Method Article

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

DOI:

10.3791/52911

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos aqui um sistema de expressão de granzima econômico usando células HEK293T que produz altos rendimentos de protease pura, totalmente glicosilada e enzimaticamente ativa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quando os linfócitos T citotóxicos (CTL) ou células natural killer (NK) reconhecem células tumorais ou células infectadas com patógenos intracelulares, eles liberam seu conteúdo de grânulos citotóxicos para eliminar as células-alvo e o patógeno intracelular. A morte das células hospedeiras e patógenos intracelulares é desencadeada pelas proteases de serina do grânulo, granzimas (Gzms), entregues ao citosol da célula hospedeira pela proteína formadora de poros perforina (PFN) e em patógenos bacterianos pela granulisina proteica disruptora da membrana procariótica (GNLY). Para investigar os mecanismos moleculares de morte de células-alvo mediadas pelo Gzms em ambientes experimentais in vitro, são necessários sistemas de expressão e purificação de proteínas que produzam grandes quantidades de enzimas ativas. Os sistemas de expressão de proteínas secretadas em mamíferos implicam o potencial de produzir proteínas totalmente funcionais e dobradas corretamente que apresentam modificações pós-traducionais, como a glicosilação. Portanto, usamos um método de precipitação de cálcio econômico para transfecção transitória de células HEK293T com Gzms humano clonado no plasmídeo de expressão pHLsec. A purificação de Gzm do sobrenadante da cultura foi obtida por cromatografia de afinidade de níquel imobilizado usando a marca de poli-histidina C-terminal fornecida pelo vetor. A inserção de um sítio de enteroquinase no terminal N da proteína permitiu a geração de protease ativa que foi finalmente purificada por cromatografia de troca catiônica. O sistema foi testado produzindo altos níveis de Gzm A, B e M humanos citotóxicos e deve ser capaz de produzir praticamente todas as enzimas do corpo humano em altos rendimentos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os Gzms são uma família de serina-proteases altamente homólogas localizadas nos lisossomas especializados de CTL e as células NK 1. Os grânulos citotóxicos destas células assassinas, também contêm as proteínas de membrana de desregulação e PFN GNLY que são libertadas em simultâneo com as Gzms no reconhecimento de uma célula alvo destinado à eliminação 2,3. Existem cinco Gzms em seres humanos (GzmA, B, H, K e M), e 10 em ratos (Gzms GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB são os mais abundantes e extensivamente estudados em humanos e ratos 1. No entanto, estudos mais recentes começaram a investigar os percursos de morte celular, bem como os efeitos biológicos adicionais mediadas pelos outros, os chamados Gzms órfãos na saúde e na doença 4.

A função mais conhecida das Gzms, em particular de GzmA e GzmB, é a indução de morte celular programada em células de mamífero quando entregue nas células alvo por PFN 5,6. Porém, Estudos mais recentes também demonstraram efeitos extracelulares dos Gzms com profundo impacto sobre a regulação imune e inflamação, independentemente da entrega cytosolic pela PFN 7,8. O espectro de células que são mortos de forma eficiente após a entrada cytosolic dos Gzms também foi recentemente alargado a partir de células de mamíferos para 9,10 bactérias e até mesmo certos parasitas 11. Estas descobertas recentes abriu um novo campo para pesquisadores GZM. Portanto, um, de alto rendimento do sistema de expressão de mamífero custo-eficiente irá facilitar significativamente o caminho para esses estudos futuros.

