Fase Diagrama Caracterização utilizando esferas magnéticas como veículos líquidos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar diagramas de fase multicomponentes usando esferas magnéticas controladas externamente como transportadores de líquidos em uma abordagem lab-in-tube. Essa abordagem pode ajudar em aplicações que buscam coletar mais informações sobre a mudança de fase em sistemas líquidos complexos.

Resumo

Esférulas magnéticas com ~ 1,9 um de diâmetro médio foram usadas para o transporte de volumes de microlitros de líquidos entre os segmentos de líquidos contíguos com um tubo com a finalidade de investigar a mudança de fase dos segmentos de líquido. As pérolas magnéticas foram controlados externamente utilizando um magnete, permitindo que as esferas se colmatar a válvula de ar entre os segmentos de líquidos adjacentes. Um revestimento hidrofóbico foi aplicado à superfície interna do tubo para melhorar a separação entre dois segmentos de líquido. O campo magnético aplicado formado um conjunto agregado de esferas magnéticas, a captura de uma certa quantidade de líquido no interior do conjunto que é referido como o volume de transferência. Um corante fluorescente foi adicionado a um segmento de líquido, seguido por uma série de transferências de líquidos, que, em seguida, a intensidade de fluorescência alteradas no segmento de líquido vizinhos. Com base na análise numérica da mudança medida da intensidade de fluorescência, o volume de reporte por massa de esferas magnéticas foi encontradoser ~ 2 a 3 ul / mg. Esta pequena quantidade de líquido permitiu a utilização de segmentos de líquido relativamente pequenas de algumas centenas de microlitros, aumentando a viabilidade do dispositivo para uma abordagem laboratório-em-tubo. Esta técnica de aplicação de pequena variação da composição num volume líquido foi aplicado para analisar o diagrama de fase binário entre a água e o agente tensioactivo C12E5 (pentaetileno glicol éter monododecil), levando a mais rápida análise de amostras com volumes menores do que os métodos convencionais.

Introdução

As esferas magnéticas (MB) é da ordem de 1 micrómetro de diâmetro foram usadas com bastante frequência em ^1,2 aplicações de microfluidos-base, em particular para dispositivos biomédicos. Nestes dispositivos, MBs têm oferecido capacidades, tais como células e separação de ácido nucleico, agentes de contraste, e a entrega de drogas, para citar alguns. A combinação de (campo magnético) de controle externo e microfluídica baseada em gotículas permitiu ³ controle de imunoensaios utilizando pequenos volumes (<100 nl). MBs também têm demonstrado promessa quando utilizado para o tratamento líquido ^4. Esta abordagem utiliza os MBs para transportar biomoléculas entre segmentos de líquido dentro de um tubo separado por uma válvula de ar. Este método não é tão poderoso como outros dispositivos lab-on-chip mais complexas visto no passado, mas é muito mais simples e não oferece a capacidade de lidar com volumes microlitro porte de líquido. Uma abordagem semelhante tem sido relatado recentemente ⁵ por grupo de Haselton e aplicado a biomédicaensaios.

Um dos aspectos mais importantes do presente dispositivo é a separação do segmento de líquido oferecido pela válvula de ar controlada por tensão superficial. Volumes de microlitros de líquido unidas a MBs são transportados através deste espaço de ar entre os segmentos de líquidos usando um campo magnético aplicado externamente. MBs de micropartículas (~ 0,4-7 um em diâmetro com uma média de 1,9 | iM), sob o efeito do campo magnético externo criar um conjunto de micro-poroso que retém o líquido dentro. A força deste aprisionamento líquido é suficiente para suportar as forças de tensão da superfície quando se transportam os MBs de um reservatório para o próximo. Tipicamente, este efeito não é desejável, como a maioria das abordagens somente a moléculas de transporte específicas (tais como biomarcadores) contidos nos líquidos ^6. No entanto, como pode ser visto no nosso trabalho, este efeito pode ser utilizado para tornar um aspecto positivo do dispositivo.

Temos utilizado este "laboratório-em-tubo'Abordagem, mostrado esquematicamente na Figura 1, para a análise de diagramas de fases em sistemas de materiais de binários. O surfactante C12E5 foi escolhido como o principal foco de caracterização, uma vez que é amplamente usado em aplicações industriais tais como produtos farmacêuticos, produtos alimentares, cosméticos, etc. Em particular, a _H2O / C12E5 sistema binário foi investigada porque fornece uma rica conjunto de fases para explorar. Temos focado em um aspecto específico desta mistura química, a saber, as transições para fases líquidas cristalinas em determinadas concentrações ^7-9. Esta transição é facilmente observado em nosso dispositivo, incorporando polarizadores nos estudos de microscopia óptica, a fim de destacar as fronteiras de fase.

