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Artigo de método

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

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DOI:

10.3791/52933

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19 de junho de 2015

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1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

Neste artigo

Resumo

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Resumo

Os neutrófilos, o mais abundante de todas as células brancas do sangue na circulação humana, desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores. Além disso, os neutrófilos desempenham um papel central na vigilância imunológica de células de tumor. Eles têm a capacidade de reconhecer as células tumorais e induzir a morte da célula do tumor quer através de um mecanismo dependente do contacto da célula que envolve peróxido de hidrogénio ou através de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Os neutrófilos com actividade anti-tumor pode ser isolado a partir de sangue periférico de doentes de cancro e de ratinhos portadores de tumor. Estes neutrófilos são denominados neutrófilos arrastado-tumorais (RTE) para distingui-los dos neutrófilos de indivíduos saudáveis ​​ou camundongos ingênuos que mostram nenhuma atividade citotóxica significativa tumor. Comparado com outras células brancas do sangue, os neutrófilos mostram flutuabilidade diferente tornando viável para obter a> 98% da população de neutrófilos puro quando submetido a um gradiente de densidade. No entanto, para alémpara a população de neutrófilos de alta densidade normal (HDN), em doentes com cancro, em ratinhos portadores de tumor, bem como em condições inflamatórias crónicas, as populações de neutrófilos baixa densidade distintas (LDN) aparecem na circulação. LDN co-purificar com a fracção de células mononucleares e pode ser separado a partir de células mononucleares usando tanto estratégias de selecção positiva ou negativa. Uma vez que a pureza dos neutrófilos isolados é determinada por citometria de fluxo, que pode ser utilizado in vitro e in vivo em ensaios funcionais. Nós descrevem técnicas para a monitorização da actividade anti-tumoral de neutrófilos, a sua capacidade para migrar e para a produção de espécies reactivas de oxigénio, bem como a monitorização da sua capacidade fagocítica ex vivo. Nós descrevemos mais técnicas para rotular os neutrófilos para rastreamento in vivo, e para determinar a sua capacidade anti-metastático in vivo. Todas estas técnicas são essenciais para a compreensão de como obter e caracterizar os neutrófilos com anti-tumoralfunção.

Introdução

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos 1,2, que regula a hematopoiese 3, 4 angiogênese e cicatrização de feridas 5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades 6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucleares (PMN)) e contêm pelo menos três subclasses distintas de grânulos, bem como vesículas secretoras 8 (Figura 1A-C).

Os neutrófilos possuem elevada capacidade fagocítica e actividade da NADPH-oxidase alta crítica para a eliminação microbiana, e secretam uma vasta gama de quimiocinas importantes para atração de neutrófilos adicionais e outras células do sistema imunológico para o local da inflamação 8,9. Os neutrófilos são caracterizados pela expressão de uma grande quantidade de receptores da superfície, incluindo os receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectina do tipo C Receptores (CLRs), complementar do receptor 3 (CD11b / CD18) e outras moléculas de adesão (por exemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e carcinoembrionário molécula relacionada com antigénio-adesão celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimioquinas (por exemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), quimioatractivas receptores (por exemplo, PAFR, LTB4 R e C5aR) , receptores de citocinas (por exemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptídicos dos receptores (por exemplo, FPR1-3), e receptores de Fc (por exemplo, CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII), e CD64 (FcyRI) 10. Em ratinhos, os neutrófilos são geralmente identificados como CD11b + Ly6G +, enquanto que os neutrófilos humanos são identificadas utilizando os marcadores de leucócitos CD11b, CD15, CD16 e CD66b. É também geralmente aceite para corar para a mieloperoxidase proteínas dos grânulos (MPO) e elastase de neutrófilos (NE) para a detecção de neutrófilos em tecidos.

Ainda não é claro se as diversas funções dos neutrófilos são mediadas pela mesma célula ou por sub-populações de células distintas. Acumulando dados sugerem a presença de uma população heterogénea de neutrófilos que exibe um elevado grau de plasticidade afectado por estímulos pró-inflamatórios e o microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 ter grosseiramente divididos os neutrófilos no cancro em duas sub-populações principais denominado N1 com propriedades anti-tumorais e N2 com propriedades pró-tumorais. No cancro, bem como na inflamação crónica, há uma sub-população adicional constituído por células granulocíticas derivado supressoras mielóides (L-MDSCs) que suprimem as respostas de células T 14. L-MDSCs são consideradas ser células mielóides imaturas caracterizadas por uma CD11b + Ly6Cbaixo Ly6G fenótipo oi em camundongos 15, ao ter um CD15 + / CD16 baixo fenótipo em humanos 16. L-MDSCs expressar níveis mais elevados de arginase e mieloperoxidase, enquanto os níveis mais baixos de citocinas e quimiocinas que os neutrófilos circulantes normais. Eles são menos fagocíticas e migratório, mas produzem maiores níveis de ROS 15,17,18. No presente artigo vamos descrever algumas metodologias básicas para isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais.