Humanos, ratos e de camundongos Gzms nativas foram purificados com sucesso a partir da fracção de grânulos de CTL e células NK linhas 12-14. No entanto, nas nossas mãos o rendimento de tais técnicas de purificação está na gama de menos do que 0,1 mg / L de cultura de células (observação não publicada e 12). Além disso, a resolução cromatograf ica de um único GZM sem contaminação por outrr Gzms e / ou proteínas que também estão presentes nos grânulos é um desafio (dados não publicados) e 12,14. Gzms recombinantes foram produzidas em bactérias, leveduras 15 16 17, células de insecto e em ainda em células de mamífero, tais como células HEK 293 18,19. Apenas os sistemas de expressão de mamífero suportar o potencial para produzir enzimas recombinantes com modificações pós-tradução idêntica à proteína nativa citotóxico. Modificações pós-tradução têm sido implicados com a captação especifica por endocitose e a localização intracelular da protease dentro das células alvo 20-22. Portanto, usando pHLsec 23 (um presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, da Universidade de Oxford, Reino Unido) como a espinha dorsal do plasmídeo para a expressão GZM, foi estabelecido um sistema simples, tempo e custo-eficiente para a produção de proteínas de alto rendimento em HEK293T células. pHLsec combina um intensificador de CMV com um frango Β-actina promotor; juntos, esses elementos demonstrated a actividade do promotor mais forte em várias linhas de células 24. Além disso, o plasmídeo contém um intrão de coelho Β-globina, os sinais de secreção e de Kozak optimizada, um-6xHis-tag Lys e um sinal poli-A. As inserções podem ser convenientemente clonados entre o sinal de secreção e a-6xHis-tag Lys (Figura 1) assegurar a expressão óptima e eficiência de secreção para proteínas que não possuem domínios N-terminais adequados. Para a expressão das Gzms, que substituiu a sequência de sinal de secreção endógena com o sinal de secreção fornecida pelo vector, seguido por uma enteroquinase (EK) local (DDDDK), de modo que o tratamento EK activou a Gzms secretadas (Gzms activas começar com o N-terminal sequência de aminoácidos IIGG 25). Além disso, em favor deste método, as células HEK293T crescer rapidamente em baixa preço-médio, como meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e são adequados para o método de transfecção com fosfato de cálcio eficiente em termos de custo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produção do plasmídeo de expressão pHLsec-GZM

  1. Preparar ARN total a partir de células NK humanas (células primárias preparadas como no 26 ou a linha celular NK NK-92 expressando os cinco Gzms humanos) utilizando um método de isolamento de ARN adequada e transcrever reversa usando um kit de ADNc de primeira cadeia a sintetizar seguintes manufacturer` s recomendações. GZM amplificar ADNc utilizando PCR e o clone em pHLsec como descrito em 23 (presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, Universidade de Oxford, Reino Unido) utilizando os locais AgeI e KpnI (Figura 1).
    NOTA: Use os seguintes iniciadores indicados na Tabela 1.
  2. Confirme inserções corretas por sequenciação. Expandir os plasmídeos de expressão em células DH5a e purifica-se utilizando um kit de isolamento de plasmídeo isento de endotoxinas e seguir as instruções do fabricante.
  3. Ressuspender os plasmídeos purificados em meio isento de endotoxina, água estéril a uma concentração de 2 mg / ml e armazenar a -20 ° C until uso.

