas duas proteínas.

Introduction

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas ^1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para m....

Protocol

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse

1. Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose.
2. Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO _2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml para um novo frasco de cultura de células ² 75 centímetros e adicione 14 ml de mídia.
3. Analisar o número de células usando um hemocitômetro.
<....

Results

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se todas as célu.......

Discussion

Muitas bactérias patogénicas abrigar sistemas de secreção para segregar proteínas efectoras ou translocar bacterianas na célula hospedeira. Estas proteínas efectoras têm a capacidade de modular processos e vias na célula hospedeira, permitindo que as bactérias para sobreviver e replicar no respectivo nicho intracelular. Entender as atividades bioquímicas e os mecanismos moleculares das proteínas efetoras contribuirá para um melhor entendimento da patogenia e podem ajudar a desenvolver novas ferramentas terapêuticas para.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tecnologias de vida	DMEM	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
de vida	Pen/Strep	15140-122
OptiMEM	tecnologias de vida	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polietilenomina	Poliscienos	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Célula de Transferência Semi-Seca	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Escada de Proteína Prestained	Thermo Scientific	26616
Membrana	PVDFMillipore	IPVH00010
anti-GFP	tecnologias de vida	A6455
anti-clivado PARP	BD Bioscience	611038
anti-actina	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Buffer de Remoção de Western Blot Restore Plus	Thermo Scientific	46428