Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.
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Artigo de método
Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína
Neste artigo
Resumo
Resumo
A quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas é fundamental para uma ampla gama de pesquisas e aplicações clínicas. Este protocolo fornece instruções passo a passo para o desenvolvimento e aplicação de ensaios quantitativos usando espectrometria de massa (MS) de monitoramento de reação selecionada (SRM). Primeiro, os peptídeos-alvo quantotípicos prováveis são identificados com base em vários critérios. Isso inclui identificar peptídeos proteotípicos, evitar locais de modificação pós-tradução e analisar a singularidade do peptídeo alvo para a proteína-alvo. Em seguida, padrões brutos de peptídeos externos são sintetizados e usados para desenvolver ensaios SRM, e os ensaios resultantes são usados para realizar análises qualitativas das amostras biológicas. Finalmente, padrões de peptídeos internos purificados, quantificados e marcados com isótopos pesados são preparados e usados para realizar ensaios SRM da série de diluição de isótopos. A análise de todos os dados de MS resultantes é apresentada. Este protocolo foi usado para testar com precisão a abundância absoluta de proteínas da via de sinalização da quimiotaxia dentro das células RAW 264.7 (uma linha celular de monócitos / macrófagos de camundongo). A quantificação de Gi2 (uma subunidade α-proteína G heterotrimérica) é descrita em detalhes.
Introdução
Experimentos de proteômica que usam a espectrometria de massa (MS) pode ser projetado para usar um não-alvo (espingarda) ou métodos direcionados. Proteómica descoberta baseia-se na espingarda geralmente de baixo para cima MS, usando um modo de aquisição dependente dos dados tradicional, ou utilizando uma das técnicas independentes de dados desenvolvidas recentemente (por exemplo, MS E, SWATH) 1,2. Proteómica espingarda é uma ferramenta poderosa para a identificação de alto rendimento péptido e quantificação relativa, mas é geralmente inadequada para a quantificação absoluta ou para o direccionamento pequenos conjuntos, definidos ~ (RTE)....
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Protocolo
NOTA: Este método foi descrito anteriormente 56.
1. Peptide seleção de alvos
- Compilar uma lista das proteínas alvo, e incluem um pequeno número de proteínas de limpeza para a normalização entre amostras biológicas, e também incluir um padrão interno de proteínas (por exemplo, luciferase de pirilampo). Digerir as proteínas-alvo em peptídeos trípticos in silico usando uma ferramenta de software, como a proteína digestão Simulator 29,30.
- Exigir que os peptídeos são totalmente tríptico e não contêm locais de clivagem de tripsina em falta. Evitar péptidos com locais de clivagem de tr....
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Resultados
O desenvolvimento de modelos computacionais preditivos de vias de transdução de sinal é um dos objectivos fundamentais da Biologia de Sistemas 53. Infelizmente, mesmo para as vias de sinalização que têm sido estudados extensivamente e têm um elevado significado clínico, que ainda não é geralmente possível prever o comportamento quantitativamente via em resposta a perturbações (por exemplo, isto é verdadeiro para a MAPK / ERK 54). Recentemente, uma investigação empregada proteômica direcion.......
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Discussão
Quantificação absoluta de proteína é essencial para uma gama muito diversificada de aplicações biomédicas tais como validação de biomarcadores e modelagem via de transdução de sinal. Recentemente, proteômica direcionados utilizando LC-SRM beneficiou de melhorias para várias tecnologias, incluindo a preparação de péptidos padrão, HPLC, qq-MS, e análise de dados LC-SRM. Por conseguinte, tornou-se uma alternativa poderosa para imunoensaios. Imunoensaios podem ser extremamente sensíveis e de alto rendimento, mas o desenvolv.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetonitrila (ACN), grau LC-MS | Fisher | A955-1 | |
| BCA (ácido bicinconínico) | Fisher | 23235 | |
| Grânulos para bater contas, zircônia-sílica, 0,1 mm | Produtos BioSpec | 11079101z | |
| Cloridrato de bestatina | Sigma | B8385-10MG | |
| DMEM de cultura de células (com glicose, sem L-glutamina) | Lonza | 12-614F | |
| Cultura de células EDTA, 500 mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cultura de células de soro bovino fetal (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cultura de células L-glutamina | Sigma | G8540-25G | |
| Cultura de células tamponada com fosfato salino (PBS) pH 7,4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cultura de células Trypan Blue coloração de viabilidade, 0,4% w / v | Lonza | 17-942E | |
| Celômetro Auto T4 contador de células | Nexcelom Bioscience | Celômetro Auto T4 | |
| Celômetro Auto T4 câmaras de contagem descartáveis | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Ácido fórmico, grau LC-MS, ampolas | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocitômetro, Neubauer-melhorado, 0,1 mm de profundidade | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1 M, pH 7,2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Ácido clorídrico, 37% p/p | VWR | BDH3028-2,5LG | |
| Iodoacetamida | Sigma | I1149-5G | |
| Extrator de micropipeta baseado em laser | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC capilar de sílica revestido, 50 µ m id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| frasco LC, amostrador automático, polipropileno de 12 mm x 32 mm | SUN SRI | 200-268 | |
| LC tampa de rosca, amostrador automático, pré-fenda PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, de Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pestatina A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| Tiras de pH colorpHast (pH 0,0-6,0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop cocktail inibidor de fosfatase | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartucho | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, coletor de extração, 20 posições | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, bulbo de borracha de superfície plana | Fisher | 03-448-25 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Concentrador a vácuo Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac | Fisher SPD111V | ||
| Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MS | Fisher | A116-50 | |
| Tripsina, grau de sequenciamento, | V5113 | ||
| decapper para tubos Micronic | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubos, microcentrífuga de 2 ml, tampa de rosca com anel de vedação, estéril | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Ureia | Sigma | U0631-500g | |
| Água, grau LC-MS Fisher | W6-1 |
Referências
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-....
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Reimpressões e permissões
