Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a interferência de fatores de virulência bacteriana na sinalização intracelular. Isso é conseguido estabelecendo linhagens celulares estáveis, expressando a proteína de interesse Para estudar sua atividade no nível de células em massa como uma segunda etapa, é criado um sistema de vetor de expressão induzível, que permite ativar uma cascata de sinalização da célula hospedeira em uma etapa definida. Em seguida, será analisado se a proteína de interesse pode interferir na ativação da cascata de sinalização da célula hospedeira, a fim de estreitar o ponto de atividade da proteína de interesse, os resultados mostram que o fator de virulência de Burnett amarelo aconchegante KA B interfere na cascata apoptótica a jusante das costas e a montante da ativação da cascata três com base na análise de western blotting.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia infecciosa, como identificar a etapa chave em uma cascata de transdução de sinal na qual uma determinada proteína efetora bacteriana interfere. Isso não apenas nos ajudará a entender melhor como os microrganismos patogênicos manipulam seus hospedeiros, mas também como esses processos celulares básicos funcionam. Embora esse método possa fornecer informações sobre estratégias bacterianas para prevenir a morte celular por apoptose, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de transdução de sinal no campo de morte celular, como ons ou piroptose, ou também a redes de sinalização envolvidas na proliferação celular, regulação gênica ou reações do sistema imunológico.

Demonstrando este procedimento estará Stephanie Besler, uma estudante de pós-graduação do laboratório de Mann. Comece este procedimento semeando células HEK 2 93 expressando GFP ou GFP de forma estável, digamos B em um 12. Placa de poço a uma densidade de 100.000 células por poço.

Em seguida, prepare o reagente de transfecção média de DNA e polietileno separadamente em 75 microlitros de meio opt e incube por cinco minutos em temperatura ambiente para formação complexa. Incube as duas misturas juntas por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, adicione a solução de DNA de polietileno gota a gota às células e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Cinco horas após a transfecção induzem a expressão das proteínas pró-apoptóticas pela adição de um micrograma por mililitro de doxiciclina ao meio de cultura. Em seguida, incube as células por 18 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono sob o microscópio óptico. Inspecione as células quanto à indução de morte celular antes da colheita.

Examine as células apoptóticas induzidas, que são detectáveis pela presença de corpos apoptóticos. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células aderidas. Uma vez com PBS quente, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de amostra de dois x lamby.

Em seguida, aqueça por cinco minutos a 95 graus Celsius e, para uso posterior, armazene a 20 graus Celsius negativos depois. Depois disso, carregue seis microlitros de uma escada de proteína comercial como marcador de peso molecular. Em seguida, carregue aproximadamente 40.000 células por amostra em um gel de página de 12% SDS.

Execute os géis em um sistema de eletroforese em gel sob uma tensão constante de 180 volts por 45 a 60 minutos com um tampão de funcionamento de x laly. Depois, BLO as proteínas nas membranas de PVDF a uma voltagem constante de 16 volts por 60 minutos. Usando uma célula de transferência semi-seca trans blot SD, bloqueie as membranas em 10 mililitros de MPT por uma hora em temperatura ambiente.

Diluir sete microlitros de anticorpo PARP anticlivado em sete mililitros de MPT. Incube a membrana de PVDF com a solução de anticorpos durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a solução de anticorpos e realize três lavagens de 10 minutos com PBS 0,05%Tween 20, incube as membranas com 1,4 microlitros de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rabanete diluídos em sete mililitros de MPT por uma hora em temperatura ambiente após a incubação.

Lave as membranas três vezes com PBS 0,05%Tween 20, detecte a atividade da peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. E aplique equipamento padrão para revelação de filme para visualizar as bandas de proteína. Em seguida, remova os anticorpos ligados incubando as membranas com sete mililitros de tampão de remoção de western blot por 30 minutos em temperatura ambiente após três lavagens com PBS 0,05% Tween 20, sonde as membranas com quatro microlitros de anticorpo antiactina em quatro mililitros de MPT durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, execute três etapas de lavagem de 10 minutos nas membranas com aproximadamente 10 mililitros de PBS 0,05%Tween 20 e, em seguida, incube as membranas com 1,4 microlitros de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rabanete diluídos em sete mililitros de MPT Após uma hora de incubação em temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com PBS 0,05% Tween 20, detecte a atividade da peroxidase de rabanete com um kit comercial e aplique equipamento padrão para revelação de filme para visualizar proibições de proteínas. Neste experimento, lisados de células inteiras de células HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP sabem foram imunosanguíneos para GFP para mostrar expressão estável.

A análise representativa da citometria de fluxo das células HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP sabe mostra a intensidade da expressão de GFP. As células HEK 2 93 GFP e HEK 2 93 GFP sabem foram tratadas com quatro esporinas micromolares por seis horas para induzir apoptose intrínseca. A apoptose foi analisada por análise de immunoblot PARP clivado, na qual a clivagem de PARP diminuiu em células HK 2 9 3 GFP SA B em comparação com células HK 2 93 GFP.

O CB protege da apoptose induzida por bax, mas não da apoptose induzida por caspase três. Ao implementar este procedimento, é importante sondar o maior número possível de componentes da via de sinalização para ajudar a identificar a etapa de interação. Também é bom testar proteínas que são ativadas em seus estados fundamental e ativado para determinar se a proteína efetora escolhida interfere na própria via, ou melhor, na etapa de ativação após este procedimento.

Outros métodos, como knockdown, knockout yeast, dois híbridos, modificação pós-traducional ou ensaios de estabilidade proteolítica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: quais são os mecanismos moleculares exatos que esses efetores microbianos empregam para manipular a fisiologia normal da célula hospedeira? E como isso beneficia a sobrevivência e disseminação do patógeno