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Artigo de método

Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

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DOI:

10.3791/52951

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26 de maio de 2016

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1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para tornar uma nanocelulose bacteriana (BNC) magnética para aplicações na reconstrução de vasos sanguíneos danificados. O BNC foi sintetizado pela linhagem G. xylinus. Por outro lado, a magnetização do BNC foi realizada através da precipitação in situ de íons ferrosos Fe2+ e Fe3+ dentro da malha BNC.

Resumo

Neste estudo, nanocellulose bacteriana (BNC) produzido pela bactéria Gluconacetobacter xylinus é sintetizada e impregnado in situ com nanopartículas de óxido de ferro (IONP) (Fe 3 O 4), para se obter um nanocellulose bacteriana magnética (MBNC). A síntese de MBNC é um processo preciso e especificamente concebido multi-passo. Resumidamente, nanocellulose bacteriana (BNC) películas são formadas a partir preservada G. estirpe xylinus acordo com nossas necessidades experimentais de tamanho e morfologia. Uma solução de ferro (III), cloreto de hexa-hidrato de (FeCl 3 .6H 2 O) e de ferro (II), cloreto de tetra-hidrato de (FeCl 2 · 4H 2 O), com uma razão molar 2: 1 é preparado e diluído em água desoxigenada alta pureza. Uma película BNC é então introduzida no recipiente, com os reagentes. Esta mistura é agitada e aquecida a 80 ° C num banho de óleo de silicone e hidróxido de amónio (14%) é então adicionado, soltando para precipitar oferrosos íons na malha BNC. Esta última etapa permite formando em nanopartículas de magnetita situ (Fe 3 O 4) dentro da malha nanocellulose bacteriana para conferir propriedades magnéticas para BNC película. Um ensaio de toxicidade foi usada para avaliar a biocompatibilidade da película BNC-IONP. O polietileno glicol (PEG) foi utilizado para cobrir as IONPs, a fim de melhorar a sua biocompatibilidade. microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que o IONP foram localizados preferencialmente no fibrilas entrelaçamento espaços da matriz de BNC, mas alguns deles também foram encontrados ao longo das fitas BNC. medições microscópio de força magnéticas realizadas no MBNC detectados os domínios magnéticos de presença com alta e fraco campo magnético de intensidade, confirmando a natureza magnética da película MBNC. valores do módulo de Young obtidos neste trabalho também estão em um acordo razoável com os relatados por vários vasos sanguíneos em estudos anteriores.

Introdução

O nanocellulose bacteriana (BNC) é sintetizado pela estirpe de Acetobacter xylinum, também conhecido como Gluconacetobacter xylinus, e depositados na forma de filmes ou películas na interface ar-líquido durante a cultura estacionária. Estas películas BNC adoptar a forma do recipiente onde são cultivadas, e a sua espessura depende do número de dias em cultura. A. xylinus utiliza a glucose no meio para a síntese das microfibrilas de celulose através de um processo de polimerização e a cristalização subsequente. A polimerização dos resíduos de glicose é levada a cabo na membrana bacteriana extracelular, onde as cadeias de glucano são extrudidas a partir de poros individuais distribuídos sobre o envelope da célula. A cristalização das microfibrilas de celulose ocorre no espaço extracelular com a formação de folhas de cadeia de glucano de van der Waals de colagem seguida por empilhamento das folhas por H-1 de ligação.

Magnéticonanopartículas ic integrados a uma matriz de BNC pode ser facilmente manipulada por um campo magnético externo, a fim de aumentar a força necessária para dirigir e confinar as células do músculo liso (SMCs) contendo nanopartículas magnéticas, no local danificado da parede arterial. Esta estratégia mantém a SMCs longe de outros tecidos, e mantém as células no lugar contra a força exercida pelo fluxo de sangue. Tem sido demonstrado que as SMC desempenhar um papel importante na vasoelasticity do vaso sanguíneo, onde se formam camadas abundantes localizados principalmente na túnica média 2.

O método utilizado para a síntese de MBNC envolve BNC película imerso e agitado numa solução de ferro (III), cloreto de hexa-hidrato de cloreto de ferro e (II) tetra-hidratado a 80 ° C. O hidróxido de amónio é adicionado para formar nanopartículas de óxido de ferro no interior da malha BNC. A adição de hidróxido de amónio altera a cor da solução de laranja para branco. O compacto IONPs juntos ao longo do fibrilas BNCs com uma distribuição não uniforme.