2. Expressão de Gzms em células HEK293T

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare meio de cultura padrão. Para Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glucose elevada (25 mM), de GlutaMax (4 mM), piruvato de sódio (1 mM), adicionar 10% de padrão de soro de vitelo fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 ug / mL).
    2. Prepare meio de transfecção. Para meio de cultura sem penicilina-estreptomicina adicionar 25 ug / ml de cloroquina (adicionar fresco no dia da transfecção de 1000X existências em PBS, armazenado a -20 ° C).
    3. Prepare meio de cultura isento de soro: para meio isento de soro para células HEK293 adicionar glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml), e 2,5 mg / L de anfotericina B.
    4. Preparar as soluções descritas na Tabela 2 e filtro com um filtro de 0,45 um antes da utilização:
  2. Expansão de células HEK293T
    1. Cultivar células HEK293T em 20 ml de cultoforma ure utilizando 150 x 25 mm pratos de cultura de tecidos.
    2. Dividir células a 80% de confluência (split-proporção de 1: 4, normalmente todos os dias 3ª). Células vagamente anexar, eles podem ser destacadas mecanicamente, sem tripsinização rigorosamente pipetando para cima e para baixo.
    3. Células da placa a noite antes da transfecção para dar 60-70% de confluência no dia da transfecção (densidade de sementeira de 2 x 10 ~ 5 células / mL). Um tamanho habitual de preparação consiste em 20 a 25 placas de cultura.
  3. Transfecção com fosfato de cálcio
    1. 1 h antes da transfecção, mudar o meio de cultura padrão de 20 ml de meio de transfecção. Perto do final deste passo de incubação 1 h, misturar 400 ug de ADN de plasmídeo com 10,95 ml DDH 2 0 e 1,55 ml de CaCl2 2M em tubos de 50 ml (um tubo / 5 pratos).
    2. 1-2 minutos antes da transfecção, adicionar 12,5 mL 2x HBS a 12,5 ml da solução de ADN-cálcio, misturar por inversão dos tubos e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente.
    3. Adicionar the mistura preparada em 2.3.2 directamente para as células (5 ml por placa), gota a gota para o meio. Polvilhe uniformemente sobre toda a área, transformando a forma de uma cor ligeiramente laranja.
    4. Incubar as placas de cultura de 7 a 11 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO 2 em ar humidificado). Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remover o meio de transfecção, lavar cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicionar 20 ml de meio de cultura isento de soro preparado em 2.1.3. Incubar durante 72 h numa incubadora de cultura de tecidos.
    5. Analisar a eficiência de transfecção e expressão executando uma amostra (~ 20 ul) do sobrenadante das células em SDS-PAGE e coloração com Azul Brilhante de Coomassie para visualizar uma banda granzima.
  4. A purificação do Gzms do sobrenadante de cultura por níquel-IMAC
    1. Após a incubação, decanta-se os sobrenadantes de cultura de células em tubos de 250 ml por centrifugação e clara. Realizar uma primeira rotação (400 xg, 10 min, 4 °C) que irá limpar o meio de células isoladas. Transferir o sobrenadante em tubos frescos e 250 ml de centrifugação a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para remover todos os restos de células remanescente.
    2. Adicionar 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 mL de 2 M de Tris-Base (pH 8) e 1 ml de 0,25 M de NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtra-se o sobrenadante utilizando uma unidade de filtro de vácuo de 500 ml (0,45 mm).
    3. Equilibrar a coluna de Níquel-His-IMAC, com tampão de ligação A (10 volumes de coluna, CV), utilizando um sistema de FPLC adequado.
    4. Aplicar o sobrenadante clarificado para a coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
    5. Depois o sobrenadante foi aplicado, lavagem da coluna com tampão A de ligação até que a absorvância de UV de linha de base é atingido (geralmente 10 CV).
    6. Eluir com uma Gzms linear 20 ml de gradiente (0 a 250 mM de imidazole), a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante a recolha de 2 ml-frações. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
  5. Enteroquinase (EK)tratamento e limpeza final por cromatografia de permuta catiónica
    1. Piscina GZM contendo frações em um tubo de diálise com ≤10 MWCO. Armazenar uma pequena amostra a -20 ° C como controlo pré-EK.
    2. Adicionar EK a 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente para a fracção combinada no tubo de diálise e diálise O / N (pelo menos 16 horas) à temperatura ambiente em tampão de EK-(4 L, tampão de mudança, uma vez).
    3. No dia seguinte, analisar EK Gzms tratados em comparação com o pré-EK controlo por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.
    4. Quando o processamento N-terminal está completa, a mudança de tampão de diálise S tampão A (4 L) e dializar durante mais 4 horas à temperatura ambiente. Filtrar dialisado (0,45 um).
    5. Equilibrar a coluna de S-S com tampão A. Colocar a amostra na coluna com a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C.
    6. Após o carregamento da amostra, lava-se a coluna com tampão A até S absorvância de UV de linha de base é atingido (cerca de 10 CV). Eluir os Gzms com um gradiente linear de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA ealaúdes em ~ 650 mM de NaCl, GzmB na ~ NaCl e GzmM mM 700 a ~ 750 mM de NaCl.
    7. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e ensaios colorimétricos (ver abaixo). Piscina fracções contendo Gzms e concentrado (cerca de 30 vezes, a uma concentração de cerca de 100 uM) em filtros de spin (15 ml, 10 MWCO). Alíquota os preparativos GZM concentrados e armazenar a -80 ° C.

