Artigo de método

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

DOI:

10.3791/52919

⸱

12 de maio de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Resumo

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Indução da quinase extracelular regulado fosforilada (pERK) é uma leitura molecular confiável de ativação neuronal dependente de aprendizagem. Aqui, descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Especificamente, nós usamos immunostaining pERK para estudar a ativação neuronal seguinte labirinto aquático de Morris (MWM, uma tarefa clássica de aprendizagem dependente do hipocampo) em Engrailed-2 nocaute (EN2 - / -) ratos, um modelo de transtornos do espectro do autismo (ASD). Em comparação com o tipo selvagem (WT) controles, EN2 ​​- / - ratos mostraram déficits significativos de aprendizagem espacial na MWM. Após MWM, diferenças significativas no número de neurónios positivos pERK foram detectadas em subcampos do hipocampo específicas de EN2 - / - ratos, em comparação com animais WT. Assim, o nosso protocolo pode detectar diferenças de forma robustaneurônios pERK-positivos associados à deficiência de aprendizagem dependente do hipocampo em um modelo do rato da ASD. Mais geralmente, o nosso protocolo pode ser aplicado para estudar o perfil de activação neuronal no hipocampo em ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

Introdução

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Desordens do neurodesenvolvimento incluem um grupo de doenças, tais como a síndrome de Down, síndrome X frágil (SXF), síndrome de Rett, neurofibromatose, esclerose tuberosa e ASD, no qual o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC) é perturbado cedo durante largura e heterogénea o período pré-natal 1. Essas disfunções cerebrais de desenvolvimento podem causar profundas, efeitos ao longo da vida em função motora, linguagem, aprendizagem e processo de memória. Uma pletora de factores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento durante os últimos anos 2,3. Mesmo que os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo clínico permanecem desconhecidos, os resultados acima mencionados têm permitido o desenvolvimento de vários modelos de ratinho destes distúrbios. De aprendizagem e défices de memória foram identificadas em vários destes modelos de murganho tais como TSC1 +/-, +/- TSC2,Nf1 +/- e EN2 - / - ratos 2,4-7. Um desafio importante no domínio dos distúrbios do neurodesenvolvimento é a identificação de processos celulares e moleculares subjacentes aprendizagem e memória disfunção. Vias de sinalização activados seleccionados durante a aprendizagem ou a memória podem induzir a transcrição de genes específicos e, em última análise conduzir à síntese de novo da proteína. Genes imediatos-iniciais (IEGs) de activação e dependentes de proteína modificações sinápticas são rapidamente induzida nos neurônios do cérebro em resposta à atividade neuronal ea formação comportamental 8,9.

Déficits em vias de sinalização que envolvem neurofibromin têm sido associados com a aprendizagem prejudicada em desordens do desenvolvimento neurológico. Neurofibromina é o produto do gene NF1, cuja mutação faz com neurofibromatose de tipo 1, uma síndrome genética complexa, caracterizada por tumores no sistema nervoso, atraso comportamentais e motoras, cognitivas e DISAbilidades 10. Ratos heterozigotos para Nf1 eliminação restritas aos neurônios inibitórios mostrar déficits na fase inicial da potenciação de longa duração (LTP), bem como a aprendizagem espacial comprometida em MWM 5,11,12. Curiosamente, a deficiência Nf1 neste modelo de ratinho leva a uma sobre-activação de sinalização de Ras na interneurónios inibitórios durante a aprendizagem, resultando no aumento da fosforilação de ERK e, finalmente, em uma ampliação anormal de libertação de GABA de neurónios destes cinco.

Com base nestes resultados, a visualização da actividade neuronal após tarefas comportamentais representa uma forma de reconstruir circuitos específicos envolvidos em doenças do neurodesenvolvimento. O protocolo de imuno-histoquímica descrito aqui tem o objetivo de avaliar e quantificar os níveis de fosforilação ERK hipocampo seguintes MWM em um modelo de rato ASD com déficits cognitivos. MWM é amplamente utilizado para investigar a aprendizagem espacial dependente do hipocampo e memória em roedores 13,14 . Nós decidir usar ERK como leitura molecular de aprendizagem hipocampo-dependente tarefa, uma vez que ERK mostrou ter um papel essencial na aprendizagem e memória formação 15. Além disso, a via ERK é necessário para dependente da experiência plasticidade no córtex visual desenvolvimento 16. Finalmente, camundongos sem uma das duas isoformas (ERK ERK2) no show CNS marcado anomalias em comportamentos cognitivos, emocionais e sociais 17, indicando que a sinalização ERK pode desempenhar um papel crítico na patogênese de desordens do desenvolvimento neurológico, tais como ASD.