Ser capaz de mapear diagramas de fase é uma área muito importante de estudo, a fim de compreender a cinética envolvidos com a transição de fase ^10. A capacidade de determinar com precisão a interacção de tensioactivos com um solventesnd outros componentes é crucial, devido à sua complexidade e muitas fases distintas ^11. Muitas outras técnicas têm sido anteriormente utilizados para caracterizar mudança de fase. A abordagem convencional envolve a criação de muitas amostras, cada uma consistindo de diferentes concentrações e permitindo-lhes a equilibrar, o que requer tempos de processamento longos e elevada quantidade de volumes de amostra. Em seguida, as amostras são tipicamente analisadas por métodos óticos, como os transportes interfacial difusora (DIT), que oferece alta resolução de tais composições de surfactante ^12,13. Semelhante ao método nós utilizamos, o método DIT usa luz polarizada para a imagem de fase fronteiras distintas.

Protocolo

1. Preparação de um tempo de uso de materiais no Device

1. Preparação de tubo
   1. Corte a tubulação em 15 cm segmentos. Tubing tem 1,6 mm de diâmetro interno e 3.2 mm de diâmetro externo.
   2. Segmentos de tubo pendurar verticalmente usando fita. Coloque uma toalha de papel debaixo de tubos para recolher a solução de fluoropolímero excesso.
   3. Injectar 100 ul de solução de fluoropolímero na abertura superior de cada um dos segmentos de tubo utilizando uma seringa, de tal forma que ela irá entrar em contacto com a circunferência inteira na parede interior.
   4. Permitir segmentos de tubo para pendurar no lugar durante 1 h para remover o excesso de quantidade de solução de fluoropolímero.
   5. Limpe qualquer solução fluoropolymer do lado inferior do tubo que não escorrer para fora. Remova a tubulação a partir da posição de suspensão e dispor de toalhas de papel.
   6. Colocar o tubo de segmentos em forno a 100 ° C durante 1 h recozer a camada de revestimento de fluoropolímero.
   7. Remova segmentos de tubo do forno. Use uma pinça, como seg tubomentos estará quente.
2. Preparação de solução diluída de esférulas magnéticas
   1. Calcular a concentração do grânulo magnético necessário para atingir o volume transição desejado, conforme determinado pela relação entre carry-over volume e massa MB mostrado na Figura 2.
      Nota: A solução original MB tem 1 g de MBs em 50 ml de solução. Considerando-se um volume de câmara de ensaio de 20 ml, uma solução diluída de MB original com água destilada a uma razão de 6: 4 (solução MB: água) para se obter um volume de transição de ~ 0,4 ul. Ajustar razão de diluição quando diferente volume de carry-over é desejado.
   2. Colocar num frasco de 20 ml da amostra numa micro-balança. Zero o equilíbrio.
   3. Agitar o recipiente de solução esférulas magnéticas, em seguida, retirar 0,6 ml usando uma micro-pipeta.
   4. Dispensar solução pipetada para o frasco de amostras em equilíbrio.
   5. Dispense 0,4 ml de água destilada no frasco da amostra.
3. Corante fluorescente lpreparação iquid
   1. Dissolver 2 em peso.% De corante em água desionizada a solução com vortex durante 1 min.

2. Preparação da instalação experimental para experimentos de fluorescência

1. Preparação do dispositivo de tubagem.
   1. Inserir um conector luer fêmea para uma extremidade do tubo.
   2. Colocar o tubo para uma seringa Luer-lock, que tem um volume de 3 ml e 0,1 ml da graduação.
   3. Coloque a seringa na bomba de seringa e definir o avanço com 2 ml / h.
   4. Para a inserção precisa de líquidos para o tubo, usar a bomba de seringa para retirar a solução contendo as esferas magnéticas e corante fluorescente.
   5. Insira 20 ml de solução de grânulo magnético no tubo usando retirada bomba de seringa. Este segmento de líquido é referido como câmara de ensaio (volume da câmara de ensaio podem variar de acordo com a experiência). Vortex o recipiente com solução grânulo magnético durante 1 minuto e em seguida, agitar manualmente durante o ciclo de retirada de modo a formar MB dispersões uniformes.
   6. Depois de câmara de teste de inserção líquido é concluído, retire 6 l de ar para dentro do tubo. Este volume de ar irá mais tarde formar uma válvula entre os dois segmentos de líquido.
   7. Após a inserção do entreferro está concluída, começam retirada 180 ul de líquido com corante fluorescente. Este segmento de líquido é referido como o reservatório. Volume do reservatório pode variar dependendo da experiência. Volume de reservatório maior é benéfica para minimizar a mudança de concentração de corante.
   8. Coloque um segundo conector luer fêmea na outra extremidade do tubo.
   9. Remover o dispositivo de tubo da seringa.
   10. Coloque tampas luer-lock em ambas as extremidades do dispositivo.
2. Optics configuração para experimentos de fluorescência
   1. Ligue todos os componentes ligados ao microscópio invertido.
   2. Ligue o computador e abra o software de imagem de microscópio.

