Cardiac Pressão-Volume Análise loop usando Conductance Cateteres em Ratos

Resumo

A análise de loop de pressão-volume cardíaco é a maneira mais abrangente de medir a função cardíaca no coração intacto. Descrevemos uma técnica para realizar e analisar loops de volume da pressão cardíaca, utilizando cateteres de condutância.

Resumo

A análise da alça pressão-volume cardíaco é o "padrão-ouro" na avaliação de medidas dependentes e independentes de carga da função sistólica e diastólica ventricular. As medidas de contratilidade e complacência ventricular são obtidas por meio do exame da resposta cardíaca às alterações na pós-carga e pré-carga. Essas técnicas foram originalmente desenvolvidas há quase três décadas para medir a função cardíaca em grandes mamíferos e humanos. A aplicação dessas análises em pequenos mamíferos, como camundongos, tem sido realizada por meio da otimização de técnicas microcirúrgicas e criação de cateteres de condutância. Os cateteres de condutância permitem estimar o pool de sangue explorando a relação entre a condutância elétrica e o volume. Quando realizadas corretamente, essas técnicas permitem testar a função cardíaca em modelos genéticos de camundongos mutantes ou em estudos de tratamento medicamentoso. A exatidão e a precisão desses estudos dependem de atenção cuidadosa à calibração dos instrumentos, à realização sistemática de medidas hemodinâmicas e à análise dos dados. Revisaremos os métodos de realização de experimentos de loop de pressão-volume usando um cateter de condutância em camundongos.

Introdução

Análise de ciclo de volume pressão cardíaca fornece informações detalhadas da função cardíaca e são o padrão ouro para avaliação funcional ^1. Embora as técnicas de imagem, como a ecocardiografia ou a ressonância magnética cardíaca fornecer medidas funcionais, estas medidas são altamente dependentes de condições de carga. Medidas independentes de Carga, de contratilidade cardíaca e relaxamento requerem medições dinâmicas da pressão ventricular e relação do volume em um intervalo de pré-carga e pós-carga. Esta compreensão da relação pressão-volume decorre do trabalho inovador de Sagawa e colegas ^2,3. Eles demonstraram em ex vivo corações caninos perfundidos que o loop de pressão-volume derivados medidas de contratilidade foram independentes de condições de carga ^4.

Na aplicação in vivo destas análises tornou-se possível, com o desenvolvimento de cateteres de condutância na década de 1980. Este avanço técnico permitiu Kass e colegas para realizar a análise de ciclo de pressão-volume em humanos ^5,6. Miniaturização dos cateteres de condutância e melhorias nas técnicas cirúrgicas no final de 1990 de ⁷ feita a análise da função cardíaca roedor viável, permitindo estudos genéticos e farmacológicos para ser realizado. Este avanço, desde então, levar ao uso generalizado de análise de ciclo de pressão-volume e tem gerado uma grande quantidade de conhecimento sobre fisiologia cardíaca mamíferos.

Um conceito fundamental na utilização de cateteres de condutância e a interpretação dos dados obtidos a partir dele, é a relação entre o volume e a condutância. A condutância é inversamente relacionada com a tensão, que é medida através de um cateter com eléctrodos colocados proximal, geralmente colocada por baixo da válvula aórtica, e distalmente, no apex LV ^8. Alterações na tensão ou condutância são medidos por mudanças na corrente que flui de proximal para distal do eletrodo. Embora a piscina de sangue contribuems significativamente a condutância, a contribuição da parede ventricular, denominado condutância paralela (V _P), a condutância medido deve ser subtraído para se obter medições do volume do VE absolutos.

Os métodos para efectuar esta correcção, chamado de calibração solução salina, são discutidos no protocolo abaixo. A relação matemática entre a condutância e de volume, descrito por Baan e colegas, é que o volume = 1 / α; (ρ ^L 2) (GG _p), onde fator de correção α = campo uniforme, ρ = resistividade sangue, L = distância entre os eletrodos, G = condutância e G _{p =} condutância não-sangue ^9. De nota, o fator de correção de campo uniforme em camundongos aproxima de 1,0 devido a pequenos volumes de câmara ^10. Juntamente com transdutores de pressão, o cateter condutância fornece dados de pressão e volume simultânea em tempo real.