Este protocolo centra-se na concepção de uma película bacteriana nanocellulose-magnético de nanopartículas, o que temos chamado nanocellulose bacteriana magnética (MBNC), que se destina a ser usado como um substituto para a falta, vasos sanguíneos de pequeno diâmetro danificados ou feridos. HS Barud e colaboradores publicaram recentemente um trabalho semelhante para produzir um papel magnético flexível, baseado-BNC misturando películas BNC em uma dispersão aquosa estável de PEG e nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético 3. Aqui, nós descrevemos a produção de celulose bacteriana e a sua impregnação in situ com nanopartículas magnéticas. Um ensaio de citotoxicidade com base na detecção de quebras da cadeia de ADN foi utilizada para testar a biocompatibilidade das películas BNC e MBNC.

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Protocolo

1. Preparação de origem bacteriana Nanocellulose (BNC)

Nota: Todos os passos são realizados sob condições assépticas, a menos que indicado de outra forma.

  1. Prepare meio de cultura.
    1. Preparar 500 ml de meio de cultura líquido, combinando 25 g de extracto de levedura, 15 g de peptona, 125,0 g de manitol, e 500 ml de água de elevada pureza. Autoclave esta mistura a 120 ° C durante 20 min e armazenar a 4 ° C.
    2. Preparação de 100 ml de meio semi-sólidas pela adição de 15 g de ágar a 5,0 g de extracto de levedura, 3,0 g de peptona, 25,0 g de manitol, e 100 ml de água de elevada pureza. Autoclave esta mistura a 120 ° C durante 20 min. Uma vez autoclavado, depósito de 5 ml da mistura num x 16 mm de plástico de Petri de 90 mm. Permitir que a solução de gel a 4 ° C e armazenar a esta temperatura até à sua utilização.
  2. Reidratar G. xylinus estirpe conservada em frascos liofilizados por adição de 1 ml de meio de cultura líquido e pipetando para cima epara baixo, como indicado nas instruções do fabricante.
  3. Inocular as placas de Petri contendo meios semi-sólidos com pequenas gotas de suspensão bacteriana utilizando uma ansa de inoculação. Certifique-se de que o inoculo cobre toda a placa de Petri, movendo o loop numa direcção em zig zag a partir da borda para o centro do prato.
  4. Incubar as placas de Petri a 26 ° C durante 72 h numa incubadora de CO 2 sem. Uma vez que o período de incubação estiver completa, pequenas colónias brancas são visíveis. Se as colónias não são utilizados imediatamente, armazenar as placas de Petri, a 4 ° C por meio de selagem a tampa com parafilme e colocando os pratos de cabeça para baixo. As colónias podem ser armazenados em que a forma de até 6 meses.
  5. Transferência de 2 ml do meio de cultura líquido, preparado no passo (1.1.1) em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Tomar duas colónias com uma agulha de inoculação de pratos de Petri inoculadas na etapa (1.3) e colocá-los para o primeiro poço da placa de cultura de tecidos. REPEAT o mesmo procedimento para os restantes 23 poços.
  6. Incubar a placa de cultura de tecidos a 30 ° C durante 7 dias. Isto irá produzir um total de 24 BNC películas com diâmetro de 16 mm e uma espessura de aproximadamente 2-3 mm de diâmetro tal como representado na Figura 1.
    Nota: Não perturbar a cultura bacteriana, em qualquer ponto durante o período de incubação, por exemplo por agitação das placas. Durante o período de incubação, G. xylinus extrude glucopiranose moléculas de açúcar para formar uma malha cristalina polimérico na interface ar-líquido, que adopta a forma e o tamanho do frasco sob condições de cultivo estáticos. Esta matriz polimérica, conhecido como nanocellulose bacteriana (BNC), é visível no final do período de incubação.
  7. Recolher as películas BNC a partir do meio de crescimento e esterilizá-los em 200 ml de solução de NaOH a 1% durante 1 hora a 50 ° C, a fim de remover todos os vestígios de G. xylinus. Opcionalmente, agita-se esta solução a 300 rpm utilizando uma barra magnéticae uma placa de agitação. Descartar a solução de NaOH e adicionar 200 ml de uma solução preparada de fresco de NaOH a 1%. Repetir o mesmo processo mais uma vez, ou até que as películas BNC em solução adquire uma aparência translúcida.
  8. Lavar as películas BNC com água três vezes e armazená-los em água de alta pureza na RT. Certifique-se as películas BNC está completamente submerso na água e não estão autorizados a secar a qualquer momento.
  9. Autoclave as películas BNC a 121 ° C durante 20 min.
    Nota: Um estudo in vivo, por via subcutânea em ratos realizado pelo martson e colaboradores mostraram sinais de não-degradação do BNC após 60 semanas de implantação. Com efeito, BNC é degradável na natureza por enzimas microbianos e de fungos, que estão ausentes em mamíferos. Por outro lado, a biodegradabilidade do BNC pode ser o resultado de processos biológicos que enfraquecem a rede de micro fibrilas in vivo 4 mecânicas, químicas, e.

