Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a interferência de fatores de virulência bacterianos na sinalização intracelular. Isso é alcançado por meio do estabelecimento de linhagens celulares estáveis, expressando a proteína de interesse, para estudar sua atividade no nível celular geral. Como segundo passo, é criado um sistema de vetor de expressão induzível, que permite ativar uma cascata de sinalização da célula hospedeira em uma etapa definida. Em seguida, será analisado se a proteína de interesse pode interferir na ativação da cascata de sinalização da célula hospedeira, a fim de delimitar o ponto de ação da proteína de interesse. Os resultados mostram que o fator de virulência *cozy yellow Burnett* KA B interfere com a cascata apoptótica a jusante de backs e a montante da ativação da cascata três, com base na análise por western blotting.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia infecciosa, como identificar a etapa crucial em uma cascata de transdução de sinal na qual uma determinada proteína efetora bacteriana interfere. Isso não apenas nos ajudará a compreender melhor como microrganismos patogênicos manipulam seus hospedeiros, mas também como esses processos celulares básicos funcionam. Embora este método possa fornecer informações sobre estratégias bacterianas para impedir a morte celular apoptótica, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de transdução de sinal no campo da morte celular, como oncos ou piroptose, ou ainda a redes de sinalização envolvidas na proliferação celular, regulação gênica ou respostas do sistema imunológico.

Demonstrará este procedimento Stephanie Besler, aluna de pós-graduação do laboratório de Mann. Inicie este procedimento semeando células HEK 293 que expressam estavelmente GFP ou GFP, digamos B, em uma placa de 12 poços, numa densidade de 100.000 células por poço.

Em seguida, prepare o DNA e o reagente de transfeção de polietileno separadamente em 75 microlitros de meio opt, e incube por cinco minutos à temperatura ambiente para formação do complexo. Incube ambas as misturas juntas por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, adicione a solução de DNA com polietileno gota a gota às células e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Cinco horas após a transfeção, induza a expressão das proteínas pró-apoptóticas adicionando um micrograma por mililitro de doxiciclina ao meio de cultura. Em seguida, incube as células por 18 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono sob o microscópio óptico. Inspecione as células quanto à indução de morte celular antes da coleta.

Examine as células apoptóticas induzidas, que são detectáveis pela presença de corpos apoptóticos. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células aderidas. Uma vez com PBS morno, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão amostral 2 x lamby.

Em seguida, aqueça por cinco minutos a 95 graus Celsius e, para uso posterior, armazene a menos 20 graus Celsius posteriormente. Depois disso, carregue seis microlitros de um marcador de peso molecular (escada proteica comercial) como marcador de peso molecular. Em seguida, carregue aproximadamente 40.000 células por amostra em um gel de SDS-PAGE 12%.

Execute os géis em um sistema de eletroforese em gel sob uma voltagem constante de 180 volts por 45 a 60 minutos com um x de tampão de corrida laly. Posteriormente, transfira as proteínas para membranas de PVDF sob voltagem constante de 16 volts por 60 minutos. Utilizando uma célula de transferência semisseca trans blot SD, bloquee as membranas em 10 mililitros de MPT por uma hora à temperatura ambiente.

Dilua sete microlitros de anticorpo anti-PARP clivada em sete mililitros de MPT. Incube a membrana de PVDF com a solução de anticorpo durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a solução de anticorpo e realize três lavagens de 10 minutos com PBS 0,05% Tween 20. Incube as membranas com 1,4 microlitro de anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano-forrageiro diluídos em sete mililitros de MPT por uma hora à temperatura ambiente após a incubação.

Lave as membranas três vezes com PBS 0,05% de Tween 20, detecte a atividade da peroxidase do rabanete picante com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. E utilize equipamento padrão para revelação de filme para visualizar as bandas proteicas. Em seguida, remova os anticorpos ligados incubando as membranas com sete mililitros de tampão de remoção para western blot por 30 minutos à temperatura ambiente após três lavagens com PBS 0,05% de Tween 20, e probe as membranas com quatro microlitros de anticorpo anti-actina em quatro mililitros de MPT durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, realize três etapas de lavagem de 10 minutos cada nas membranas com aproximadamente 10 mililitros de PBS 0,05% Tween 20, depois incube as membranas com 1,4 microlitros de anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano-forrageiro diluídos em sete mililitros de MPT por uma hora de incubação à temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com PBS 0,05% Tween 20, detecte a atividade da peroxidase de rábano-forrageiro com um kit comercial e utilize equipamento padrão para revelação de filme a fim de visualizar as bandas proteicas. Neste experimento, lisados celulares totais de células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe foram imunoblotados para GFP para demonstrar expressão estável.

A análise representativa de citometria de fluxo de células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe mostra a intensidade da expressão de GFP. Células HEK 293 GFP e HEK 293 GFP sabe foram tratadas com quatro micromolar de esporina por seis horas para induzir apoptose intrínseca. A apoptose foi analisada por meio de análise imunoblot para PARP clivada, na qual observou-se uma diminuição da clivagem de PARP em células HK 293 GFP SA B em comparação com células HK 293 GFP.

CB protege contra a apoptose induzida por bax, mas não contra a apoptose induzida por caspase três. Ao implementar este procedimento, é importante investigar tantos componentes da via de sinalização quanto possível, para ajudar a identificar a etapa de interação. Também é recomendável testar proteínas que são ativadas tanto em seus estados basal quanto ativado, para determinar se a proteína efetora escolhida interfere com a via em si ou, ao contrário, com a etapa de ativação subsequente a este procedimento.

Outros métodos, como silenciamento gênico, eliminação por mutação nula, teste de duplo híbrido em levedura, co-imunoprecipitação, modificação pós-traducional ou ensaios de estabilidade proteolítica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como: quais são os mecanismos moleculares exatos que esses efetores microbianos utilizam para manipular a fisiologia normal das células hospedeiras? E como isso beneficia a sobrevivência e disseminação do patógeno.