Pressu cardíacare-análise do volume apresenta determinadas vantagens sobre outras medidas da função cardíaca, já que permitem a medição da função ventricular independente das condições de carga e de frequência cardíaca. Índices cardíacos independente de carregamento específicos de contratilidade incluem: sistólico final do volume de relação de pressão (ESPVR), d P / d t _max relação volume de -end-diastólica, elastância máxima (E _máx) e pré-carga de trabalho do curso recrutável (PRSW). Uma medida independente de carga da função diastólica é a relação do volume a pressão diastólica final (EDPVR) ^11. O protocolo a seguir descreve o comportamento de análise de ciclo de volume pressão cardíaca, usando tanto um carótida e uma abordagem apical. Embora a metodologia para executar estes estudos foram descritas em pormenor anteriormente ^8,11, iremos analisar os passos chave para obter medições de pressão-volume preciso, incluindo tanto a correcção de solução salina e de calibração cuvete, e fornecer uma demonstração visual de Tsprocedimentos e. Pesquisas com animais realizados para este estudo foi tratado de acordo com os protocolos aprovados e os regulamentos de protecção dos animais do Comité de Conservação e Uso do Duke University Medical Center animal Institucional.

Protocolo

1. Preparações Conductance cateter e calibração de pressão

1. Conectar cateter de condutância para o módulo de cateter hemodinâmica. Eletronicamente calibrar as medições de pressão e volume gravando pressão predefinida eo volume ajustado no módulo cateter. Grave um traçado de 0 mm Hg e 25 mm Hg (Figura 1A) e atribuir as voltagens para ambos os traçados de pressão (Figura 1B e 1C). Da mesma forma, gravar um rastreamento volume de 5 RVU e 25 RVU (Figura 1D) e atribuir as voltagens para ambos os traçados unidades (1E e 1F).
2. Confirme a calibração de pressão eletrônico com uma calibração de pressão manual, utilizando uma coluna de mercúrio. Montar a porta esfigmomanômetro manguito com uma torneira de 3 vias. Preencha um sistema de válvula hemostática de 3 portas, muitas vezes utilizados para angioplastia coronária, com água RT usando a porta lateral.
   1. Colocar a ponta de um cateter de condutância na válvula de hemostase cheia de fluido e garantir suavemente without torcer cateter. Ligue a válvula hemostática para o esfigmomanômetro e inflar a 200 mmHg e bloquear torneira de 3 vias. Examinar se a pressão medida corresponde com a pressão insuflado na esfigmomanômetro.
3. Local cateter em soro fisiológico aquecido a 37 ° C, que é ao nível do campo operatório e pressão medida. Ajuste o controle de pressão até que as pressões registradas está em zero.

2. Anestesia / intubação

1. Administrar cetamina / xilazina (80-100 / 10 mg kg ^-1) como uma injecção intraperitoneal.
   Nota: Os agentes anestésicos alternativos podem ser usados. Uma extensa lista de anestésicos são fornecidos em comentários anteriores desta técnica ^11,12. Anestesiados apropriada pode ser confirmada por aperto suave da cauda.
2. Uma vez anestesiados, fazer a barba do pescoço e peito com máquinas de cortar cabelo e coloque em uma almofada aquecida. Manter a temperatura rectal do rato em 36,5-37,5 ºC. Baixas temperaturas corporaisirá resultar em taxas de coração deprimidos. Aplicar pomada para os olhos para prevenir a secura
3. Adicione uma incisão na linha média do pescoço e dissecar os músculos traqueais para expor a traqueia. Coloque um tubo endotraqueal através da boca, enquanto visualiza a traquéia para garantir a intubação, e conectar-se ao respirador.
4. Manter rato no ventilador durante o procedimento. Defina as configurações do ventilador com base no peso do animal, como descrito anteriormente ^11. Volume corrente (ml) = 6,2 x (peso animal em quilogramas) ^1.01 e freqüência respiratória = 53,5 x (peso animal em quilogramas) ^-0.26.