2. Síntese de Polímero-revestidoAs nanopartículas de óxido de ferro e a sua deposição na membrana um bacteriana Nanocellulose

  1. Bolha 1.000 ml de água de alta pureza com azoto, de modo a remover qualquer oxigénio dissolvido na água e substituí-lo com nitrogênio.
  2. Usar um de três gargalo do balão de fundo redondo para preparar uma solução em uma proporção de 2: 1 molar de ferro (III) hexa-hidratado cloreto de (FeCl 3 .6H 2 O) e de ferro (II) tetra-hidrato de cloreto de (FeCl 2 · 4H 2 O) diluído desoxigenada com a água de elevada pureza. Por exemplo, usar 5,4 g de FeCl 3 .6H 2 O e 1,98 g de FeCl 2 · 4H 2 O em 10 ml de água desoxigenada alta pureza. Se esta preparação transforma muito viscosa e difícil de agitar, usar 0,54 g de FeCl 3 .6H 2 O e 0,198 g de FeCl 2 · 4H 2 O em 20 ml de água desoxigenada alta pureza.
    Nota: Reduzir o tempo de exposição a FeCl2 · 4H 2 O para o ar por pesagem esta CHcomposto emical tão rápido quanto possível. Uma vez introduzido no balão de fundo redondo de três tubuladuras, fechar a três tubuladuras balão de fundo redondo com rolha de septo até que seja ligado à fonte de gás de azoto e o tubo do condensador.
  3. Usar dois pescoços do recipiente para fornecer uma entrada e saída constante de azoto gasoso através da ligação do fornecimento de gás de azoto a uma agulha perfurado em uma rolha de septo e fixo para pescoços do navio.
  4. Coloque um BNC película que foi preparada anteriormente no passo 1.5 (15,6 mm de diâmetro e 2-3 mm de espessura) no recipiente com os reagentes. Certifique-se de que a amostra é completamente submerso no líquido.
  5. Ligue o pescoço remanescente do navio para um condensador de tubo. Além disso, utilizar um tubo de secagem cheio com sulfato de cálcio anidro em cima do tubo do condensador. Correr água através do tubo do condensador.
  6. Selar todas as juntas de vidro com graxa de vácuo.
  7. Aquece-se a solução em um banho de óleo de silicone a 80 ° C utilizando uma agitaçãofogão e mantenha essa temperatura até que o passo 2.10. Utilize uma pequena barra magnética de agitação para misturar os reagentes a 350 rpm durante 5 min. Certifique-se o BNC é adequadamente impregnado com a solução ferroso e os reagentes estão completamente dissolvidos. Continuar a mexer a mistura até ao final da experiência.
    Nota: Utilizar um termómetro para verificar a temperatura do óleo de silicone. Deve ser estável a 80 ° C.
  8. Aumentar a velocidade de agitação para 700 rpm e adiciona (soltando), em um intervalo de tempo de 5 minutos, 5 ml de hidróxido de amónio (NH4OH, 14%) para os 10 ml de solução ferroso, utilizando uma agulha de pipetagem, que tem sido também deu um soco em uma rolha de septo. Após a adição do hidróxido de amónio, a cor da solução muda de amarelo / laranja para preto.
  9. Continuar a agitar a solução a 80 ° C durante mais 5 min. Evitar a agitação de alta velocidade, a fim de manter a integridade da amostra. Altas velocidades, ou seja, maior do que 1000 rpm, pode destruira amostra.
  10. Diminuir a temperatura da solução a 30 ° C utilizando a parte inferior da placa de aquecimento e agitação de controlo de temperatura manter a agitação durante mais 5 min. Em seguida, desligue a placa quente. Neste ponto, o IONP foram incorporados na malha BNC.
  11. Arrefecer a mistura até à TA e separar as nanopartículas magnéticas (MNP) e BNC usando um forte ímã permanente (por exemplo, 1 Tesla). Para fazer isso, transferir a mistura para um balão de recipiente e, em seguida, mantendo o íman próximo da embarcação, segurar o MNPS e o BNC no lugar durante a decantação do sobrenadante.
    Nota: Tenha cuidado ao manusear ímans fortes, uma vez que pode ser prejudicial quando usado incorretamente. Para os passos (2,12) - (2,14) e (2,16) utilizar a água de elevada pureza desoxigenada preparada anteriormente em (2.1) para impedir que as partículas de oxidação.
  12. Ressuspender o MNPS e BNC em água de 100 ml. Agite suavemente a solução para remover todos os MNPs que não estão fortemente incorporados ao BNC. Decantar o supernatant novamente, segurando a MNPs e do BNC no local usando o íman.
  13. Lava-se a MNPS e os BNC várias vezes com água até que o sobrenadante atinge um pH neutro (pH ~ 7), tal como medido utilizando uma tira colorimétrico.
  14. Separe o nanocellulose bacteriana magnética-funcionalizada BNC ou magnético (MBNC) do MNPs usando uma pinça e lavar o MBNC várias vezes com água até que a água corre claro.
  15. Esteriliza-se o MBNC expondo o MBNC O / N à radiação UV (110-280 nm).
  16. Autoclave a 500 ml de água desoxigenada alta pureza a 120 ° C durante 20 min e armazenar a MBNC em 20 ml de água presente.
  17. Assepticamente, mergulhar a amostra em 1% de PEG e agita-se durante 2 horas à temperatura ambiente (37 ° C). Este procedimento melhora a biocompatibilidade e estabilidade das nanopartículas de óxido de ferro depositada na BNC, especificamente aqueles expostos na superfície 5-7. O revestimento de PEG será distribuído através da rede MBNC 3D.
    Nota: Nu IONP são facilmente oxidado em ardevido à sua elevada actividade química 8. Mesmo que o PEG é considerado um material não-biodegradável, a sua estabilidade química depende das condições biológicas aplicados, tais como o conteúdo de água, pH, temperatura, presença de enzimas, espécies reactivas de oxigénio, espécies reactivas de azoto, e os outros 9.