Enquanto neutrófilos constituem a maior população de todas as células brancas do sangue na circulação humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / mL), em ratos, sob condições normais, que são bastante escassos (10 - 15%; 300-500 / ul ). A contagem de neutrófilos aumenta de forma constante sobre a inflamação e, ocasionalmente, no cancro, o que representa um estado de inflamação crônica 7. Os neutrófilos desenvolver a partir de precursor comum mielóide multipotentes (CMP) cells na medula óssea, por meio de um processo de diferenciação que passam as fases de mieloblastos (MB), promielócitos (PM), (MC) mielócitos, metamielócitos (mm) e as células de banda (BC) 8. Os neutrófilos maduros, pós-mitóticas podem permanecer dentro da medula óssea para 4-7 dias antes de serem liberados para a circulação 8. Volume de neutrófilos no sangue é geralmente rápida, com uma semi-vida média de 6-12 horas, que pode ser prolongado, sob condições inflamatórias. Neutrófilos não estimulados têm limitado actividade anti-tumorigénica, uma característica que pode ser adquirido por exposição dos neutrófilos sem tratamento prévio para as quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 6,19 ou artificialmente, expondo-as ao forbol de éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6.

A meia-vida curta de neutrófilos do sangue em conjunto com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) obtido a partir de 1 ml de sangue de um naïve 6-8 week rato velho, tornaramdifícil explorar a função de neutrófilos circulantes rato in vitro. Para superar esta dificuldade, outras fontes têm sido usadas. Por exemplo, um grande número de neutrófilos podem ser obtidas da medula óssea ou do peritoneu 20 após a indução da inflamação estéril (por exemplo, após injecção intraperitoneal de tioglicolato ou Zimosan A). Deve notar-se que os neutrófilos obtidos a partir da cavidade peritoneal não exercem qualquer actividade anti-tumorigénico (observação não publicada).

. Granot et al 6 observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o rato linha celular de carcinoma da mama 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava com a progressão do tumor 6 (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 - 4 semanas pós-inoculação do tumor. Estes neutrófilos ter adquirido as actividades anti-tumorais, e tem sido nesse sentido coineutrófilos NED arrastado-tumorais (RTE), a fim de distingui-los dos neutrófilos ingênuos 6 (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN, Figura 1A) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN, Figura 1B) geradas no contexto de cancro não são 21. Além disso, os neutrófilos de alta densidade a partir da medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm uma actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com quantidades crescentes de neutrófilos.

Deve-se notar que RT também são gerados em outros modelos de cancro, incluindo ambos os tumores mamários (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 e K-ras tumores pulmonares motrizes) espontâneos e injectado (AT-3 de ratinho (MMTV-PyMT) e carcinoma da mama E0771 células, LLC Lewis células de carcinoma de pulmão e células de melanoma B16-F10). No entanto, a extensão da mobilização de neutrófilos nestes tumou modelos é muito menos do que de ratos 4T1-inoculadas, atingindo 5-10 x 10 6 neutrófilos em 1 ml de sangue após 3 semanas.

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Protocolo

Animais: 5-7 semanas de idade BALB / c ratos são comprados na Harlan (Israel). Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional da Universidade Hebraica (IACUC). Amostras humanas: Recolha de sangue de pacientes com câncer e voluntários saudáveis ​​foi aprovado pela Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Indução de neutrófilos com propriedades anti-tumorais in vivo utilizando um modelo de cancro da mama do rato.

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas utilizando soluções estéreis em um fluxo de ar laminar gabinete (LAF) Bio-Segurança.

  1. Semente de 5 x 10 5 células 4T1 em 100 milímetros placa de cultura de tecido em 10 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de D- glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina. Incubar the as células a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 durante 3 a 4 dias. Assegurar que as pilhas são de 50 - 100% confluente no dia da experiência.
  2. Para retirar as células tumorais a partir da placa de cultura de tecido, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 5 ml de PBS, aspiração do PBS e adicionar 3 ml de uma solução de tripsina a 2,5 g / L. Incubar as células a 2-3 minutos com tripsina a 37 ° C.
  3. Adicionar 10 ml de meio contendo soro para neutralizar a tripsina e pipeta cima e para baixo até que todas as células foram removidas. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL cónico.
  4. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à TA. Aspirar o meio deixando 200 ul de meio acima do sedimento celular. Ressuspender as células no volume residual e adicionar 10 ml de PBS. Inverta o tubo 2-3 vezes para obter uma suspensão celular homogênea e retirar 10 ml para contar as células em um hemocitómetro. Use azul tripano para distinguir entre as células vivas e mortas.
  5. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 200 xg à temperatura ambiente. Aspirar o PBS e ressuspender as células em PBS a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Assegure-se que a suspensão de célula única não tem qualquer aglomeração.
  6. Injectam-se 1 x 10 6 células 4T1 4T1 ou células em 50 ul de PBS ortotopicamente na almofada de gordura mamaria inguinal esquerda de ratinhos fêmea BALB / c, utilizando uma seringa de 0,3 ml com uma agulha de 30G x 8 milímetros que expressam a luciferase.
    1. Antes da injecção, anestesiar os ratos em uma câmara de indução que recebem um caudal lento de isoflurano (3-5%) em 100% de oxigénio.
    2. Coloque o mouse sobre um bloco cirúrgico estéril e verifique se a cabeça está devidamente colocado no interior do cone do nariz isoflurano. Confirme anestesia adequada por beliscar a pata. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Raspar o cabelo em torno do local da injecção e desinfectar com etanol 70%.
    3. Use um conjunto estéril de instrumentos cirúrgicos para fazer uma pequena incisão horizontal (5 mm) aproxa meio caminho entre o madamente inguinal e os mamilos abdominais, expor a almofada de gordura e injectar 1 x 10 6 células 4T1 em 50 ul. Feche as incisões com clips nove milímetros que devem ser removidos uma semana depois. A injecção de células que expressam luciferase permite a monitorização do tamanho do tumor e metástases por imagem de bioluminescência.
      NOTA: Este procedimento minimamente invasivo não requer nenhum tratamento pós-cirúrgico e os camundongos injetados recuperar dentro de 2-3 min.
    4. Monitorar os ratos até que recupere a consciência, e certifique-se que recupere a consciência plena antes de ingressar na companhia de outros ratos.
  7. Depois de 3 - 4 semanas, quando o tumor primário tenha atingido um volume de 2 cm3, sacrificar os ratinhos por um lento fluxo de CO 2, e imediatamente após o último ar, obter o sangue por punção cardíaca, usando uma 25G x 5/8 "agulha ligada a uma seringa de tuberculina de 1 ml de pré-tratadas com heparina. Mantenha a boca da agulha para cima ao inserir oseringa na posição horizontal através do diafragma para o coração, e lentamente e gradualmente tirar o sangue evitando um excesso de pressão (Figura 3).

