Name: Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a analisar a interferência de fatores de virulência bacteriana com vias de sinalização intracelular usando sistemas de expressão induzível em linhagens celulares estáveis.

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Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) por meio da Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) para A.L. e C.B., e por meio da3ª chamada ERA-NET PathoGenoMics para A.L.

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse <ol><li> Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose. </li><li> Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO 2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml para um novo frasco de cultura de células 2 75 centímetros e adicione 14 ml de mídia. </li><li> Analisar o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Semente células HEK293 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 5 células por cavidade e incubar durante 24 horas. </li><li> Para a transfecção utilizar o protocolo fornecido pelo fabricante do reagente de transfecção. Transfectar células com pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CaeB usando o reagente de transfecção. Antes da utilização, aquecer a Reag transfecçãoent e os meios necessários para RT. Usar uma proporção de 3: 1 de reagente de transfecção de ADN. <ol><li> Em detalhe, pipeta 1,5 ul de reagente de transfecção directamente em 50 uL de meio DMEM isento de soro. Para a formação do complexo, pipetar 0,5 ug de ADN que codifica GFP ou GFP-CaeB à mistura contendo o reagente de transfecção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Transfectar as células por adição da mistura reaccional de uma forma gota a gota, e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol></li><li> Adicionar 1 mg / mL de geneticina para selecção de clones GFP-positiva, a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Após 6 dias, isolar células individuais por citometria de fluxo de triagem numa placa de 96 poços e abrigando forma HEK293 sobrenadante numa proporção de 1: 1. Gerar HEK293 sobrenadante a partir de células confluentes cultivadas HEK293 que foram centrifugadas durante 15 min a 4966 x g. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio de cultura com meio contendo 1,50; mg / mL de geneticina. Mudança de mídia uma vez por semana. Se as células formam uma monocamada confluente, transferi-los para uma placa de 24 poços. Sub-cultivar as células duas vezes por semana, numa proporção de 1: 5 em meios contendo 1,5 mg / mL de geneticina. Finalmente, analisar a percentagem de células positivas para GFP por análise de imunotransferência e citometria de fluxo. </li></ol> 2. Análise de linhas celulares estáveis ​​por análise de imunotransferência <ol><li> Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C. </li><li> Carregar cerca de 4 x 10 4 culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli. </li><li> Blot proteínas para membranas de PVDF (diâmetro dos poros de 0.45 uM) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca. </li><li> Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA. </li><li> Dilui-se 4 ul de anticorpo anti-GFP em 4 ml de TMF e incubar as membranas o / n a 4 ° C. </li><li> Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%. </li><li> Incubar as membranas com 0,8 uL de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 4 ml de TMF. </li><li> Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 2.6) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína. </li></ol> 3. Analisar as células usando um citômetro de fluxo. <ol><li> Ressuspender as células em PBS. Use células HEK293 como controle negativo para ajustar a frente scatter (FSC) e de dispersão lateral (SSC) de forma que as células estão em escala. Desenhe um portão em células vivas ao excluir dupletos celulares, agregados e restos celulares. </li><li> Ajuste o ganho tubo fotomultiplicador (PMT) para que as células não coradas estão na extrema esquerda do histograma do canal FL1 (488 nm laser de argônio). </li><li> Para analisar a intensidade de fluorescência de células HEK293-GFP e HEK293-GFP-CaeB abrir o histograma do canal FL1 e adquirir 10.000 eventos na população fechado. </li><li> Analisar os dados usando FACS comerciais software de análise. </li></ol> 4. A transfecção da linha de células estável com o sistema de vector de expressão induzível <ol><li> Semente células HEK293 que expressam