Nós usamos Engrailed 2 nocaute (EN2 - / -) camundongos como modelo de desordens do desenvolvimento neurológico. EN2 - / - ratos mostram características anatômicas e comportamentais "ASD-like", incluindo a perda de 18 interneurons cérebro anterior, redução da expressão de genes relacionados com o ASD 19, diminuição da sociabilidade e flexibilidade cognitiva prejudicada 6,7,20. Learni espacialng e defeitos de memória, como os detectados na MWM, são especialmente robusta em EN2 - / - ratos e 6,7 pode ser relevante para as deficiências cognitivas observadas em pacientes com TEA 21. Além disso, mostramos que a aprendizagem espacial prejudicada em MWM está associada à redução da expressão neurofibromin e aumentou os níveis de pERK no hilo de EN2 - / - ratos adultos 7. Aqui nós apresentamos o protocolo detalhado para a caracterização imuno-histoquímica de pERK seguinte MWM neste modelo de ratinho ASD.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a directiva comunitária 2010/63 / UE e foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano.

1. Cuidado Animal, Habitação e Tratamento

  1. Realizar todos os protocolos experimentais utilizando ratos de acordo com as diretrizes do respectivo cuidados com os animais institucional.
  2. Manter animais em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz com comida e água disponíveis ad libitum.
  3. Casa os ratos em grupos de 2-4, em gaiolas de policarbonato rato de tamanho padrão com serragem e material de cama trocada semanalmente.
  4. Utilize idade e ratos sexo correspondentes, porque a susceptibilidade à doença pode variar de acordo com idade e sexo em diferentes modelos de ratos com perturbações do desenvolvimento neurológico.
  5. Escolha um número adequado de animais para alcançar significância estatística (um mínimo de 10 ratos por genótipo para o estudo comportamental e 4 ratinhos por genótipo para o experimento imuno-histoquímica).

2. Morris Water Maze (MWM)

  1. Use um tanque circular (com diâmetro de 100 cm, altura de 50 cm).
    1. Coloque algumas pistas visuais sobre os divisores de quarto ao redor do tanque.
    2. Inserir uma plataforma de 10 cm de diâmetro dentro do tanque a um local fixo no centro de um dos quatro quadrantes imaginários. Mantenha a plataforma escondida no mesmo quadrante para todos os ensaios em todas as sessões de treinamento.
    3. Encher a piscina com água da torneira até que a plataforma é de 1 cm acima da superfície da água. Equilibrar a temperatura da água deve ser perto de 22 ° C; esta etapa pode levar várias horas. Adicionar água quente para reduzir o tempo necessário para equilibrar a temperatura da água.
    4. Adicionar cerca de 1,5-2 L de tinta branca, não-tóxico para tornar a água opaca.
  2. Rastrear Aquisição Procedimento
    1. Configure o sistema de rastreamento da MWM com câmeras CCD padrão e placas de vídeo. Escolha um sistema de vídeo-monitoramento para acompanhar e analisar diversas variáveis, tais como comprimento do caminho, escape latência eo tempo gasto em cada quadrante.
    2. Divida a arena em quatro quadrantes e ajustar as configurações de detecção para garantir melhores níveis de contraste entre os animais eo fundo para o acompanhamento ao vivo.
    3. Especificar a região de plataforma.
    4. Definir o tempo de teste máxima de 60 segundos.
  3. Testes MWM
    1. Antes dos testes de comportamento, permitir que os ratos um período de adaptação de 20-25 min em uma área onde eles não podem ver a piscina ou pistas espaciais.
    2. Treine cada rato durante 9 dias (duas tentativas consecutivas por dia, com 20-30 min intervalo entre elas).
    3. Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de monitoramento de vídeo.
    4. Tome o rato pela cauda e colocá-lo na água, com sua cabeça apontada para o lado da piscina, a partir de uma das quatro posições de início (norte, sul, leste e oeste). Para cada rato, a posição de partida deve ser diferente e pseudorandomized em todos os ensaios.
    5. Deixe o mergulho mouse e procurar o platfORM para um máximo de 60 seg. Uma vez que o animal atinge a plataforma, deixe-o ficar na plataforma por 20 s.
    6. Se o mouse não conseguiu localizar a plataforma dentro desse tempo, gentilmente orientar o mouse para a plataforma, segurando-o pelo rabo e deixá-lo ficar lá por 20 s. Uma vez que o animal tenha completado todos os dois ensaios, seque-o com uma toalha e colocá-lo de volta na gaiola.
    7. Cada dia do período de treinamento, repita o mesmo procedimento (passos 2.3.4-2.3.6).
    8. Realizar o teste sonda no dia 9 após a última trilha de treinamento.
    9. Remover a plataforma a partir da piscina.
    10. Deixe o mergulho mouse e procurar a plataforma para um máximo de 60 segundos.
    11. Periodicamente, verificar a temperatura da água de modo que deve ser a mesma (22 ° C) e limpar a piscina.