2. Neutrophil Isolamento

  1. Isolamento de neutrófilos citotóxicas a partir de sangue de ratinhos portadores de tumor.
    1. Dilui-se 1 ml de sangue retirado de um rato portador de tumor (ver Protocolo 1,11) em PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) a um volume final de 6 ml.
    2. Fracionamento de sangue diluído em um gradiente de sacarose descontínuo preparada na hora:
      1. Adicionar 3 ml de estéril-filtrada sacarose 1,119 g / ml a parte inferior de uma de 15 ml de polipropileno cónico do tubo de centrifugação.
      2. Devagar e com cuidado, a camada de 3 mL de estéril-filtrada sacarose 1,077 g / ml no topo do g / ml camada de 1.119. Em seguida, adiciona-se lentamente e com cuidado os 6 ml de sangue diluído (protocolo 2.1.1) na parte superior do 1,077 g / ml camada (Figura 4A). Recomenda-se para segurar o tubo inclinado e umdding os diferentes componentes através de um fluxo lento, mas contínuo, mantendo a boca da pipeta na direcção da parede inferior do tubo, de tal modo que não é formada turbulência.
    3. Centrifuga-se o tubo contendo o sangue diluído no gradiente de sacarose a 700 xg durante 30 min à TA sem travão.
    4. Cuidadosamente remover o tubo da centrífuga sem provocar qualquer turbulência. A maioria dos eritrócitos será na parte inferior do tubo. Neutrófilos de alta densidade (HDN) encontram-se como um anel branco-a-vermelho na interface entre a 1,119 g / ml e as camadas de 1,077 g / ml (cerca de 3 ml a marca), enquanto os leucócitos de baixa densidade são encontrados em um anel branco no interface entre a 1.077g / ml e a camada de BSA-PBS contendo (em torno da marca de 6 ml, ver Figura 4B).
    5. Aspirar o PBS + BSA a 0,5%, até atingir 5 mm acima da camada de células de baixa densidade. Pipeta as células de baixa densidade por sucção lenta numa ponta 1 ml através lentamente roda em torno das células.Transferir as células em 30 ml de PBS com 0,5% de BSA.
    6. Aspirar a camada superior do mesmo tubo de gradiente até atingir 5 mm acima da banda de células de alta densidade. Pipetar as células de alta densidade, que são principalmente os neutrófilos de alta densidade, e transferir as células em 30 ml de PBS contendo 0,5% de BSA.
    7. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    8. Aspirar o sobrenadante e lisar eritrócitos por ressuspensão das células em 36 ml de água de qualidade para HPLC estéril durante 30 segundos. A isotonicidade deverá ser restaurada através da adição de 9 ml de um concentrado 5x PBS suplementado com 2,5% (w / v) de BSA.
    9. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS-BSA. Contar o número de neutrófilos em um hemocitómetro e utilizar azul de tripano para distinguir entre células vivas e mortas.
    11. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente e ressuspender os neutrófilos no meio de incubação desejado para a densidade celular final. Usoos neutrófilos imediatamente.
    12. Então, depois de outra centrifugação, ressuspender as neutrófilos no meio de incubação a densidade celular final. Use os neutrófilos imediatamente.
  2. Isolamento de neutrófilos em circulação de pacientes com cancro.
    1. Misturar 10 ml de heparina (20 U / ml) de sangue humano com um volume igual de Dextrano T500 a 3% em solução salina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Durante esta incubação, os eritrócitos irá sedimentar.
    2. Preparar um tubo cónico de polipropileno de 50 ml com 10 ml de sacarose 1,077 g / ml e camada lentamente o sobrenadante rico em leucócitos no topo do 1,077 g / ml de camada de sacarose (Figura 4C).
    3. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente sem travão. Os neutrófilos de alta densidade (HDN) aparece no sedimento. Neutrófilos baixa densidade (LDN) co-purifica com monócitos e linfócitos na interface entre a 1,077 g / ml de camada de sacarose e de plasma (Figura 4D).
    4. Volte a suspender as neutrófilos em 10 ml 0.2% de NaCl durante 30 segundos para lisar os eritrócitos contaminantes, e restaurar a isotonicidade pela adição de 10 ml de 1,6% de NaCl e inverter uma vez.
    5. Centrifugar 5 min a 160 xg à temperatura ambiente, e lava-se três vezes em 20 ml de solução salina equilibrada de Hanks. Centrifugar após cada lavagem e aspirar o sobrenadante.
    6. Contagem de neutrófilos e ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 2% a 2 x 10 6 / ml neutrófilos ou como desejado.