3. Teste de atividade GZM

  1. Preparação de reagentes
    1. Preparar tampão de ensaio colorimétrico: 50 mM de base Tris, pH 7.
      1. Para a medição de GzmA, adicionar Na-CBZ-L-Lisina tiobenzilo éster (S-Bzl) (BLT) para o tampão de ensaio até uma concentração final de 0,2 mM e 5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) a uma concentração de 0,22 mM. Para GzmB, incluem 0,2 mM de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM de DTNB (DAA) e 0,22. Para GzmM, incluem 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Os péptidos sintéticos são adicionados a partir de soluções de reserva apropriadas (em DMSO, storEd a -20 ° C) para a memória intermédia de fresco antes do ensaio.
    2. Preparar tampão de ensaio de clivagem: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5
  2. Ensaios colorimétricos
    1. Distribuir pequenas amostras GZM (<5 ul) de fracções de eluição ou de estoque concentradas nos 96 poços de fundo plano de placas. Incluir um controlo positivo (GZM preparações testadas em bruto ou lisados ​​de células NK) e um controlo negativo (tampão apenas).
    2. Adicionar 100 ul de tampão de ensaio a cada poço (com uma pipeta multi-canal). Incubar durante 10 min a 37 ° C. Medir OD a 405 nm num leitor de microplacas.
  3. Ensaio de clivagem
    1. Para os ensaios de clivagem utilizando substratos purificados, co-incubação de um substrato proteico (nativo ou recombinante, 100-400 nM; alguns exemplos de substratos GZM eficientes são apresentados na secção de resultados e na nota no final desta secção) com diluições em série de um GZM (a partir de 400 nM) em tampão de ensaio para várias vezes.Analisar por SDS-PAGE e coloração com Coomassie ou prata; ou por western blotting utilizando anticorpos específicos.
    2. Para os ensaios de clivagem usando lisados ​​de células, suspender as células HeLa 10 6 (ou qualquer linha de células de tumor disponível) em 1 ml de tampão de ensaio e lise por congelação em uma / banho de gelo seco e etanol descongelação a 37 ° C três vezes. Remover os detritos celulares por centrifugação (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C).
    3. A co-incubação do ligado clarificado com Gzms a várias concentrações e tempos que anteriormente. A clivagem é detectada por imunotransf erência utilizando anticorpos apropriados.
      NOTA: Alguns exemplos de substratos de boa fé para a qual anticorpos comerciais estão disponíveis: Licitação (BH3-interagindo agonista morte de domínio) e caspase 3 clivada por GzmB 27,28; vários ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (hnRNPA1, A2 e U) clivada por GzmA 29; citomegalovírus phosphoprotein 71 por GzmM 30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na seção seguinte, vamos apresentar uma documentação completa de uma preparação GzmA para iluminar o método. Nós também purificado com sucesso GzmB e GzmM, produzindo resultados semelhantes em relação à eficiência e atividade purificação. No entanto, a partir dessas preparações posteriores só vamos mostrar algumas peças seleccionadas de dados. Preparações GzmB de células 293T seguintes actual protocolo foram utilizados em vários estudos publicados, com destaque para a sua actividade em vários sistemas de ensaio biológic...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O papel clássico e extensivamente estudada de GzmA e GzmB é a indução de apoptose em células de mamífero após a sua entrega por citosólico da proteína formadora de poros PFN 1. Recentemente, o espectro citotóxica dos Gzms foi alargado significativamente a partir de células de mamíferos para bactérias 9,10, bem como para certos parasitas 11. Além disso, as funções não clássicos, extracelulares de GzmA e GzmB, bem como a significância biológica dos vários Gzms órfãos ainda são obscuros. Po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Novartis para Pesquisa Médico-Biológica e do Research Pool da Universidade de Friburgo (para MW). Agradecemos a Li Zhao, Zhan Xu e Solange Kharoubi Hess pelo suporte técnico, bem como a Radu Aricescu e Yvonne Jones (Universidade de Oxford, Reino Unido) por fornecerem o plasmídeo pHLsec e a Thomas Schürpf (Harvard Medical School) pelas discussões úteis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
de isolamento de RNA totalreagente TRIzolInvitrogen15596-026
SuperScript II Transcriptase reversaInvitrogen18064-014
Phusion DNA polimerase de alta fidelidadeNEBM0530L
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
EX-CELL 293 Meio sem soro para células HEK 293Sigma14571C
DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX, piruvatoGibco31966-021
Tubo de Diálise SnakeSkin, 10K MWCOThermo Scientific68100
Enteroquinase do intestino bovinoSigmaE4906recombinante, ≥ 20  unidades/mg de proteína
HisTrap Excel 5 ml colunaGE Healthcare17-3712-06 Níquel IMAC
HiTrap SP HP coluna de 5 mlGE Healthcare17-1152-01 Coluna S
N-&alfa;-Cbz-L-lisina tiobenziléster (BLT)Substrato SigmaC3647GzmA
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgsubstrato GzmB
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (AAPL)Substrato BachemGzmM
5,5′-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB)Reagente de EllmanSigmaD8130
Kit do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
  2. Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
  3. Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
  4. Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
  5. Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
  6. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
  7. Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
  8. Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
  9. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
  10. Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  11. Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
  12. Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
  13. Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
  14. Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
  15. Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
  16. Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
  17. Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
  18. Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
  19. Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
  20. Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
  21. Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
  22. Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
  23. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  24. Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
  25. Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
  26. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  27. Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
  28. Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
  29. Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
  30. Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
  31. Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
  32. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
  33. Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
  34. Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
  35. Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
  36. Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).
  37. Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
  38. Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
  39. Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Granzyme ExpressionMammalian Cell TransfectionCalcium Phosphate MethodImmobilized Metal Affinity ChromatographyCation Exchange ChromatographyEnterokinase ActivationHEK293T CellsProtein PurificationEnzymatic Activity AssayGlycosylated Protease

Related Articles