"> Procedimento 3. Experimental de Experimentação de fluorescência

1. Tome medição da intensidade de fluorescência inicial da câmara de ensaio e reservatório usando o microscópio invertido. Ao analisar a fluorescência da amostra, assegurar que o foco está na posição central (em ambas as direcções x e y) do segmento de líquido no interior do tubo. Medições de discos em planilha de dados.
2. Coloque dispositivo sobre a parte superior do cubo de modo a que o íman esferas magnéticas todos os segregar para uma área na câmara de ensaio. Transferir as contas para o reservatório, movendo o dispositivo por cima do íman (~ 10 seg). O 1 polegada de ímã de neodímio cubo é grau N48 com uma força de tração de 45,6 kg.
3. Uma vez aglomerado esférulas magnéticas é transferida através do intervalo de ar e para dentro do reservatório, agitar as esferas magnéticas através da colocação do dispositivo sobre a parte superior do magneto e rodando para libertar o líquido a ser preso dentro do agrupamento. Continuar a agitação dos grânulos magnéticos até homogeneização do reservatório tenha sidocompletou (~ 30-45 seg).
4. Coloque dispositivo por cima do ímã de tal forma que as esferas magnéticas no reservatório todos os segregar a uma área. Transferir o cluster de esférulas magnéticas de volta para a câmara de ensaio.
5. Uma vez que o cluster atinge a câmara de ensaio, agitar as esferas magnéticas, colocando o dispositivo por cima do ímã e girando para liberar o líquido fluorescente preso dentro. Continuar a agitação dos grânulos magnéticos até homogeneização da câmara de ensaio tiver sido completado (~ 30-45 seg).
6. Aqui intensidade de fluorescência de tanto a câmara de ensaio e o reservatório utilizando o microscópio invertido. Medições de discos em planilha de dados.
7. Os passos são repetidos até 3,2-3,6 ambos os segmentos de líquido convergem para intensidades de fluorescência semelhantes (~ 100 ciclos).

4. Análise Numérica de Dados fluorescente

1. Com os dados de intensidade fluorescentes armazenadas em uma planilha, execute análise numérica usando MATLAB.
2. Derive equações para calcular um valor teórico de intensidade de fluorescência em ambos o reservatório e a câmara de teste. Incorporar as seguintes equações em um arquivo de script MATLAB:
   onde I é a intensidade de fluorescência (UA), V é o volume (mL), n é o número de transferências, R é o reservatório, T é a câmara de ensaio, e C é carry-over.
3. Usando MATLAB, gerar gráficos e analisar para determinar o volume carry-over para todos os experimentos. Use esses dados para produzir a Figura 2.

5. Preparação da instalação experimental para Experimentos surfactante

1. Preparação do dispositivo de tubagem.
   1. Inserir uma fêmea de bloqueio Luer sobre uma extremidade do tubo.
   2. Colocar o tubo para uma seringa Luer-lock.
   3. Coloque a seringa na bomba de seringa e definir o avanço com 2 ml / h.
   4. Para a inserção precisa de líquidos para o tubo, usar a bomba de seringa para retirar a solução contendo as esferas magnéticas e surfactant.
   5. Insira solução talão 20 l magnético no tubo usando retirada bomba de seringa. Este segmento de líquido é referido como câmara de ensaio (volume da câmara de ensaio podem variar de acordo com a experiência). Agita-se o recipiente com solução de esférulas magnéticas com a mão durante o ciclo de retirada de modo a formar MB dispersões uniformes.
   6. Depois de câmara de teste de inserção líquido é concluído, retire 6 l de ar para dentro do tubo. Este volume de ar será posteriormente referida como o intervalo de ar.
   7. Após a inserção intervalo de ar é concluído, começará a retirada de 180 l de surfactante puro C12E5. Este será posteriormente referida como o reservatório.
2. Optics configuração para experimentos de surfactante.
   1. Mova bomba de seringa com dispositivo de tubo de modo que a câmara de teste com esferas magnéticas está em foco com o microscópio estéreo.
   2. Coloque uma folha de filme polarizador no topo de uma fonte de luz LED. Deslize a fonte de luz LED por baixo do tubo ligado aa bomba de seringa.
   3. Anexar um outro filme polarizador para a lente do microscópio estéreo usando fita. Certifique-se de que os dois filmes polarizadores têm um grau 90 desfasados ​​um do outro.
   4. Montar um CCD (Charge Coupled Device) câmera ao microscópio estéreo. Ligue a câmera para o computador e abrir o software de imagem.