3. O enriquecimento de sangue neutrófilos utilizando pérolas magnéticas

  1. A selecção positiva
    1. Tomar 1 ml de sangue a partir de um rato conforme descrito no protocolo de 1,8, com uma seringa heparinizada.
    2. Centrifuga-se o sangue num tubo de 15 ml a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Aspirar o sobrenadante ou manter o plasma do sangue para estudos posteriores.
    4. Lisar as eritrócitos por ressuspensão das células em 8 ml de água de grau HPLC. Após 30 seg restaurar isotonicidade, adicionando 2 ml de 5x concentrated PBS contendo 2,5% de BSA. Contar as células.
    5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de PBS contendo BSA a 0,5% e 2 mM de EDTA a 10 por 8 células.
    7. Adicionar 50 ul de anticorpo anti-Ly6G biotinilado. Misturar bem e incubar durante 10 min no refrigerador (não em gelo).
    8. Adicionar 150 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    9. Vortex a solução revestido anti-biotina estoque microbead magnético. Transferir 100 uL de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 15 min no refrigerador (não em gelo).
    10. Lave as células por adição de 10 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    11. Aspirar o sobrenadante completamente, e ressuspender em 500 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    12. Inserir uma coluna de separação magnética em um suporte magnético que está ligado a um suporte magnético, e lave-o com 500 mL PBS frio contendo 0.BSA a 5% e 2 mM de EDTA.
    13. Aplicar a suspensão de células na coluna. O flow-through contém células LyG6-negativo não marcados.
    14. Lava-se a coluna com 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. As células não marcadas adicionais estarão no fluxo de passagem.
    15. Repetir o passo de lavagem com mais 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    16. Remova a coluna do ímã e coloque-o em um tubo de coleta de 15 ml. Adicionar 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e lavar as células magneticamente marcadas por firmemente empurrando o êmbolo para dentro da coluna. O fluxo através contém neutrófilos Ly6G +.
  2. Selecção negativa
    1. Prepare leucócitos do sangue acordo com os passos 3.1.1 a 3.1.5.
    2. Ressuspender 1 x 10 8 células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, num tubo de fundo redondo de 5 ml de poliestireno.
    3. Adicionar 50 uL de soro normal de rato.
    4. Adicionar 50 ul de neutrófilos c enriquecimentoocktail (contendo anticorpos biotinilados específicos para as células brancas do sangue não de neutrófilos), misturar bem e incubar durante 15 min no microondas.
    5. Lavam-se as células pela adição de 4 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
    6. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    7. Adicionar 50 ul de complexos de anticorpos tetraméricos dirigidos contra biotina e dextrano. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
    8. Vortex bem o tubo contendo as esferas magnéticas revestidas com dextrano antes da adição de 150 ul de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
    9. Trazer a suspensão de células para um volume total de 2,5 ml por adição de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. Misture com cuidado para obter uma suspensão de células homogênea.
    10. Insira o tubo (sem a tampa) para dentro do ímã, e deixe repousar por 3 min.
    11. Inverter o ímã com o tubo em um contínuomovimento de tal modo que as células não ligadas no fluido vai ser transferido para um novo tubo. Deixe o ímã e tubo invertido para 2-3 sec, em seguida, retornar à posição vertical. As células indesejadas magneticamente marcadas permanecerá ligada à parede do tubo original, enquanto que os neutrófilos não ligadas será no líquido transferido.

4. citológica Coloração de neutrófilos

  1. Ressuspender 1x10 5 neutrófilos em 50 ul de PBS e transferir a suspensão de células a um adaptador de célula de preparação em camada fina, tal como um Cytospin. Centrifugar a placa a 150 xg durante 5 min. Separa-se a lâmina de vidro pré-marcado a partir do adaptador.
  2. Fix células mediante imersão das lâminas de vidro em etanol a 70% durante 2 minutos. Permitir que os preparativos do adaptador (veja o passo 4.1) para secar à temperatura ambiente antes da coloração. Mergulhar as lâminas 5-6 vezes em água destilada.
  3. Manchar 1-2 min em solução de hematoxilina de Mayer. Enxágüe 1 min em água da torneira. Manchar 10 seg em solução Eosina Y . Lavar em água da torneira. Desidratar por lavagem das lâminas em concentrações crescentes de etanol (70%, 96% e 100%). Deixe a lâminas de vidro ar seco em breve e inspecionar as lâminas com um microscópio de luz.
    NOTA: Hematoxilina tem uma cor e manchas azul-violeta profundo ácidos nucleicos, enquanto eosina é rosa e manchas proteínas não especificamente. Os grânulos citoplasmáticos de neutrófilos permanecem sem mácula por corantes ácidas ou básicas, que é a origem do nome "amar ser neutro '. Considerando basophilic granulócitos mancha azul escuro com hematoxilina e eosina e eosinophilc granulócitos vermelho brilhante, neutrófilos aparecem rosa neutro (ver Figura 1A). Neutrófilos maduros são caracterizados por um núcleo polimorfonucleares, que é, em geral, grandes, com 2-5 lóbulos neutrófilos segmentados '' (Figura 1A e 1C). Neutrófilos imaturos são caracterizados por um núcleo ou curvada em forma de anel uma lóbulos (Figura 1B).
ve_title "> 5. Determinação da pureza dos neutrófilos por citometria de fluxo.

