Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Summary

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Abstract

A técnica aqui apresentada permite analisar em que o passo a proteína alvo, ou, alternativamente, uma molécula pequena, interage com os componentes de uma via de sinalização. O método baseia-se, por um lado, sobre a expressão indutível de uma proteína específica para iniciar um evento de sinalização a um passo definido e predeterminado na cascata de sinalização seleccionado. Expressão concomitante, por outro lado, do gene de interesse, em seguida, permite que o investigador para avaliar se a actividade da proteína alvo expressa está localizada a montante ou a jusante do evento de sinalização iniciada, de acordo com a leitura da via de sinalização que é obtido. Aqui, a cascata apoptótica foi seleccionado como uma via de sinalização definido para demonstrar a funcionalidade do protocolo. As bactérias patogénicas, tais como, Coxiella burnetii translocar proteínas efectoras que interferem com a indução da morte da célula hospedeira na célula hospedeira para assegurar a sobrevivência na célula bacteriana e para promover a suadisseminação no organismo. A C. proteína efectora burnetii CaeB inibe eficazmente a morte da célula hospedeira após indução da apoptose com luz UV ou com estaurosporina. Para diminuir no qual o passo CaeB interfere com a propagação do sinal apoptótico, as proteínas seleccionadas com actividade pro-apoptótica bem caracterizados foram expressos transitoriamente em forma doxiciclina-indutível. Se CaeB actua a montante destas proteínas, apoptose irá continuar sem obstáculos. Se CaeB actua a jusante, a morte celular é inibida. As proteínas de ensaio seleccionados foram Bax, que actua ao nível das mitocôndrias, e caspase 3, que é a principal protease verdugo. CaeB interfere com a morte celular induzida por expressão da Bax, mas não por caspase 3 expressão. CaeB, assim, interage com a cascata apoptótica entre estas duas proteínas.

Introduction

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas ^1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para muitos patogénios intracelulares, e uma série de proteínas efectoras que modulam a apoptose foram identificadas ^2-9. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da actividade permanece indeterminada em muitos casos.

A apoptose, uma forma de morte celular programada, desempenha um papel importante nas respostas imunitárias à infecção ^{de 10.} Duas vias principais que conduzem à apoptose têmforam identificados: alvo as mitocôndrias (apoptose intrínseca) ou transdução directa do sinal via receptores de morte celular na membrana plasmática (apoptose extrínseca). A via intrínseca ou mediada por mitocôndrias morte celular é desencadeada por sinais intracelulares e envolve a activação do Bax e Bak, dois membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Esta família está composta por proteínas reguladoras pro- e anti-apoptóticas que controlam a morte celular ^11-14. A activação da apoptose conduz a oligomerização de Bax e Bak, seguido por subsequente permeabilização da membrana mitocondrial externa, resultando na libertação do citocromo C para o citoplasma. Liberação do citocromo C inicia a ativação das caspases efetoras 3 e 7 a ativação de caspase 9 no apoptossomo ^15. Isto leva à proteólise de substratos seleccionados que, entre outros, resulta na exposição de fosfatidilserina à superfície da célula ¹⁶ e liberta um ADNase dedicado que fragmenta chromatin ^17,18.

