Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Resumo

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Resumo

Os neutrófilos, o mais abundante de todas as células brancas do sangue na circulação humana, desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores. Além disso, os neutrófilos desempenham um papel central na vigilância imunológica de células de tumor. Eles têm a capacidade de reconhecer as células tumorais e induzir a morte da célula do tumor quer através de um mecanismo dependente do contacto da célula que envolve peróxido de hidrogénio ou através de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Os neutrófilos com actividade anti-tumor pode ser isolado a partir de sangue periférico de doentes de cancro e de ratinhos portadores de tumor. Estes neutrófilos são denominados neutrófilos arrastado-tumorais (RTE) para distingui-los dos neutrófilos de indivíduos saudáveis ​​ou camundongos ingênuos que mostram nenhuma atividade citotóxica significativa tumor. Comparado com outras células brancas do sangue, os neutrófilos mostram flutuabilidade diferente tornando viável para obter a> 98% da população de neutrófilos puro quando submetido a um gradiente de densidade. No entanto, para alémpara a população de neutrófilos de alta densidade normal (HDN), em doentes com cancro, em ratinhos portadores de tumor, bem como em condições inflamatórias crónicas, as populações de neutrófilos baixa densidade distintas (LDN) aparecem na circulação. LDN co-purificar com a fracção de células mononucleares e pode ser separado a partir de células mononucleares usando tanto estratégias de selecção positiva ou negativa. Uma vez que a pureza dos neutrófilos isolados é determinada por citometria de fluxo, que pode ser utilizado in vitro e in vivo em ensaios funcionais. Nós descrevem técnicas para a monitorização da actividade anti-tumoral de neutrófilos, a sua capacidade para migrar e para a produção de espécies reactivas de oxigénio, bem como a monitorização da sua capacidade fagocítica ex vivo. Nós descrevemos mais técnicas para rotular os neutrófilos para rastreamento in vivo, e para determinar a sua capacidade anti-metastático in vivo. Todas estas técnicas são essenciais para a compreensão de como obter e caracterizar os neutrófilos com anti-tumoralfunção.

Introdução

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos ^1,2, que regula a hematopoiese ^{3, 4} angiogênese e cicatrização de feridas ^5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades ^6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucl....

Protocolo

Animais: 5-7 semanas de idade BALB / c ratos são comprados na Harlan (Israel). Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional da Universidade Hebraica (IACUC). Amostras humanas: Recolha de sangue de pacientes com câncer e voluntários saudáveis ​​foi aprovado pela Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Indução de neutrófilos com propriedades anti-tumorais in vivo utilizando um modelo de cancro da mama do rato.

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas utilizando soluções estéreis em um fluxo de ar laminar gabinete (LAF) B....

Resultados

Em um estudo recente, identificamos uma função anti-metastático para os neutrófilos ^6. Os neutrófilos de ratinhos portadores de tumores adquirem um fenótipo citotóxico e têm a capacidade de matar células tumorais ^6. Isto está em contraste com os neutrófilos a partir de ratinhos ingénuos que não têm efeito anti-tumoral significativa ^6. Várias das técnicas descritas na secção Protocolo têm sido utilizados para estudar a função dos neutrófilos anti-tumoral in vitro e in vivo ^6.......