  1. Ressuspender 1x10 6 células em 100 ul de tampão FACS (PBS contendo BSA a 0,5%, EDTA a 2 mM e 0,02% de NaN3). Para amostras de sangue total, a hemólise é necessário antes da coloração (passos 3.1.1 a 3.1.5). Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR durante 5 min.
  2. Adicionar 0,5 ug de anticorpo fluorescente marcado com especificidade para Ly-6G para neutrófilos de rato ou de CD11b e CD66b para os neutrófilos humanos, misturar bem e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Ajustar o volume para 500 mL com PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM e analisar a coloração por citometria de fluxo.

6. Siga os neutrófilos Gate in vivo

  1. Na rotulagem BrdU vivo de neutrófilos
    1. Injectar 100 ul de uma solução a 10 mg / ml de bromodesoxiuridina (BrdU) em PBS estéril por via intraperitoneal a ratinhos portadores de tumor.
    2. Isolar neutrófilos no sangue 48 horas após a injecção de umegundo Protocol 2.1. Neutrófilos utilizando um kit de mancha fluxo BrdU marcado com BrdU.
  2. CFSE rotulagem de neutrófilos
    1. Ressuspender 10 7 neutrófilos em 1 mL de PBS pré-aquecido.
    2. Adicionar 2 mL de uma solução estoque 5 mM CFSE para os neutrófilos suspensos a uma concentração final de 10 uM. Misturar bem e incubar durante 15 min a 37 ° C. CFSE 5 mM é preparada por dissolução de 2,8 mg de CFSE (5- (e 6 -) - carboxifluoresceína diacetato, éster de succinimidilo) em 1 ml de DMSO. Divida em 10 mL alíquotas em tubos estéreis e 200 ul loja no escuro a -20 ° C.
    3. Neutralizar o excesso de CFSE por adição de um volume igual de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C. Centrifugar os neutrófilos a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os neutrófilos duas vezes em 10 ml de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS.
    4. Centrifugar a 400 xg durante 10 min e ressuspender em um volume apropriado de PBS. Os neutrófilos (por exemplo, 1 x 10 7 Células) pode agora ser injectado por via intravenosa ou por via de injecção cardíaca de ratinhos receptores.

7. In vitro ensaio de luciferase para monitorar a atividade anti-tumoral de Isolado neutrófilos.

  1. Cultivar as células tumorais marcadas com luciferase como descrito para as células 4T1 em Protocolo 1,1-1,5, mas ressuspender as células dissociadas com tripsina em meio de soro reduzido optimizado suplementado com 2% de FBS. Ajustar a densidade de células de 5 x 10 4 culas por ml.
  2. Semente 5000 células tumorais marcadas com luciferase em 100? L de meio de soro reduzido optimizado contendo FBS a 0,5% em cada cavidade de um branco de fundo plano de 96 de cultura de tecidos bem placa.
  3. 4 horas depois de semear as células tumorais, adicionar 1 x 10 5 neutrófilos em 50 ul de meio de soro reduzido optimizadas contendo 0,5% de FBS, e incubar O / N. Prepara-se uma suspensão de células de neutrófilos, com uma densidade de 2 x 10 6 células / ml. Os poços de controlo deve obter 50 � de meio sem neutrófilos. Fazmúltiplas repetições de cada configuração experimental.
  4. Na manhã seguinte, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lava-se cada poço com 200 ul de PBS. Aspirar o PBS e adicionar 50 ul de tampão de lise passivo. Para as células facilmente destacando (tais como AT-3 células), não lavar em PBS e adicionar o tampão de lise de cultura celular imediatamente após a aspiração do meio de crescimento.
  5. Cobrir a placa com folha de alumínio e incuba-se que num agitador orbital a 150 rpm durante 20 min à temperatura ambiente.
  6. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Injectar bem-wise 50 ul solução de ensaio de luciferase, e leia a quimiluminescência de 10 segundos por poço.
  7. Calcula-se a lise do tumor% pela seguinte fórmula:% de lise do tumor = (1- [luminescência das amostras com neutrófilos] / [luminescência das amostras em forma]) x 100%.

NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para depl eficazEtion administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

Atividade 8. Anti-metastático de neutrófilos em um cancro da mama Modelo rato.