3. Preparação de secções de perfused Animais

  1. Sacrifício dos ratinhos no final da MWM. Quatro ratinhos de cada genótipo deve ser anestesiado antes da euthanizAlienação de acordo com as directrizes locais e internacionais.
  2. Perfundir o animal transcardialmente (cortado a direito auriclewith uma tesoura para permitir a hemorragia e introduzir uma cânula borboleta no ventrículo esquerdo para perfundir) com tampão fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 22 min.
  3. Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante pelo menos 12 h.
  4. Colocar os cérebros em tubos de 50 ml de poliestireno cónico contendo 15 ml de 0,02% de azida sódica em 0,1 M PBS e armazenar a 4 ° C até serem necessárias para o corte.
  5. Cortar e remover o cerebelo antes vibratome corte.
  6. Cole o cérebro na posição vertical com o local de corte, usando super cola, sobre a placa titular do vibratome.
  7. Corte o cérebro em 20-40 mm cortes coronais de espessura, a fim de série em toda hipocampo dorsal, em vibratome apropriado.
  8. Coletar fatias vibratome com um pincel e transferir para um 24 placa multi-poços contendo 1 ml de PBS 0,1 M para cada poço.
  9. Seções da loja para curto prazo em PBS ou a longo prazo em 0,02% de azida sódica em PBS a 4 ºC (tecido pode ser usado por até um ano).

4. A imuno-histoquímica

  1. 3-5 Transferência secções do hipocampo dorsal de cada rato, para placa de 24 multi-poços contendo 500 ul de PBS a 0,1 M para cada poço.
  2. Lavam-se as secções contidas em cada poço com 500 ul de PBS a 0,1 M (5 minutos, 3 vezes, com agitação suave).
  3. Extingue-se a actividade da peroxidase endógena, por incubação de secções em 1% de H 2 O 2 em PBS durante 20 min com agitação suave.
  4. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  5. Permeabilização de tecido: incubar secções durante 5 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS.
  6. Durante os passos acima (4.4; 4.5), fazer de tampão de bloqueio suficiente (10% soro de cabra e 0,1% de Triton-X100 em PBS) durante todo o experimento (númer de secções x 100 mL x 3 passos).
  7. Nota: O uso de soro a partir das mesmas espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita.
  8. Impedir a ligação não específica do anticorpo, por incubação de secções em tampão (100 ^ l / secção) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente (TA), com agitação suave.
  9. Incubar em secções Ab primário (pERK) diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C, com agitação suave.
  10. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  11. Incubar com o Ab secundário conjugado com biotina (1: 250) diluída em tampão de bloqueio (o mesmo que utilizado no passo 4.6) durante 1 hora à TA com agitação suave.
  12. Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo, porque avidina e biotina exigem, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente para o complexo.
  13. Preparar o volume necessário de reagente ABC acordo com o protocolo dos fabricantes.
  14. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  15. Incubatsecções e durante 45 min à TA com o reagente ABC.
  16. Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min).
  17. Prepare a solução de trabalho de DAB, DAB envolvendo cada passo deve ser feito no exaustor como DAB é cancerígeno e teratogênico.
  18. Transferir a solução DAB para uma nova placa com uma pipeta de transferência de plástico.
  19. Seções Coloque no prato contendo solução DAB e placa lentamente redemoinho trabalhando com a mão, para permitir o máximo de exposição seções.
  20. Monitorar reação DAB no microscópio até que o sinal adequado desenvolve (2-5 min).
  21. Pare a reacção com a intensidade de cor desejada por lavagem do tecido em PBS a 0,1 M (3 x 5 min).
  22. Use água sanitária para desativar qualquer solução restante substrato DAB no exaustor durante a noite e descartá-lo de acordo com as normas laboratoriais.
  23. Seções montar em gelatina revestidos por lâminas flutuantes em PBS. Em seguida, seque-os à temperatura ambiente pelo menos 3-4 horas.
  24. Desidratar o sequencialmente secções em 50%, 70%, 95%e etanol a 100% durante 2 min cada, e claro, a 100% de xileno durante 5 min.
  25. Lamela utilizando meio de montagem e deixe na coifa para secar durante a noite.