3. Caracterização do BNC e MBNC películas

  1. Propriedades mecânicas
    1. Realizar o carregamento normal e teste de descarga nanoindentação com indentador Berkovich. O raio de Berkovich diamante penetrador é de 20 nm.
    2. Use sílica fundida e tungsténio para calibrar a área de contacto em função da profundidade de penetração à TA. Durante o teste, montar as amostras no recuo usando cola. O penetrador aproximou as amostras em sua direção espessura.
    3. Aleatoriamente selecionados locais de recuo em amostras de superfícies. Mantenha o espaçamento entre 2 travessões entre 200-300 mm.
    4. Aplicar a carga para oamostras em etapas e gravar o deslocamento correspondente do penetrador. Analisar o lote de carga vs profundidade para encontrar o módulo de Young.
    5. Realizar o teste nanoindentação das amostras, na presença de água deionizada (água DI), e teste através da aplicação de taxas de carga entre 0,0001 mN / seg e 0,005 mN / seg, com carga de pico entre 0,01 mN e 0,60 manganês.
    6. Usar uma célula líquido e manter as amostras sob o ambiente de líquidos. Esta configuração única para a caracterização nanomechanical imerso em um ambiente fluido é ideal para simular efetivamente o alcance funcionalidade biomecânica das membranas BNC e MBNC.
  2. Caracterização estrutural por MEV
    1. Caracterizar a estrutura de fibra nanocellulose por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
    2. Liofilizar as amostras durante 24 horas a -80 ° C. Em seguida, montar em pregos SEM, por pulverização catódica com filme Au-Pd durante 10 seg e analisar usando SEM.
    3. Toma imagens com uma ampliação de 22,000Xe 60,000X, com uma voltagem de aceleração de 5 kV.
  3. domínios magnéticos
    1. Permitir que as películas MBNC para secar completamente à TA, e subsequentemente expor durante 5 min para um íman permanente (1 Tesla).
    2. Imediatamente, realizar as medições de forças magnéticas, utilizando um bio-AFM acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Para cada medição, primeiro capturar as características topográficas e adquirir os domínios magnéticos durante uma segunda passagem. Obter ambas as medições com a bio-AFM em modo não-contato.
    4. Caracterização das nanopartículas magnética é conduzida usando vibração magnetómetro de amostra (VSM) no sistema de medições de propriedades físicas (PPMS) da Quantum Design, à TA (300 K), com um campo magnético na gama de -10,000 10.000 Oe.
  4. citocompatibilidade
    1. Semente humana células de músculo liso da aorta (HASMC) em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços a uma densidade de 1,0x10 3 células / cm 2 e incuba-se durante 24 h na presença das amostras de teste: películas BNC e MBNC (cada um com 15,6 mm de diâmetro).
    2. Use populações de células não tratadas e tratado com peróxido de hidrogénio como controlos negativos e positivos, respectivamente.
    3. Realizar o ensaio Cometa de acordo com os protocolos do fabricante e as orientações propostas pelo A. Azqueta & AR Collins 10.
    4. Utilizar o ouro corante SYBR ácido nucleico neste ensaio de intercalar e fluorescentemente rotular o ADN contido nas amostras a electroforese de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: As células que não sofreram danos no DNA na presença de amostras BNC e MBNC, irá mostrar uma rodada nucleoid verde fluorescente, enquanto que as células danificadas do DNA terá cometas longos - amostras positivas terão nucleoids (a cabeça do cometa), seguido por caudas que contêm material de ADN fragmentado (percentagem de ADN na cauda).