  1. A depleção in vivo de neutrófilos.
    1. Recentemente preparar 12,5 ug de anticorpo anti-rato Ly6G (neutrófilos anticorpo esgotar) ou de anticorpo de rato de controlo de isotipo (IgG 2a, Κ) em solução salina a um volume final de 100 ul por rato.
    2. Começando no dia 3 enxerto pós-tumor injetar uma dose diária intraperitoneal de 12,5 mcg rato anticorpo anti-Ly6G (100 mL). Injetar camundongos de controle com ou 12,5 g (100 ul) de anticorpo de controlo de isotipo de rato (2a IgG, Κ).
    3. Começando no dia 14, os anticorpos administrar duas vezes por dia, conforme a taxa de produção de neutrófilos aumenta dramaticamente quando o tumor cresce 4T1.
    4. A cada dois dias, obter uma amostra de sangue (2-3 gotas) por entalhar a cauda-veia lateral. Recolher o sangue em um anti-coagulant contendo tubo (heparina, citrato ou EDTA).
    5. Verifique a depleção de neutrófilos por citometria de fluxo, como descrito no Protocolo nº 5.
  2. Teste de Neutralização do tumor (Ensaio de modificação Winn)
    1. Isolar os neutrófilos a partir de murganhos portadores de tumor. Misturar 1 x 10 6 células tumorais e 3 x 10 6 neutrófilos em 50 ul de soro fisiológico (por ratinho).
    2. Injectar as células subcutaneamente para o flanco de 6 - 8 semanas de idade sem tratamento prévio com ratos BALB / c. Raspar o flanco antes do enxerto tumor para permitir medições precisas do tamanho do tumor. Meça o tamanho do tumor de partida diária no dia 5 pós-enxerto.
  3. Neutrófilos transferência adoptiva
    1. Injectar 2 x 4 10 células de tumor que expressam luciferase em 200 ul de PBS na veia da cauda.
    2. Neutrófilos transferência deve ser feita 4 horas a seguir à injecção de células tumorais. Assim, começam a purificação de HDN de ratinhos portadores de tumor (protocolo 2.1) cerca de 2 horas antes da sua prevista emtransferência vivo. Ressuspender neutrófilos em PBS a uma concentração final de 2,5 x 10 7 células / ml.
    3. 4 horas após a introdução das células de tumor os murganhos colocar sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min. Colocar os ratos num limitador e injectar 5 x 10 6 HDN (200 ul) via veia da cauda. Os ratinhos de controlo são injectados com veículo (PBS).
    4. Monitorar a formação de metástases pulmonares em vários pontos de tempo, utilizando um sistema de imagem em bioluminescência vivo ou por imuno-histoquímica.
  4. Lung ensaio semeadura metastático
    1. Injectar 0,5-1 x 10 6 células 4T1 parentais ortotopicamente na almofada de gordura mamária inguinal esquerda, conforme descrito no Protocolo 1.
    2. No dia 10, ressuspender-4T1 expressando GFP células em PBS a uma concentração final de 5 x 10 5 células / mL. Colocar os ratos sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min.
    3. Colocar os ratos num limitador e injectar 1x10 5-4T1 expressando GFP células (200 ul) por via intravenosa a 4T1 ratinhos portadores de tumor ou ratinhos naive.
    4. No dia seguinte, sacrificar os ratinhos e perfundir os pulmões com 20 ml de PBS para remover os glóbulos vermelhos restantes.
    5. Extirpar os pulmões para análise de células GFP positivas por imuno-histoquímica.
      NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para esgotamento eficaz administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

9. Supressão da proliferação de células T por Neutrófilos de Ratinhos portadores de tumor.

  1. Remover o baço de um ratinho BALB naïve / c mouse e lugar sacrificados em 10 ml de PBS.
  2. Inserir o baço para um filtro de células de 40 um que é apto numa placa de petri cheia com meio RPMI-1640. Usando a extremidade do êmbolo da seringa, triturar o baço através das células filtro no prato de petri. Lavar o filtro de células com 5 ml RPMI. Descarte o filtro.
  3. Transferir as células ressuspensas para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  4. Descartar o sobrenadante, e lisar os eritrócitos por suspensão das células em 36 ml de água pura durante 20 segundos, e se ajustar a isotonicidade pela adição de 4 ml de PBS concentrado x 10. Alternativamente, lisar os eritrócitos por suspensão das células em 5 ml de eritrócitos tampão de lise (ACK), e incuba-se 5 minutos à TA. Neutralizar o ACK através da adição de 10 ml de meio RPMI-1640. Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Volte a suspender as células em 5 ml PBS e contar as células.
  5. Ressuspender as esplenócitos em PBS para uma densidade final de 4 x 10 7 células / ml em 2 15 ml de tubo. Adicionar 2 ml de uma solução CFSE 2,5 uM em PBS. Inverter rapidamente o tubo e incubar durante 10 min a 37 ° C com mistura ocasional (2 min cada), protegida da luz.
  6. Extingue-se o excesso de CFSE por adição de 4 ml de FBS a pré-aquecido (100%) e incubar durante 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 3 ml de PBS e centrifugar a 400 xg durante 10min.
  7. Lavam-se as células com 30 ml de PBS, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  8. Filtrar as células através de um coador de células de 40 ^ m e lavar novamente com PBS.
  9. Ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade final de 2 x 10 7 células / ml.
  10. Semente de 2 x 10 6 / poço (200 ul) numa placa de cultura de tecidos de 24 poços.
  11. Estimular as células por adição de 1 ug de anticorpo purificado de hamster arménio anti-ratinho CD3ε em 500 ul de RPMI-1640 com 10% de FBS.
  12. Adicionar 2 x 10 6 HDN ou LDN em 300 ul de meio RPMI-1640 com FBS a 10% para os esplenócitos CFSE marcados, e incubar durante 3 dias a 37 ° C. Wells sem neutrófilos deve obter 300 � de meio. O volume total em cada poço deverá ser de 1 ml.
  13. Recolher as células e prepará-los para citometria de fluxo. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS (Protocolo 5), e adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR. Incubar durante 5 min à TA.
  14. Adicionar 1 &# 956; l de anticorpo anti-CD8a de APC-conjugado e incuba-se durante 15 min à TA.
  15. Determinar a intensidade de fluorescência CFSE em células T CD8 + por citometria de fluxo (Figura 5). A intensidade CFSE é reduzido pela metade a cada divisão celular. Assim, o número de divisões de células pode ser determinada pela intensidade de coloração com CFSE.