estavelmente GFP ou GFP-CaeB numa placa de 12 poços a uma densidade de 1 x 10 5 células / poço. </li><li> 19 horas após a semeadura, co-transfectar as células com plasmídeo regulador e plasmídeo resposta ou que codifica Bax ou caspase 3 activada. <ol><li> Co-transfectar as células HEK293 estáveiscom 100 ng de pWHE125-P plasmídeo regulador (Figura 2) e 100 ng dos plasmídeos de resposta pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figura 3) e 0,4 ul de polietilenimina. </li><li> Prepara-se o ADN e o reagente de transfecção de polietilenimina em cada 75 uL de meio Opti-MEM e incubar durante exactamente 5 min à temperatura ambiente. Para a formação do complexo, incubar ambas as misturas em conjunto durante 15 minutos à TA. </li></ol></li><li> Adicionar a polietilenimina / ADN solução gota a gota às células e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2. </li></ol> 5. Indução de Apoptose <ol><li> 5 horas após a transfecção, induzir a expressão das proteínas pró-apoptóticas por adição de 1 ug / ml de doxiciclina ao meio de cultura. Incubar as células durante 18 h a 37 ° C em 5% de CO 2. </li></ol> 6. Análise da Célula Hospedeira A apoptose por análise de imunotransferência <ol><li> Inspecione células antes da harvesting sob o microscópio de luz para verificar se há indução de morte celular. As células apoptóticas são detectáveis ​​pela presença de corpos apoptóticos que rodeiam a célula morrer. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar as células aderentes uma vez com PBS morno. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de amostra Laemmli 2x, o calor durante 5 minutos a 95 ° C e armazenar a -20 ° C. </li><li> Carregar cerca de 4 x 10 4 culas por amostra sobre um gel de 12% SDS-PAGE. Além disso, a carga de 6 ul de uma escada de proteínas comercial, tal como um marcador de peso molecular. Geles em um sistema de electroforese em gel de executar sob uma tensão constante de 180 V durante 45-60 min com tampão de corrida 1x Laemmli. </li><li> Proteínas Blot em membranas de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) a uma voltagem constante de 16 V durante 60 minutos utilizando um Trans-Blot SD célula de transferência semi-seca. </li><li> Membranas de bloco em 10 ml de leite seco sem gordura 5% em PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) durante 1 h à TA. </li><li> Diluir 4 μl de anticorpo anti-clivada poli ADP-ribose-polimerase (PARP) em 4 ml de TMF e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Realizar três etapas 10 min de lavagem com 10 ml de PBS / Tween 20 a 0,05%. </li><li> Incubar as membranas com 0,8 rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase ul diluídas em 4 ml MPT. </li><li> Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7) e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar equipamento padrão para o desenvolvimento de filme para visualizar as bandas de proteína. </li><li> Remover anticorpos ligados por 30 minutos de incubação à temperatura ambiente com 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Após três lavagens com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7), sondar as membranas com 4 ul de anticorpo anti-actina em 4 ml de TMF O / N a 4 ° C. </li><li> Depois de três passos de lavagem com MPT (como descrito em 6.7), incubar as membranas com 0,8 ul de hoOs anticorpos secundários conjugados com peroxidase rseradish diluído em 4 ml de TMF. </li><li> Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavar as membranas três vezes com PBS / 0,05% de Tween 20 (como descrito em 6.7, e detectar a actividade de peroxidase de rábano com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Aplicar o equipamento padrão para o desenvolvimento do filme de visualizar as bandas de proteína. Nota: Todos os passos de incubação foram realizadas num agitador de placas durante o tempo e temperatura indicada. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Muitas bactérias patogénicas abrigar sistemas de secreção para segregar proteínas efectoras ou translocar bacterianas na célula hospedeira. Estas proteínas efectoras têm a capacidade de modular processos e vias na célula hospedeira, permitindo que as bactérias para sobreviver e replicar no respectivo nicho intracelular. Entender as atividades bioquímicas e os mecanismos moleculares das proteínas efetoras contribuirá para um melhor entendimento da patogenia e podem ajudar a desenvolver novas ferramentas terapêuticas para...