Contagem 5. celular

  1. Contagem de células pERK-positivos, 3-5 secções ao nível do hipocampo dorsal deve ser analisada por animal.
  2. Adquirir múltiplas imagens de campo brilhante de cada seção com uma ampliação de 200X usando um microscópio apropriado e, em seguida, montá-los usando um software de processamento de imagem.
  3. Realize contagens de células em imagens de mosaico convertido-tiff usando o ImageJ software livre.
  4. Contagem de células pERK-coradas na camada de células de grânulos hilo e sobre 2-3 contando caixas de 100 x 100 mm cada.
  5. As densidades celulares será expresso como o número de células marcadas por poço de contagem (100 x 100 mm).
  6. Realizar a análise estatística para avaliar diferença significativa entre os genótipos. Isto pode ser conseguido com t de Studentteste ou análise de variância seguida do teste post hoc apropriada usando softwares comerciais. Definir o nível de significância estatística de p <0,05.

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Resultados

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O protocolo aqui descrito foi concebido para visualizar, por imuno-histoquímica, a expressão de um marcador específico da actividade de neurónios do hipocampo após MWM num modelo de ratinho de desordens do neurodesenvolvimento. Todos os dados experimentais aqui apresentados foram obtidos a partir nossa recente trabalho 7. Foram utilizados obtidos a partir de cruzamentos heterozigotos; ninhada da mesma idade adultos (25-35 g de peso = 3-5 meses de idade) - Macho e fêmea WT e EN2 - /. Vint...

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Discussão

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Aqui, nós fornecemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK para revelar a ativação neuronal seguinte MWM em EN2 - / - ratos, um modelo de rato de desordens do desenvolvimento neurológico. Diminuição dos níveis de pERK foram detectadas no subcampo CA3 do EN2 - / - mutantes em comparação com WT. Diferentemente do que observado no subcampo CA3, um aumento geral de neurônios pERK-positivos em vez foi detectado em ambos hilo e GCL de EN2 - / - ratos em comparação com WT. Uma possível explic...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a equipe administrativa do CIBIO (Universidade de Trento) e Instituto de Neurociências CNR para obter assistência. Giovanni Provenzano é apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da Fundação Veronesi (Milão, Itália). Este trabalho foi financiado pelo Ministério italiano da Universidade e da Pesquisa (PRIN 2008 bolsa # 200894SYW2_002 e PRIN 2010-2011 concessão # 2010N8PBAA_002 para YB), Universidade de Trento (CIBIO start-up subvenção para YB) e Fundação Telethon (concessão # GGP13034 para YB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EthoVision XT 8Noldus TecnologiaEsta plataforma de software não é um requisito - existem muitos outros softwares comportamentais no mercado.
Tinta TêmperaGiotto - EmpresaBranco e líquido, não tóxico. Usado para preparar água opaca no labirinto de água Morris.
VibratomeLeicaVT1200Modelos equivalentes de outras empresas podem ser usados.
Placa de 24 poçosSigmaCLS3524
100% etanolFisher ScientificA406-20Usado para fazer gradiente de etanol para desidratação antes da montagem do slide.
XilenoVWR66004-950Tóxico - para ser utilizado sob o capô. Troque o xileno todos os meses, dependendo do uso.
Sigma de Azidade Sódio  S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100Sigma T-8787
Peróxido de HidrogênioSigmaH1009-100ML
Soro de Cabra NormalAbcamG9023-10ML
ABC kit Vectastain Vector LaboratoriesPK-6100Adicione em um volume de 5 ml de PBS 2 gotas de reagente A, misture e adicione 2 gotas de reagente B e misture.
VectorLaboratoriesSK-4100Incluir um volume de 5 ml de ddH2O: 2 gotas de solução de reserva tampão e misturar; 4 gotas de DAB e misturar; 2 gotas de H2O2 e homogeneizar.
[header]
pERK anticorpoTecnologias de Sinalização Celular 4370Diluição 1:500
Biotinilated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody VectorLaboratoriesBA-1000 Diluição 1:250
Slides SuperFrostCarl Roth1879
CoverslipsFisher12-548-B
DPXSigma317616Meio de montagem para slides. Pode ser usado meio de montagem equivalente.
Microscópio  Zeiss Axio Imager.M2Microscópio equivalente pode ser usado.
Adobe PhotoshopAdobe Systems, San Jose, CAPara montar imagens.
ImageJ SoftwareNational Institute of HealthSoftware gratuito pode ser baixado em http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (EUA)Softwares equivalentes para análise estatística podem ser usados.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, EUA)Softwares equivalentes para análise estatística podem ser usados.
da Informação do Grupo Fila

Referências

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