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Resultados

O período de incubação de G. xylinus-se um total de 9 dias, mas as películas começou a formar no início e eram evidentes após cerca de 2 dias. A aparência macroscópica de o conector BNC é exibida na Figura 1, cuja forma imita a de a cultura crescida prato. A Figura 2 descreve o processo para a produção de películas BNC-IONP, que resume os principais passos envolvidos no protocolo acima, bem como a configuração dos componentes pr...

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Discussão

A espessura e tamanho da película BNC pode ser facilmente manipulada alterando o tempo de incubação e do tamanho do frasco no qual é cultivada durante a cultura estática. Os microproperties de BNC, tais como a porosidade, podem ser modificadas por alteração da proporção de oxigénio em cultura estática. Maiores concentrações de oxigênio render mais difícil BNC 11. A. Bodin e colegas de trabalho produzido tubos de BNC com uma pressão de ruptura de até 880 milímetros de Hg, alterando a proporção de oxigénio a pa...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa sob o contrato nº W81XWH-11-2-0067

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Glucoacetobacter xylinusATCC700178
AgarSigma AldrichA1296-500G 
D-Manitol BioxtraSigma AldrichM9546-250G 
Extrato de LeveduraBD Biosciences212750
Peptona BacteriológicaSigma AldrichP0556
Hidróxido de Sódio, Solução de 50% em ÁguaSigma Aldrich158127-100G
Cloreto de Ferro(III) HexahidratadoSigma Aldrich236489-100G 
Hidróxido de amônioMacron Fine Chemicals6665-46
Poli(Etilenoglicol), Médio Mn 400Sigma Aldrich202398-250G 
Cloreto de ferro (II) tetrahidratadoSigma Aldrich44939-250G
Placa de Petri DescartávelSigma AldrichBR452000
Alça de Inoculação DescartávelFisher Scientific22-363-604 
Sulfato de Cálcio AnidroW.A. Hammond Drierite 13001
Sigma AldrichZ273554-1EA
Agulha de pipetagem de laboratório com extremidades rombas de 90°Sigma AldrichCAD7937-12EA
   Sigma AldrichP4786-100EA
Balão de destilação tipo ângulo de três pescoços de fundo redondoSigma-AldrichCLS4965250
Óleo de silicone para banhos de óleoSigma-Aldrich85409-250ML 
Tubo de secagemChemglassCG-1295-01
Rolha de septo, tipo de mangaChemglassCG-3022-98
Barra de agitação magnéticaChemglassCG-2001-05
CondensadorChemglassCG-1218-01
Controlador de temperaturaBriskHeatSDC120JC-A
Placade agitaçãoFisher Scientific11-100-49SH 
Kit de Ensaio de CometaTrevigen4250-050-K
SYBR Gold Gel de Ácido Nucleico StainLife TechnologiesS-11494
bio-AFMJPK InstrumentsNanoWizard 4a BioScience AFM
NanoindenterMicro Materials LtdTestador mecânico multi-módulo 
Microscopia eletrônica de varredura (SEM)Hitachi High Technologies AmericaHitachi S-4800
Graxa de alto vácuo Tiras de teste de pH

Referências

  1. Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
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  17. Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).

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