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas 1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para muitos patogénios intracelulares, e uma série de proteínas efectoras que modulam a apoptose foram identificadas 2-9. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da actividade permanece indeterminada em muitos casos. A apoptose, uma forma de morte celular programada, desempenha um papel importante nas respostas imunitárias à infecção de 10. Duas vias principais que conduzem à apoptose têmforam identificados: alvo as mitocôndrias (apoptose intrínseca) ou transdução directa do sinal via receptores de morte celular na membrana plasmática (apoptose extrínseca). A via intrínseca ou mediada por mitocôndrias morte celular é desencadeada por sinais intracelulares e envolve a activação do Bax e Bak, dois membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Esta família está composta por proteínas reguladoras pro- e anti-apoptóticas que controlam a morte celular 11-14. A activação da apoptose conduz a oligomerização de Bax e Bak, seguido por subsequente permeabilização da membrana mitocondrial externa, resultando na libertação do citocromo C para o citoplasma. Liberação do citocromo C inicia a ativação das caspases efetoras 3 e 7 a ativação de caspase 9 no apoptossomo 15. Isto leva à proteólise de substratos seleccionados que, entre outros, resulta na exposição de fosfatidilserina à superfície da célula 16 e liberta um ADNase dedicado que fragmenta chromatin 17,18. A fim de determinar onde dentro da cascata apoptótica uma proteína efectora indivíduo interfere, um sistema de expressão indutível foi empregado 19. Os sistemas de regulação para a expressão dos transgenes condicionais têm sido uma ferramenta inestimável na análise de função de uma proteína dentro da célula ou a sua importância para o tecido, órgão e desenvolvimento organismo, bem como durante a iniciação, progressão e manutenção de doença 20-23. Tipicamente, sistemas de controlo indutíveis, tais como o sistema Tet 24 empregue aqui, formar uma unidade de transcrição artificial (ver Figura 1). Um componente é um factor de transcrição manipulado artificialmente chamado tTA (dependente da tetraciclina activador da transcrição), formado através da fusão do repressor de transcrição bacteriana TetR 25 a um domínio de proteína de mamífero que medeia a activação da transcrição ou silenciamento 24,26. O segundo componente é um híbridopromotor, denominada TRE (elemento de resposta a tetraciclina), que consiste de um promotor mínimo eucariótica, contendo, pelo menos, uma caixa TATÁ e um local de iniciação da transcrição, juntou-se a repetições múltiplas do local de ligação de ADN cognato para TetR, tetO 24,25. O terceiro componente é o ligando natural de TetR, tetraciclina ou um dos seus derivados, tais como anidrotetraciclina ou doxiciclina 25. Após a adição do ligando para o meio de cultura, TetR perde a sua afinidade para tetO e dissocia-se do TRE. Como resultado, a transcrição do gene alvo é abolida. A expressão de transgenes pode, assim, ser rigorosamente controladas de forma tempo e dependente da dose tanto na cultura de células e em animais 20,23,24. Com tTA, a expressão do transgene ocorre constitutivamente, excepto na presença de uma tetraciclina. Isto pode ser uma desvantagem no estudo de proteínas citotóxicas ou oncogénicas porque tetraciclina primeiro tem de ser removido do sistema, antes do transgene expression ocorre e os efeitos da proteína alvo na célula pode ser monitorado. Isto pode ser demorado e nem sempre é completa, especialmente em animais transgénicos 27. Para resolver esta limitação, um mutante TetR com uma resposta inversa à presença de doxiciclina foi utilizado para gerar um novo factor de transcrição, rtTA (reverso tTA) 28. Só se liga ao TRE e, concomitantemente, activa a transcrição na presença de doxiciclina. Leakiness residual do sistema, isto é., A expressão do transgene, na ausência de factor de transcrição TRE-ligado, originando quer (i) a partir de efeitos de posição a um sítio de integração genómico, (ii) a partir do próprio TRE 29, ou (iii) a partir non especï¿½ico ligação de tTA / rtTA 28, foi abordado através da introdução de um silenciador da transcrição adicional, denominado TTS (dependente da tetraciclina silenciador da transcrição) 30 para o sistema. Ele forma uma rede dupla juntamente com o regulador rtTA (ver Figura 1).Na ausência de doxiciclina, TTS se liga ao TRE e ativamente encerra qualquer transcrição restante. Na presença de doxiciclina, dissocia-se do TTS TRE e rtTA se liga simultaneamente induzir a expressão do gene alvo. Esta camada adicional de severidade é muitas vezes necessário para expressar proteínas citotóxicas altamente activas 31-34. Usando este sistema de duplo-regulador rigidamente controlado, a cascata apoptótica pode ser iniciado com um passo definido, que permita a análise de se o dada proteína efectora pode interferir com a indução de apoptose. Este método não só pode ser utilizado para estudar a actividade anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas, mas também para a expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicos, ou para dissecar a interferência com outras vias de sinalização.