Discussão

Os neutrófilos são a mais abundante de todas as células brancas do sangue e são os primeiros socorros em casos de infecção e inflamação. Como tal, eles são muito sensíveis a estímulos externos e são facilmente activado. Além disso, os neutrófilos tem uma meia-vida muito curta e um volume de negócios rápida. Juntas, essas características levantam várias dificuldades em trabalhar com neutrófilos, de tal forma que estratégias experimentais originais são necessários. Por exemplo, existem várias estratégias de purificação de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LINHAS CELULARES
Células de carcinoma de mama de camundongo 4T1	ADCC	CRL-2539 Meio de	crescimento: DMEM + 10% inativado por calor FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS Placa
	Estéril	Falcon	353047
100 mm	Corning	430167	Estéril
25 cm2 Frasco de Cultura de Tecidos	Nunc	156340	Estéril
90 mm Prato de Cultura de Grau Bacteriano	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Tubo de
Centrífuga Cônico Estéril de 15 ml	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Tubo de
Centrífuga Cônico Estéril de 50 ml	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Tubo de
Poliestireno de Fundo Redondo Falcon 12 x 75 mm Estéril	Becton Dickinson	352058	Placa de Migração Millicell Estéril
24 com um tamanho de poro de 5μ m	Merck Millipore	PSMT010R1
Placa de Poço de Fundo Plano Branco Estéril 96-Flat-Bottom	Costar	3917	Filtro de Células Estéreis
(40 mm)	BD Falcon	352340	Estéril
20G x 1.5" Agulha	BD Microlance 3	301300	Agulha Estéril
23G x 1"	BD Microlance 4	300800	Estéril
25G x 5/8" Agulha	BD Microlance 5	300600	Seringa Estéril
de 0,3 ml com Agulha de 30G x 8mm	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Clipes Estéreis
de 9 mm	BD, AutoClip	427631	Ímã EasySep Estéril
	18000		da STEMCELL Technologies
	Miltenyi Biotech	130-042-201	Ímã Separador MidiMACS Estéril
	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Lâmina de Vidro para Microscópio	Menzel-Glä ser Superfrost  Agitador Orbital Plus Thermo	J1800AMNZ
	Sky line, Leitor de Placas ELMI	S-3.02.10L
	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Albumina de soro bovino (BSA), fração V	Sigma	A7906
Bromodeoxiuridina (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Estéril
CFSE (5-(e 6-)-Carboxifluoresceína diacetato, éster succinimidílico)	Sondas Moleculares	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Sal de Heparina sódica da mucosa intestinal suína	Sigma	H3149
Azida sódica (NaN3)	Sigma	S8032	Altamente tóxico, manuseie com cuidado
Tioglicolato em pó	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MÍDIA E SUPLEMENTOS
Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® Reduzi o meio sérico	Life Technologies	31985062	Estéril
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 médio	Sigma	R8758	Soro bovino fetal estéril
(FBS), inativado por calor	Sigma	F9665	L-glutamina estéril
	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A
Piruvato de sódio	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Penicilina Estreptomicina
x 1000 solução	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5
salina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem Mg2+ e Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	PBS estéril
x 10 sem Ca2+ e Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Água de grau HPLC estéril
	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUÇÕES
ACK – Tecnologias de Vida de Cloreto de Amônio-Potássio		A10492-01
Solução de bromodeoxiuridina (BrdU) (10 mg/ml) em PBS			Dissolver 10 mg de BrdU em 1 ml de PBS e filtro estéril.
CFSE, 5 mM em DMSO			Dissolva 2,8 mg de CFSE em 1 ml de DMSO. Divida em alíquotas de 10 ml em tubos estéreis de 200 ml e guarde no escuro a -20oC.
Solução de eosina Y	Sigma	HT110-2-32
Solução salina balanceada de Hanks	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Heparina estéril
, 20 mg/ml em PBS			Dissolva 100 mg de heparina em 5 ml de PBS estéril e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Tampão de lise de cultura de células de luciferase x5	Promega	E153A	Diluir 1:5 em água estéril antes de usar.
Solução de ensaio de luciferase	Promega	E1501	Contém pó de substrato de ensaio de luciferase (E151A) e tampão de ensaio de luciferase (E152A)
Solução de hematoxilina de Mayer	Sigma	MHS-32
PBS + 0,5% BSA			Dissolva 2,5 g de BSA em 500 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.
PBS + 1% BSA			Dissolva 1g de BSA em 100 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.
5x PBS com 2,5% de BSA			Dissolva 12,5g de BSA em uma mistura de 250 ml de água estéril de grau HPLC e 250 ml de PBSx10 e filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
PBS contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA			Dissolva 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicione 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Tampão FACS (PBS contendo 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA e 0,02% de NaN3)			Dissolver 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicionar 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0 e 500 ml de 2% de NaN3, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Solução salina (0,9% de NaCl)			Dissolver 9 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
0,2% de solução			Dissolver 2 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
1,6% de solução			Dissolver 16 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
2% de azida de			Dissolver 1g de azida de sódio em 50 ml de ddw estéril, manter a 4oC. Altamente tóxico.
		de tioglicolato a 3%	Dissolva 3 g de pó de tioglicolato em 100 ml de ddw.                                                                             Ferva até que a solução fique amarela e autoclave.
Solução de azul de tripano (0,4%)	Sigma	T8154	Diluir 1:10 em PBS para obter uma solução de 0,04%.
Solução de tripsina B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Estéril
1 mg / ml Zymosan A			Ressuspenda 1 mg Zymosan A em 1 ml de PBS estéril em um tubo Eppendorf. Vortex vigorosamente e incubar o tubo a 37 oC por 30 min. Não autoclave. Prepare a solução recentemente antes de usar.
KITS
Kit de seleção EasySep PE	STEMCELL Technologies	18557
Coquetel de seleção EasySep PE	STEMCELL Technologies	18151
as nanopartículas magnéticas EasySep	da STEMCELL Technologies	18150
	Miltenyi Biotec	130-092-332
Kit de Enriquecimento de Neutrófilos de Camundongo EasySep	STEMCELL Technologies	19762
Kit de Enriquecimento de Neutrófilos Humanos EasySep	STEMCELL Technologies	19257
Kit de fluxo FITC BrdU	BD Pharmingen
Kit de isolamento de neutrófilos MACS	Miltenyi Biotec	130-097-658
Kit de ensaio de fagocitose	Cayman Chemical Company	500290
ANTICORPOS
Anticorpo bloqueador FcR	Biolegend	101302
Purificado anticorpo anti-Ly6G de rato	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
anticorpo Ly6G de rato conjugado com PE e anticorpo	Biolegend	127608	Clone 1A8
Anti-camundongo de rato conjugado com FITC Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rato anti-rato Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugado rato anti-camundongo Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
Rat conjugado com FITC rato anti-camundongo CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
Camundongo anti-camundongo conjugado com FITC Ly-6G e Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
Rato conjugado com PE anti-camundongo CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
Anti-camundongo de rato conjugado com FITC F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
camundongo conjugado com FITC anti-humano CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Anticorpo de controle de isotipo de rato purificado (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purificado anticorpo anti-rato CD3e para hamster armênio	BioLegend	100314	Clone 145-2C11

de Cultura de Tecidos de 24 poçosPlaca de Cultura de Tecidos Coluna de Separação MACS LS estéril Solução de NaCl de NaCl sódio Solução Kit MicroBead de mouse Anti-Ly6G 559619