10. Ensaio de migração de neutrófilos

  1. Semente de 5x10 5 células 4T1 em 7 ml de meio de soro reduzido optimizadas suplementado com 0,5% de FBS num frasco de cultura de tecido 2 25 centímetros e incubar 24 horas a 37 ° C.
  2. Transferir 800 uL do sobrenadante para a câmara de fundo de uma placa de migração com um tamanho de poro de 5 um.
  3. Ressuspender 2 x 10 5 neutrófilos em 400 ul de meio de soro reduzido optimizado, suplementado com 0,5% de FBS. Aplicar a suspensão de células na câmara de topo e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  4. No final da incubação, remover a câmara de topo econtar o número de neutrófilos que migraram para a câmara inferior.

11. Monitoramento de neutrófilos produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS).

  1. Prepare a 1,1 x 10 6 neutrófilos / ml em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol. Placa de 180 ul contendo 2 x 10 5 neutrófilos em cada poço de uma placa branca de fundo liso de 96.
  2. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Adicionar 20 ul de uma solução 500 uM luminol em PBS a cada poço para se obter uma concentração final de 50 uM. Leia a quimioluminescência basal para 1s em um curso de tempo de 5 minutos com intervalos de 10 segundos.
  3. Adicionar um estimulante (por exemplo, PMA, a uma concentração de 10 nM ou 100 nM ou fMLP a uma concentração de 10 uM). Prepara-se uma solução 10x concentrado de cada agente em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol e adicionar 22 uL aos respectivos poços. Adicionar aos poços de controlo de veículo de 22 ul.
  4. Measure a quimioluminescência no leitor de placas. Fazer ambos a uma curta (a cada 10 segundos durante 5 min) e um longo (a cada minuto durante 1 hr) curso de tempo.

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Resultados

Em um estudo recente, identificamos uma função anti-metastático para os neutrófilos 6. Os neutrófilos de ratinhos portadores de tumores adquirem um fenótipo citotóxico e têm a capacidade de matar células tumorais 6. Isto está em contraste com os neutrófilos a partir de ratinhos ingénuos que não têm efeito anti-tumoral significativa 6. Várias das técnicas descritas na secção Protocolo têm sido utilizados para estudar a função dos neutrófilos anti-tumoral in vitro e in vivo 6...

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Discussão

Os neutrófilos são a mais abundante de todas as células brancas do sangue e são os primeiros socorros em casos de infecção e inflamação. Como tal, eles são muito sensíveis a estímulos externos e são facilmente activado. Além disso, os neutrófilos tem uma meia-vida muito curta e um volume de negócios rápida. Juntas, essas características levantam várias dificuldades em trabalhar com neutrófilos, de tal forma que estratégias experimentais originais são necessários. Por exemplo, existem várias estratégias de purificação de...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