<table><tbody><tr><td>Tecnologias de vida</td> <td>DMEM</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr>Tecnologias <td>de vida</td><td>Pen/Strep</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>tecnologias de vida</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenomina</td><td>Poliscienos</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula de Transferência Semi-Seca</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escada de Proteína Prestained</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFMillipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&nbsp;</td><td>tecnologias de vida</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-clivado PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Remoção de Western Blot Restore Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com sinalização intracelular

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

A técnica aqui apresentada permite analisar em que o passo a proteína alvo, ou, alternativamente, uma molécula pequena, interage com os componentes de uma via de sinalização. O método baseia-se, por um lado, sobre a expressão indutível de uma proteína específica para iniciar um evento de sinalização a um passo definido e predeterminado na cascata de sinalização seleccionado. Expressão concomitante, por outro lado, do gene de interesse, em seguida, permite que o investigador para avaliar se a actividade da proteína alvo expressa está localizada a montante ou a jusante do evento de sinalização iniciada, de acordo com a leitura da via de sinalização que é obtido. Aqui, a cascata apoptótica foi seleccionado como uma via de sinalização definido para demonstrar a funcionalidade do protocolo. As bactérias patogénicas, tais como, Coxiella burnetii translocar proteínas efectoras que interferem com a indução da morte da célula hospedeira na célula hospedeira para assegurar a sobrevivência na célula bacteriana e para promover a suadisseminação no organismo. A C. proteína efectora burnetii CaeB inibe eficazmente a morte da célula hospedeira após indução da apoptose com luz UV ou com estaurosporina. Para diminuir no qual o passo CaeB interfere com a propagação do sinal apoptótico, as proteínas seleccionadas com actividade pro-apoptótica bem caracterizados foram expressos transitoriamente em forma doxiciclina-indutível. Se CaeB actua a montante destas proteínas, apoptose irá continuar sem obstáculos. Se CaeB actua a jusante, a morte celular é inibida. As proteínas de ensaio seleccionados foram Bax, que actua ao nível das mitocôndrias, e caspase 3, que é a principal protease verdugo. CaeB interfere com a morte celular induzida por expressão da Bax, mas não por caspase 3 expressão. CaeB, assim, interage com a cascata apoptótica entre estas duas proteínas.

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se todas as célu...