A fim de determinar onde dentro da cascata apoptótica uma proteína efectora indivíduo interfere, um sistema de expressão indutível foi empregado ^19. Os sistemas de regulação para a expressão dos transgenes condicionais têm sido uma ferramenta inestimável na análise de função de uma proteína dentro da célula ou a sua importância para o tecido, órgão e desenvolvimento organismo, bem como durante a iniciação, progressão e manutenção de doença ^20-23. Tipicamente, sistemas de controlo indutíveis, tais como o sistema Tet ²⁴ empregue aqui, formar uma unidade de transcrição artificial (ver Figura 1). Um componente é um factor de transcrição manipulado artificialmente chamado tTA (dependente da tetraciclina activador da transcrição), formado através da fusão do repressor de transcrição bacteriana TetR ²⁵ a um domínio de proteína de mamífero que medeia a activação da transcrição ou silenciamento ^24,26. O segundo componente é um híbridopromotor, denominada TRE (elemento de resposta a tetraciclina), que consiste de um promotor mínimo eucariótica, contendo, pelo menos, uma caixa TATÁ e um local de iniciação da transcrição, juntou-se a repetições múltiplas do local de ligação de ADN cognato para TetR, tetO ^24,25. O terceiro componente é o ligando natural de TetR, tetraciclina ou um dos seus derivados, tais como anidrotetraciclina ou doxiciclina ^25. Após a adição do ligando para o meio de cultura, TetR perde a sua afinidade para tetO e dissocia-se do TRE. Como resultado, a transcrição do gene alvo é abolida. A expressão de transgenes pode, assim, ser rigorosamente controladas de forma tempo e dependente da dose tanto na cultura de células e em animais ^20,23,24. Com tTA, a expressão do transgene ocorre constitutivamente, excepto na presença de uma tetraciclina. Isto pode ser uma desvantagem no estudo de proteínas citotóxicas ou oncogénicas porque tetraciclina primeiro tem de ser removido do sistema, antes do transgene expression ocorre e os efeitos da proteína alvo na célula pode ser monitorado. Isto pode ser demorado e nem sempre é completa, especialmente em animais transgénicos ^27. Para resolver esta limitação, um mutante TetR com uma resposta inversa à presença de doxiciclina foi utilizado para gerar um novo factor de transcrição, rtTA (reverso tTA) ^28. Só se liga ao TRE e, concomitantemente, activa a transcrição na presença de doxiciclina. Leakiness residual do sistema, isto é., A expressão do transgene, na ausência de factor de transcrição TRE-ligado, originando quer (i) a partir de efeitos de posição a um sítio de integração genómico, (ii) a partir do próprio TRE ^29, ou (iii) a partir non espec�ico ligação de tTA / rtTA ^28, foi abordado através da introdução de um silenciador da transcrição adicional, denominado TTS (dependente da tetraciclina silenciador da transcrição) ³⁰ para o sistema. Ele forma uma rede dupla juntamente com o regulador rtTA (ver Figura 1).Na ausência de doxiciclina, TTS se liga ao TRE e ativamente encerra qualquer transcrição restante. Na presença de doxiciclina, dissocia-se do TTS TRE e rtTA se liga simultaneamente induzir a expressão do gene alvo. Esta camada adicional de severidade é muitas vezes necessário para expressar proteínas citotóxicas altamente activas ^31-34.

Usando este sistema de duplo-regulador rigidamente controlado, a cascata apoptótica pode ser iniciado com um passo definido, que permita a análise de se o dada proteína efectora pode interferir com a indução de apoptose. Este método não só pode ser utilizado para estudar a actividade anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas, mas também para a expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicos, ou para dissecar a interferência com outras vias de sinalização.

Protocol

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse

1. Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose.
2. Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO _2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml para um novo frasco de cultura de células ² 75 centímetros e adicione 14 ml de mídia.
3. Analisar o número de células usando um hemocitômetro.
4. Semente células HEK293 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células por cavidade e incubar durante 24 horas.
5. Para a transfecção utilizar o protocolo fornecido pelo fabricante do reagente de transfecção. Transfectar células com pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CaeB usando o reagente de transfecção. Antes da utilização, aquecer a Reag transfecçãoent e os meios necessários para RT. Usar uma proporção de 3: 1 de reagente de transfecção de ADN.
   1. Em detalhe, pipeta 1,5 ul de reagente de transfecção directamente em 50 uL de meio DMEM isento de soro. Para a formação do complexo, pipetar 0,5 ug de ADN que codifica GFP ou GFP-CaeB à mistura contendo o reagente de transfecção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
   2. Transfectar as células por adição da mistura reaccional de uma forma gota a gota, e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 24 horas.
6. Adicionar 1 mg / mL de geneticina para selecção de clones GFP-positiva, a 37 ° C em 5% de CO _2.
7. Após 6 dias, isolar células individuais por citometria de fluxo de triagem numa placa de 96 poços e abrigando forma HEK293 sobrenadante numa proporção de 1: 1. Gerar HEK293 sobrenadante a partir de células confluentes cultivadas HEK293 que foram centrifugadas durante 15 min a 4966 x g.
8. No dia seguinte, substituir o meio de cultura com meio contendo 1,50; mg / mL de geneticina. Mudança de mídia uma vez por semana. Se as células formam uma monocamada confluente, transferi-los para uma placa de 24 poços. Sub-cultivar as células duas vezes por semana, numa proporção de 1: 5 em meios contendo 1,5 mg / mL de geneticina. Finalmente, analisar a percentagem de células positivas para GFP por análise de imunotransferência e citometria de fluxo.

2. Análise de linhas celulares estáveis ​​por análise de imunotransferência

1. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
2. Carregar cerca de 4 x 10 ⁴ culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
3. Blot proteínas para membranas de PVDF (diâmetro dos poros de 0.45 uM) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
4. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
5. Dilui-se 4 ul de anticorpo anti-GFP em 4 ml de TMF e incubar as membranas o / n a 4 ° C.
6. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
7. Incubar as membranas com 0,8 uL de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 4 ml de TMF.
8. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 2.6) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.