3. A colocação de cateter condutância na câmara LV

1. Abordagem carótida
   1. Para garantir a esterilidade, dois conjuntos de instrumentos cirúrgicos estéreis são um utilizado- para incisão cutânea inicial e um para operar no toracotomia. Os instrumentos devem ser descontaminados utilizando um esterilizador seca entre os animais durante uma sessão de um indivíduo cirúrgicoND autoclavados no final de cada dia do procedimento.
   2. Depois que a pele foi descontaminado com três ciclos de uma clorexidina + álcool esfoliação da pele (solução de álcool / 70% de clorexidina a 0,5%), fazer uma incisão através da carótida direita da mandíbula ao esterno. Dissecar tecido circundante para expor a carótida direita e cortar o nervo vago, que corre ao lado da carótida.
   3. Coloque uma estéril sutura de seda 6-0 em torno da extremidade distal (afastado do peito) da artéria carótida, gravata e seguro. Coloque dois pontos adicionais sob o proximal da artéria carótida (mais perto do peito) para o primeiro de sutura, vagamente amarrar a sutura meio. Com cuidado, puxe o fio de sutura proximal e garantir apertando-o para a pele. Certifique-se que a artéria carótida foi preso tanto proximal e distal antes de prosseguir.
   4. Fazer uma pequena incisão na artéria carótida R., proximal em relação ao primeiro fio de sutura, e estendem-se longitudinalmente para o peito.
   5. Insira a ponta do cateter condutância,previamente embebidas em solução salina quente durante 30 min, para dentro do recipiente através da incisão e fixar o cateter utilizando o meio de sutura.
   6. Gentilmente avançar o cateter no ventrículo esquerdo através da carótida, enquanto assistia a pressão-volume circuito de rastreamento para assegurar a colocação correta.
      Nota: a colocação óptima do cateter deve produzir laçadas de pressão e volume que aparecem rectangular (Ver Figura 2). Se alguma resistência à passagem do cateter é encontrado, puxe de volta e avançar novamente com uma leve pressão. Uma rotação suave do cateter pode ajudar no posicionamento para o ventrículo esquerdo. Forçar o cateter condutância pode levar a complicações cardiovasculares ou danos graves para o cateter.
   7. Ficha de linha de base de pressão-volume circula ~ 10 minutos após a colocação do cateter e alcançar um estado estável (Figura 2).
2. Abordagem apical
   1. Em um rato anestesiado e ventilado, fazer uma incisão from o processo xifóide e corte através da parede torácica lateralmente até que o diafragma é visível.
   2. Cortar embora o diafragma e visualizar o vértice do coração.
   3. Inserção do cateter de condutância para o vértice do ventrículo esquerdo através de uma ferida facada agulha (utilizando uma agulha de 25-30 G), até que o eléctrodo proximal é apenas dentro do ventrículo.
   4. Ficha de linha de base de pressão-volume loops de ~ 10 min após a colocação do cateter e alcançar um estado de equilíbrio.

4. Varying pós-carga Usando Transient aórtica Oclusão

1. Para realizar a oclusão da aorta transitória, fazer uma pequena incisão horizontal na parte superior do tórax e dissecar tecido circundante para expor a aorta transversa.
2. Coloque uma ligadura de seda 6-0 sob a aorta transversal. Depois de loops de pressão-volume voltaram à linha de base, apertar ambas as extremidades da sutura com a fixação da agulha, suave e lentamente levantar a sutura mais de 1-2 segundos e solte lentamente a tensão.
3. Repetir este procedimento até três gravações separadas óptimas são feitas a partir do mesmo animal.
   Nota: gravações Optimal deve ter pelo menos 5 ciclos de loop de volume pressão e um aumento constante das pressões sistólica finais durante a aplicação da tensão na sutura (Figura 3A e 3C).

5. Variando Preload Usando Transient Veia Cava Inferior Oclusão (IVC)

1. Para realizar a oclusão da veia cava inferior transitória, fazer uma incisão horizontal abaixo do processo xifóide, sob o diafragma para expor o IVC.
2. Coloque uma ligadura de seda 6-0 debaixo do IVC. Depois de loops de pressão-volume voltaram à linha de base, apertar ambas as extremidades da sutura com a fixação da agulha; devagar e com cuidado levantar a sutura sobre 1-2 segundos e solte lentamente a tensão. Oclusão VCI também pode ser realizada pela aplicação de pressão suave usando um cotonete de algodão com ponta.
3. Repita este procedimento até três gravações separadas são ideais made do mesmo animal.
   Nota: gravações Optimal deve ter pelo menos 5 ciclos de loop de volume pressão e uma diminuição constante do diastólica final do ventrículo esquerdo durante a aplicação da tensão na sutura (Figura 4A e 4B).