6. Procedimento Experimental para Experimentos surfactante

1. Coloque o íman cubo ao lado da câmara de ensaio, enquanto que o íman está montado sobre um suporte.
2. Uma vez que as esferas magnéticas formar um cluster, começar a bombear líquidos no tubo de alimentação a uma taxa de 2 ml / h de tal modo que o conjunto magnético do grânulo é movido a partir da câmara de ensaio, através da abertura de ar, e para a câmara de reservatório de surfactante.
3. Uma vez que o aglomerado esférulas magnéticas atinge o ponto médio da câmara de reservatório, parar o bombeamento da bomba de seringa.
4. Mover o íman cubo de distância a partir do tubo, permitindo a contas magnéticas para separar umND reduzir o tempo de difusão do líquido retido no cluster esférulas magnéticas.
5. Assista a tela do computador para observar o _H 2 O / ciclo de mistura C12E5 por diferentes fases.
6. Uma vez que a difusão e a mudança de fase do líquido é completado, colocar o íman de volta ao seu destino, por ex o reservatório de modo que as contas magnéticas para formar um aglomerado.
7. Usando a bomba da seringa, retirar os líquidos tais que o conjunto magnético do grânulo é transferido do reservatório de surfactante, através do entreferro, e de volta para a _H2O câmara de ensaio.
8. Uma vez que o aglomerado esférulas magnéticas atinge o ponto médio da câmara de ensaio, parar o bombeamento da bomba de seringa.
9. Mova o ímã cubo longe do tubo. Isto irá permitir que as esferas magnéticas para separar e vai ajudar a reduzir o tempo de difusão do líquido retido no cluster esférulas magnéticas.
10. Assista a tela do computador para observar o _H 2 O / ciclo de mistura C12E5 por diferentes fases.
11. Uma vez que a difusão e a mudança de fase do líquido é completado, colocar o íman de volta ao seu destino pela primeira câmara de ensaio de modo que as contas magnéticas para formar um aglomerado.
12. Repita os passos 6,2-6,11 até que a câmara de teste exibe uma mudança de fase.

Resultados

Utilizando a abordagem de laboratório-em-tubo para o transporte de quantidades ul-volume de líquido com esferas magnéticas, juntamente com MATLAB para análise numérica, os volumes de reporte médios líquidos, como uma função de massa de esférulas magnéticas, foram encontrados (Figura 2). Massa maior de esferas magnéticas proporciona maior volume de carry-over na taxa de 2-3 ul / mg. A configuração experimental (Figura 1) foi usado para observar a mudança de fase no _H2O / siste...

Discussão

Em técnicas mais comuns para a investigação diagrama de fase, múltiplas amostras com diferentes composições e proporções precisa de ser preparado e ter a atingir o equilíbrio termodinâmico, que provoca um processo demorado e uma quantidade significativa de material. Alguns desafios podem ser resolvidos por DIT método (transporte interfacial difusora) usando capilar plano e método de análise de infravermelho, mas nenhum deles pode resolver todos os desafios com investimento de baixo custo.

A ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Grânulos magnéticos
C12E5 Surfactante	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cubo Ímã	Ímãs Apex	M1CU
Filme Polarizador	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Solução de fluoropolímero
Corante Vermelho	Keyacid Keystone	601-001-49	Corante fluorescente
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Fêmea
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Seringa
Masculina	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Bomba de Seringa	Stoelting	53130
Microscópio Estéreo	Nikon	SMZ-2T
	Nikon	Eclipse Ti-U	O cubo filtrante usado tinha uma faixa de comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um espelho dicróico de 585 nm, permitindo fotoemissão variando de 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Câmera montada em microscópio	Motic	5000

Microscópio invertido