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a interferência de fatores de virulência bacterianos na sinalização intracelular. Isso é alcançado por meio do estabelecimento de linhagens celulares estáveis, expressando a proteína de interesse, para estudar sua atividade no nível celular geral. Como segundo passo, é criado um sistema de vetor de expressão induzível, que permite ativar uma cascata de sinalização da célula hospedeira em uma etapa definida. Em seguida, será analisado se a proteína de interesse pode interferir na ativação da cascata de sinalização da célula hospedeira, a fim de delimitar o ponto de ação da proteína de interesse. Os resultados mostram que o fator de virulência *cozy yellow Burnett* KA B interfere com a cascata apoptótica a jusante de backs e a montante da ativação da cascata três, com base na análise por western blotting.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia infecciosa, como identificar a etapa crucial em uma cascata de transdução de sinal na qual uma determinada proteína efetora bacteriana interfere. Isso não apenas nos ajudará a compreender melhor como microrganismos patogênicos manipulam seus hospedeiros, mas também como esses processos celulares básicos funcionam. Embora este método possa fornecer informações sobre estratégias bacterianas para impedir a morte celular apoptótica, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de transdução de sinal no campo da morte celular, como oncos ou piroptose, ou ainda a redes de sinalização envolvidas na proliferação celular, regulação gênica ou respostas do sistema imunológico.Demonstrará este procedimento Stephanie Besler, aluna de pós-graduação do laboratório de Mann. Inicie este procedimento semeando células HEK 293 que expressam estavelmente GFP ou GFP, digamos B, em uma placa de 12 poços, numa densidade de 100.000 células por poço.Em seguida, prepare o DNA e o reagente de transfeção de polietileno separadamente em 75 microlitros de meio opt, e incube por cinco minutos à temperatura ambiente para formação do complexo. Incube ambas as misturas juntas por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, adicione a solução de DNA com polietileno gota a gota às células e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.Cinco horas após a transfeção, induza a expressão das proteínas pró-apoptóticas adicionando um micrograma por mililitro de doxiciclina ao meio de cultura. Em seguida, incube as células por 18 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono sob o microscópio óptico. Inspecione as células quanto à indução de morte celular antes da coleta.Examine as células apoptóticas induzidas, que são detectáveis pela presença de corpos apoptóticos. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células aderidas. Uma vez com PBS morno, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão amostral 2 x lamby.Em seguida, aqueça por cinco minutos a 95 graus Celsius e, para uso posterior, armazene a menos 20 graus Celsius posteriormente. Depois disso, carregue seis microlitros de um marcador de peso molecular (escada proteica comercial) como marcador de peso molecular. Em seguida, carregue aproximadamente 40.000 células por amostra em um gel de SDS-PAGE 12%.Execute os géis em um sistema de eletroforese em gel sob uma voltagem constante de 180 volts por 45 a 60 minutos com um x de tampão de corrida laly. Posteriormente, transfira as proteínas para membranas de PVDF sob voltagem constante de 16 volts por 60 minutos. Utilizando uma célula de transferência semisseca trans blot SD, bloquee as membranas em 10 mililitros de MPT por uma hora à temperatura ambiente.Dilua sete microlitros de anticorpo anti-PARP clivada em sete mililitros de MPT. Incube a membrana de PVDF com a solução de anticorpo durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a solução de anticorpo e realize três lavagens de 10 minutos com PBS 0,05% Tween 20. Incube as membranas com 1,4 microlitro de anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano-forrageiro diluídos em sete mililitros de MPT por uma hora à temperatura ambiente após a incubação.Lave as membranas três vezes com PBS 0,05% de Tween 20, detecte a atividade da peroxidase do rabanete picante com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. E utilize equipamento padrão para revelação de filme para visualizar as bandas proteicas. Em seguida, remova os anticorpos ligados incubando as membranas com sete mililitros de tampão de remoção para western blot por 30 minutos à temperatura ambiente após três lavagens com PBS 0,05% de Tween 20, e probe as membranas com quatro microlitros de anticorpo anti-actina em quatro mililitros de MPT durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, realize três etapas de lavagem de 10 minutos cada nas membranas com aproximadamente 10 mililitros de PBS 0,05% Tween 20, depois incube as membranas com 1,4 microlitros de anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano-forrageiro diluídos em sete mililitros de MPT por uma hora de incubação à temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com PBS 0,05% Tween 20, detecte a atividade da peroxidase de rábano-forrageiro com um kit comercial e utilize equipamento padrão para revelação de filme a fim de visualizar as bandas proteicas. Neste experimento, lisados celulares totais de células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe foram imunoblotados para GFP para demonstrar expressão estável.A análise representativa de citometria de fluxo de células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe mostra a intensidade da expressão de GFP. Células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe foram tratadas com quatro micromolar de esporina por seis horas para induzir apoptose intrínseca. A apoptose foi analisada por meio de análise imunoblot para PARP clivada, na qual observou-se uma diminuição da clivagem de PARP em células HK 293 GFP SA B em comparação com células HK 293 GFP.CB protege contra a apoptose induzida por bax, mas não contra a apoptose induzida por caspase três. Ao implementar este procedimento, é importante investigar tantos componentes da via de sinalização quanto possível, para ajudar a identificar a etapa de interação. Também é recomendável testar proteínas que são ativadas tanto em seus estados basal quanto ativado, para determinar se a proteína efetora escolhida interfere com a via em si ou, ao contrário, com a etapa de ativação subsequente a este procedimento.Outros métodos, como silenciamento gênico, eliminação por mutação nula, teste de duplo híbrido em levedura, co-imunoprecipitação, modificação pós-traducional ou ensaios de estabilidade proteolítica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como: quais são os mecanismos moleculares exatos que esses efetores microbianos utilizam para manipular a fisiologia normal das células hospedeiras? E como isso beneficia a sobrevivência e disseminação do patógeno.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Berens, C. et al. Aplicação de um sistema de expressão induzível para estudar a interferência dos fatores de virulência bacteriana com a sinalização intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão induzível para identificar onde a proteína efetora bacteriana CaeB interrompe a cascata apoptótica do hospedeiro. Ele descreve as etapas para transfectar células que expressam CaeB com um sistema responsivo à tetraciclina, a fim de induzir a expressão...

Transfecção de um sistema de expressão gênica induzível em células que expressam uma proteína efetora bacteriana

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Este vídeo descreve o método de regulação da expressão gênica em células cultivadas por transfecção com um plasmídeo contendo um gene de interesse e um plasmídeo regulador. A expressão deste plasmídeo pode ser controlada pela tetraciclina ou seus análogos sintéticos, tornando este sistema um modelo útil para estudar a expressão gênica regulável.

Sistema Regulado Tet-Off Induzível: Um Método In Vitro para Modular a Expressão Gênica em Células Cultivadas Usando o Sistema Tetraciclina-Off

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Aprenda a analisar a interferência de fatores de virulência bacteriana com vias de sinalização intracelular usando sistemas de expressão induzível em linhagens celulares estáveis.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

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