ZG é apoiada por doações do Programa I-CORE da Fundação Ciência Israel (Grant No. 41/11), a Fundação Abisch-Frenkel, o Roseiras Trust, do Cancer Research Foundation Israel (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award) eo PREOCUPAÇÃO fundação. ZGF é apoiada por doações da Fundação Israel Cancer Research (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award), Cientista Chefe do Ministério da Saúde de Israel e da Associação Lung Israel.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LINHAS CELULARES
Células de carcinoma de mama de camundongo 4T1ADCCCRL-2539 Meio decrescimento: DMEM + 10% inativado por calor FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS Placa
 EstérilFalcon353047
100 mm Corning430167Estéril
25 cm2 Frasco de Cultura de TecidosNunc156340Estéril
90 mm Prato de Cultura de Grau Bacteriano Miniplast, Ein Shemer, Israel20090-01-017Tubo de
Centrífuga Cônico Estéril de 15 ml Miniplast, Ein Shemer, Israel835015-40-111Tubo de
Centrífuga Cônico Estéril de 50 ml Miniplast, Ein Shemer, Israel835050-21-111Tubo de
Poliestireno de Fundo Redondo Falcon 12 x 75 mm Estéril Becton Dickinson352058Placa de Migração Millicell Estéril
24 com um tamanho de poro de 5μ m Merck MilliporePSMT010R1
Placa de Poço de Fundo Plano Branco Estéril 96-Flat-Bottom Costar3917Filtro de Células Estéreis
(40 mm) BD Falcon352340Estéril
20G x 1.5" AgulhaBD Microlance 3 301300Agulha Estéril
23G x 1" BD Microlance 4300800Estéril
25G x 5/8" Agulha BD Microlance 5300600Seringa Estéril
de 0,3 ml com Agulha de 30G x 8mmBD Micro-Fine Plus Demi320829Clipes Estéreis
de 9 mm BD, AutoClip 427631Ímã EasySep Estéril
 18000da STEMCELL Technologies
 Miltenyi Biotech130-042-201Ímã Separador MidiMACS Estéril
Miltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
Lâmina de Vidro para Microscópio Menzel-Glä ser Superfrost  Agitador Orbital Plus ThermoJ1800AMNZ
Sky line, Leitor de Placas ELMIS-3.02.10L
 TECANInfiniteF200Pro
POWDER
Albumina de soro bovino (BSA), fração VSigmaA7906
Bromodeoxiuridina (BrdU) BD Pharmingen550891Estéril
CFSE (5-(e 6-)-Carboxifluoresceína diacetato, éster succinimidílico)Sondas MolecularesC1157
Dextran T500Sigma31392
Sal de Heparina sódica da mucosa intestinal suína SigmaH3149
Azida sódica (NaN3)SigmaS8032Altamente tóxico, manuseie com cuidado
Tioglicolato em pó Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
MÍDIA E SUPLEMENTOS
Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)SigmaD5796Sterile
Opti-MEM® Reduzi o meio séricoLife Technologies31985062Estéril
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 médioSigmaR8758Soro bovino fetal estéril
(FBS), inativado por calorSigmaF9665L-glutamina estéril
Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-020-1A
Piruvato de sódioBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-042-1BPenicilina Estreptomicina
x 1000 soluçãoBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-031-5
salina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem Mg2+ e Ca2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-1PBS estéril
x 10 sem Ca2+ e Mg2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-5AÁgua de grau HPLC estéril
 J.T. Baker4218-03Autoclave
SOLUÇÕES
ACK – Tecnologias de Vida de Cloreto de Amônio-PotássioA10492-01
Solução de bromodeoxiuridina (BrdU) (10 mg/ml) em PBSDissolver 10 mg de BrdU em 1 ml de PBS e filtro estéril.
CFSE, 5 mM em DMSODissolva 2,8 mg de CFSE em 1 ml de DMSO. Divida em alíquotas de 10 ml em tubos estéreis de 200 ml e guarde no escuro a -20oC.
Solução de eosina YSigmaHT110-2-32
Solução salina balanceada de HanksBiological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1AHeparina estéril
, 20 mg/ml em PBSDissolva 100 mg de heparina em 5 ml de PBS estéril e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm. 
Histopaque-1119 Sigma11191Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Histopaque-1077 Sigma10771Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Tampão de lise de cultura de células de luciferase x5PromegaE153ADiluir 1:5 em água estéril antes de usar.
Solução de ensaio de luciferasePromegaE1501Contém pó de substrato de ensaio de luciferase (E151A) e tampão de ensaio de luciferase (E152A)
Solução de hematoxilina de Mayer SigmaMHS-32
PBS + 0,5% BSADissolva 2,5 g de BSA em 500 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.
PBS + 1% BSADissolva 1g de BSA em 100 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.
5x PBS com 2,5% de BSADissolva 12,5g de BSA em uma mistura de 250 ml de água estéril de grau HPLC e 250 ml de PBSx10 e filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
PBS contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTADissolva 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicione 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Tampão FACS (PBS contendo 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA e 0,02% de NaN3)Dissolver 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicionar 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0 e 500 ml de 2% de NaN3, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.
Solução salina (0,9% de NaCl)Dissolver 9 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
0,2% de soluçãoDissolver 2 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
1,6% de soluçãoDissolver 16 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave
2% de azida deDissolver 1g de azida de sódio em 50 ml de ddw estéril, manter a 4oC. Altamente tóxico.
de tioglicolato a 3%                                                                           Dissolva 3 g de pó de tioglicolato em 100 ml de ddw.                                                                             Ferva até que a solução fique amarela e autoclave.
Solução de azul de tripano (0,4%)SigmaT8154Diluir 1:10 em PBS para obter uma solução de 0,04%.
Solução de tripsina B Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-046-1Estéril
1 mg / ml Zymosan ARessuspenda 1 mg Zymosan A em 1 ml de PBS estéril em um tubo Eppendorf. Vortex vigorosamente e incubar o tubo a 37 oC por 30 min. Não autoclave. Prepare a solução recentemente antes de usar.
KITS
Kit de seleção EasySep PESTEMCELL Technologies18557
Coquetel de seleção EasySep PE STEMCELL Technologies18151
as nanopartículas magnéticas EasySep da STEMCELL Technologies18150
Miltenyi Biotec130-092-332
Kit de Enriquecimento de Neutrófilos de Camundongo EasySepSTEMCELL Technologies19762
Kit de Enriquecimento de Neutrófilos Humanos EasySepSTEMCELL Technologies19257
Kit de fluxo FITC BrdUBD Pharmingen 
Kit de isolamento de neutrófilos MACSMiltenyi Biotec130-097-658
Kit de ensaio de fagocitose Cayman Chemical Company 500290
ANTICORPOS
Anticorpo bloqueador FcR Biolegend101302
Purificado anticorpo anti-Ly6G de rato BD Pharmingen 551459Clone 1A8
anticorpo Ly6G de rato conjugado com PE e anticorpo Biolegend127608Clone 1A8
Anti-camundongo de rato conjugado com FITC Ly6GBD Pharmingen 551460Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rato anti-rato Ly6G TONBO Biosciences65-1276Clone 1A8
violetFluor 450-conjugado rato anti-camundongo Ly6G TONBO Biosciences75-1276Clone 1A8
Rat conjugado com FITC rato anti-camundongo CD11bBD Pharmingen 553310Clone M1/70
Camundongo anti-camundongo conjugado com FITC Ly-6G e Ly-6C (GR-1)BD Pharmingen 553127Clone RB6-8C5
Rato conjugado com PE anti-camundongo CD45BD Pharmingen 553081Clone 30-F11
Anti-camundongo de rato conjugado com FITC F4/80 Abcamab60343Clone BM8
camundongo conjugado com FITC anti-humano CD66b Biolegend305103Clone G10F5
Anticorpo de controle de isotipo de rato purificado (IgG2a, k) BD Pharmingen 553927Clone R35-95
LEAF purificado anticorpo anti-rato CD3e para hamster armênioBioLegend100314Clone 145-2C11
de Cultura de Tecidos de 24 poçosPlaca de Cultura de Tecidos Coluna de Separação MACS LS estéril Solução de NaCl de NaCl sódio Solução Kit MicroBead de mouse Anti-Ly6G 559619

Referências

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