6. Calibração Saline

1. Na conclusão do estudo, uma (V _P) valor de condutância paralela pode ser obter através da injecção de um bolus de 10 ul de solução salina hipertónica (15%) no animal, através da veia jugular (Figura 5A e 5B).
   Nota: O bólus vai causar um aumento no volume aparente, sem qualquer alteração na pressão. Esta alteração resulta em volume é o resultado de uma alteração na condutância arterial piscina e não devido a um aumento no volume real. Uma diminuição transitória na dP / _dt max pode ser observada, como uma solução salina hipertónica tem um efeito inotrópico negativo ^13. O calculada V _p pode ser inserido em volume de pressão software de análise de ciclo ao longocom os parâmetros de calibração para cuvete e converter de RVUs em microlitros.

7. Calibração Cuvette

1. Para realizar uma calibração cuvete, coloque uma cuvete com poços de diâmetros conhecidos fornecidos pelo fabricante numa almofada de aquecimento ou de um banho de água aquecido a 37 ° C. Preencha os primeiros 4-5 furos com sangue heparinizado fresco quente de ratos submetidos a avaliação hemodinâmica.
   Nota: A calibração tina permite a avaliação precisa da piscina de sangue do ventrículo esquerdo usando o sangue do mouse e permite a conversão de dados de volume de RVUs para microlitros.
2. Inserção do cateter de condutância para o primeiro poço, até que todos os eléctrodos estão submersos. Suavemente mover o cateter dentro do poço, o que irá gerar RVUs variando.
3. Grave as alterações de condutância do canal de volume, em RVUs. Seleccionar o maior RVU para a calibração.
   Nota: O volume dos poços pode ser calculado por 1) usando a equação para o volume de um cilindro, em que o raio é que o poço de cuvete e o comprimento é baseada no comprimento entre os dois eléctrodos de detecção internas ou 2) verificar nas instruções do fabricante. A condutância de saída pode ser correlacionada com os volumes conhecidos para desenvolver uma equação de calibração que converte os dados de RVUs em ¹¹ microlitros.

8. A eutanásia

1. Na conclusão do protocolo, os ratos são sacrificados usando deslocamento cervical sob anestesia.
2. A fim de garantir a morte, os ratinhos que têm sido submetidos a deslocação cervical deve ser submetido a um método secundário de eutanásia. Nós usamos sangria sob anestesia, com a colheita de tecido cardíaco para a experimentação, ou toracotomia bilateral sob anestesia.

9. Análise de Dados usando Volume Pressão laço Analysis Software

1. Calcule V _p de Calibração Saline
   1. Selecionar pressão e volume laços obtido durante a ejecção de uma solução salina hipertónica (Figura 5A e 5B)
   2. Exportação dos ciclos para o volume de pressão de software de análise. Escolha a opção para a calibração Saline (Figura 5C)
   3. Grave o valor V _p calculado (Figura 5D).
      Nota: _O valor de p V é calculado por meio da identificação do cruzamento do volume 1) Fim-diastólica vs. volume sistólico final da calibração salina e 2) linha de volume volume = End-End-sistólica diastólica. O cruzamento destas linhas fornece a V _P, o qual é calculado o volume por pressão do software de análise de ciclo.
2. Digite condutância ao volume (RVU) em relação opções de canais de volume (Figura 1F)
3. Linha de Base relação ciclo pressão-volume Meça
   1. Selecione 8-10 ciclos cardíacos de canais de pressão e volume uma vez atingido o estado estacionário (Figura 2A) ea exportação para a análise suaveware. Identificar 5-6 laços expiratória final (Figura 2B)
   2. Use o valor _p V para corrigir a condutância paralela. Escolha a opção "estado estacionário" e gerar uma tabela de resumo hemodinâmico (Figura 2C)
4. Medida Relação ciclo pressão-volume durante a constrição aórtica
   1. Selecione 8-10 ciclos cardíacos de canais de pressão e volume que correspondem a constrição aórtica antes do aumento de diastólica final (Figura 3A) e exportação de software de análise. Identificar 5-6 laços expiratória final (Figura 3C)
   2. Selecione análise "Contractilidade" (Figura 3B), que irá calcular o volume Pressão Relação sistólico final (ESPVR)
5. Medida Relação ciclo pressão-volume durante IVC constrição
   1. Selecione 8-10 ciclos cardíacos de canais de pressão e volume que correspondem a IVC constrição (Figure 4A) e exportação de software de análise. Identificar 5-6 laços expiratória final (Figura 4B)
   2. Selecione análise "Contractilidade" (Figura 3B), que irá calcular Preload recrutável Trabalho Curso (PRSW) (Figura 4C), máxima dP / dt vs EDV (Figura 4D), bem como a ESPVR e relação do volume a pressão diastólica final (Figura 4E)