3. Analisar as células usando um citômetro de fluxo.

1. Ressuspender as células em PBS. Use células HEK293 como controle negativo para ajustar a frente scatter (FSC) e de dispersão lateral (SSC) de forma que as células estão em escala. Desenhe um portão em células vivas ao excluir dupletos celulares, agregados e restos celulares.
2. Ajuste o ganho tubo fotomultiplicador (PMT) para que as células não coradas estão na extrema esquerda do histograma do canal FL1 (488 nm laser de argônio).
3. Para analisar a intensidade de fluorescência de células HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB abrir o histograma do canal FL1 e adquirir 10.000 eventos na população fechado.
4. Analisar os dados usando FACS comerciais software de análise.

4. A transfecção da linha de células estável com o sistema de vector de expressão induzível

1. Semente células HEK293 que expressam estavelmente GFP ou GFP-CaeB numa placa de 12 poços a uma densidade de 1 x 10 ⁵ células / poço.
2. 19 horas após a semeadura, co-transfectar as células com plasmídeo regulador e plasmídeo resposta ou que codifica Bax ou caspase 3 activada.
   1. Co-transfectar as células HEK293 estáveiscom 100 ng de pWHE125-P plasmídeo regulador (Figura 2) e 100 ng dos plasmídeos de resposta pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ul de polietilenimina.
   2. Prepara-se o ADN e o reagente de transfecção de polietilenimina em cada 75 uL de meio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min à temperatura ambiente. Para a formação do complexo, incubar ambas as misturas em conjunto durante 15 minutos à TA.
3. Adicionar a polietilenimina / ADN solução gota a gota às células e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO _2.

5. Indução de Apoptose

1. 5 horas após a transfecção, induzir a expressão das proteínas pró-apoptóticas por adição de 1 ug / ml de doxiciclina ao meio de cultura. Incubar as células durante 18 h a 37 ° C em 5% de CO _2.

6. Análise da Célula Hospedeira A apoptose por análise de imunotransferência

1. Inspecione células antes da harvesting sob o microscópio de luz para verificar se há indução de morte celular. As células apoptóticas são detectáveis ​​pela presença de corpos apoptóticos que rodeiam a célula morrer.
2. Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C.
3. Carregar cerca de 4 x 10 ⁴ culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli.
4. Proteínas Blot em membranas de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca.
5. Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA.
6. Diluir 4 μl de anticorpo anti-clivada poli ADP-ribose-polimerase (PARP) em 4 ml de TMF e incubar O / N a 4 ° C.
7. Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%.
8. Incubar as membranas com 0,8 rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase ul diluídas em 4 ml MPT.
9. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína.
10. Remover anticorpos ligados por 30 minutos de incubação à temperatura ambiente com 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
11. Após três lavagens com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7), sondar as membranas com 4 ul de anticorpo anti-actina em 4 ml de TMF O / N a 4 ° C.
12. Depois de três passos de lavagem com MPT (como descrito em 6.7), incubar as membranas com 0,8 ul de hoOs anticorpos secundários conjugados com peroxidase rseradish diluído em 4 ml de TMF.
13. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7, e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar o equipamento padrão para o desenvolvimento do filme de visualizar as bandas de proteína.
    Nota: Todos os passos de incubação foram realizadas num agitador de placas durante o tempo e temperatura indicada.

Results

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se todas as célu...

Discussion

Muitas bactérias patogénicas abrigar sistemas de secreção para segregar proteínas efectoras ou translocar bacterianas na célula hospedeira. Estas proteínas efectoras têm a capacidade de modular processos e vias na célula hospedeira, permitindo que as bactérias para sobreviver e replicar no respectivo nicho intracelular. Entender as atividades bioquímicas e os mecanismos moleculares das proteínas efetoras contribuirá para um melhor entendimento da patogenia e podem ajudar a desenvolver novas ferramentas terapêuticas para...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tecnologias de vida	DMEM	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
de vida	Pen/Strep	15140-122
OptiMEM	tecnologias de vida	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polietilenomina	Poliscienos	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Célula de Transferência Semi-Seca	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Escada de Proteína Prestained	Thermo Scientific	26616
Membrana	PVDFMillipore	IPVH00010
anti-GFP	tecnologias de vida	A6455
anti-clivado PARP	BD Bioscience	611038
anti-actina	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Buffer de Remoção de Western Blot Restore Plus	Thermo Scientific	46428