Resultados

Análise de ciclo de pressão-volume pode ser usado para medir a função cardíaca em camundongos geneticamente modificados ^14,15 ou camundongos submetidos a estudos de drogas ^16. Lacetes de volume pressão representativos são fornecidos a partir de trabalhos publicados anteriormente ¹⁶ investigar o efeito de beta-arrestina inclinado AT1R ligando, TRV120023. Para testar se TRV120023 afeta a função cardíaca in vivo, análise do lacete pressão-volume foi realizada em camundongos selvage...

Discussão

Nós descrevemos um método para perfoming análise do lacete pressão-volume usando um cateter de condutância em camundongos, para derivar análises abrangentes, tanto a contratilidade cardíaca e relaxamento. Suga, Sagawa e seus colegas utilizaram pressão-volume loops para definir medidas de contratilidade cardíaca, especificamente a inclinação da ESPVR, ou a elastância sistólica final _(es E), e _E max. Elastância, definida pela relação de pressão para o volume (P / V), varia ao longo da duração da síst...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AnaSed (xilazina)	Lloyd Laboratories	NADA no. 139-236	Anestésico
Ketaset (cetamina)	Pfizer	440842	Anestésico
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Máquina de anestesia
Ventilador	Harvard Apparatus	Modelo 683	Equipamento cirúrgico
Kit de tubulação	Harvard Apparatus	72-1049	Equipamento cirúrgico
Homeotérmico Cobertor	Kaz Inc.	5628	Equipamento cirúrgico
Microscópio estéreo	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Equipamento Cirúrgico
Iluminador	Cole– Parmer	41720	Equipamento Cirúrgico
Dumont no. 55 Fórceps Dumostar	Fine Science Tools Inc	11295-51	Instrumentos Cirúrgicos
Graefe fórceps, curvado	Fine Science Tools Inc	11052-10	Instrumentos Cirúrgicos
Pinça Moria MC31	Fine Science Tools Inc	11370-31	Instrumentos
Cirúrgicos Mayo tesouras	Cirúrgicos	Fine Science Tools Inc	14512-15
Tesouras de íris	Fine Science Tools Inc	14041-10	Instrumentos Cirúrgicos
Halsey porta-agulhas	Fine Science Tools Inc	12501-13	Instrumentos Cirúrgicos
Olsen– Porta-agulhas Hegar	Fine Science Tools Inc	12002-12	Instrumentos Cirúrgicos
Tesoura de mola	Fine Science Tools Inc	15610-08	Instrumentos
Cirúrgicos underpads descartáveis	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Suprimentos Cirúrgicos
Esponjas de gaze estéreis, estéreis	Suprimentos Cirúrgicos	Dukal	62208
Aplicadores com ponta de algodão, estéreis	Solon	368	Suprimentos Cirúrgicos
Sutura cirúrgica,  seda, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Suprimentos Cirúrgicos
1 cc Seringas de insulina	Becton Dickenson	329412	Suprimentos Cirúrgicos
Access 9 Válvula de Hemostasia	Merit Medical	MAP111	Equipamento hemodinâmico
Esfigmomanômetro	Bamanômetro	320	Equipamento hemodinâmico
Sistema Millar PV MPVS-300/400 ou MPVS Ultra (inclui cubeta de calibração)	ADInstruments Inc		Equipamento hemodinâmico
1.4F cateter de condutância	ADInstruments Inc	SPR-839	Equipamento hemodinâmico
PowerLab 4/30 com Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Tosquiadeira para animais de software hemodinâmico
	Wahl	8787-450A
Tubos intradérmicos diversos PE-10 Tubos intradérmicos	diversos 427401		Becton Dickenson
	427411		Diversos
Variedade de agulhas (calibre 18, 25 e 30; Thomas Scientific)
Diversos 0,9% (peso / vol) injeção de cloreto de sódio, USP)	Hospira	NDC no. 0409-4888-50	Diversos
Fita			Diversos
Alconox (Alconox Inc.) para limpeza de cateteres	ADInstruments Inc.		variado