Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Resumo

Descrevemos a quantificação de Salmonella typhimurium citosólica e vacuolar em macrófagos derivados da medula óssea usando permeabilização diferencial de digitonina.

Resumo

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares podem replicar no citosol ou no vacúolo contendo agentes patogénicos especializados (PCVs). Para atingir o citossol, bactérias como Shigella flexneri e Francisella novicida precisa para induzir a ruptura do fagossoma. Em contraste, Salmonella typhimurium replica num compartimento vacuolar, conhecido como Salmonella vacúolo molecular contendo (SCV). Todavia, certos mutantes de Salmonella não conseguem manter a integridade do VCE e são, assim, libertado para o citosol. A percentagem de bactérias citosólica vs vacuolares sobre o nível de bactérias individuais podem ser medidos por permeabilização diferencial, também conhecido como ensaio de protecção fagossoma. A abordagem faz uso da propriedade de detergente digitonina para se ligar seletivamente o colesterol. Uma vez que a membrana de plasma contém mais colesterol do que outras membranas celulares, digitonina pode ser usado selectivamente para permeabilizar a membrana plasmática, enquanto deixando as membranas intracelularesintacta. Em resumo a seguir à infecção, com o agente patogénico expressando uma proteína marcador fluorescente (por exemplo mCherry entre outros), a membrana plasmática de células hospedeiras é permeabilizadas com uma curta incubação em tampão contendo digitonina. As células são então lavadas e incubadas com um anticorpo primário (acoplado a um fluoróforo de escolha) dirigido contra a bactéria de escolha (por exemplo, anti- -FITC de Salmonella) e lavou-se novamente. Se forem utilizadas as bactérias não marcados, um passo adicional pode ser feito, em que todas as membranas são permeabilizadas e todas as bactérias coradas com um anticorpo correspondente. Após a coloração, a percentagem de vacuolares e citosólicos bactérias podem ser quantificados por microscopia de FACS ou por contagem de eventos simples ou duplos positivos. Aqui nós fornecemos detalhes experimentais para a utilização desta técnica com a bactéria Salmonella typhimurium. A vantagem deste teste é que, em contraste com o outro ensaio, que fornece uma quantificação do nível de único bactericidaRia, e se analisou por microscopia fornece o número exacto de citosólica e bactérias vacuolares numa dada célula.

Introdução

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares replicar quer directamente no citosol da célula hospedeira, ou em compartimentos vacuolares especializados ^1. Durante a fase inicial da infecção a maioria dos patógenos são internalizadas por fagocitose ou por células especializadas (tais como macrófagos) ou por promover activamente a sua própria absorção em células não fagocíticas. Em células fagocíticas, o fagossoma funde normalmente com lisossomas para formar um compartimento de degradação, em que as partículas são digeridas fagocitados. Bactérias citosólicas especializados, tais como Francisella novicida ou Shigella flexneri, escapar degr....

Protocolo

1. Digitonin Ensaio com mCherry expressando Salmonella (Análise baseada em FACS)

1. Preparando bactérias
   Nota: Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) expressando mCherry partir de um plasmídeo (pFPV mCherry que codifica sob o promotor rpsM) é usado neste ensaio. Fagocitose bacteriana e proliferação onde não alterada pela expressão constitutiva de mCherry (dados não mostrados) ^16.
   1. Inocular a estirpe 1 dia antes da infecção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 ug / ml) e ampicilina (100 ug / ml, mCherry vector de expressão) num agitador a 37 ° CO / N.
2. Ch....

Resultados

Figura 1 e Figura 2 mostra o esquema do ensaio digitonina descritos no protocolo 1 e 2 protocolo ilustra as etapas críticas do protocolo e os resultados obtidos. A Figura 3 mostra os resultados típicos de FACS. Os controlos positivos e negativos são usados ​​para definir as portas para mCherry + / bactérias FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + bactérias (cytosolic Salmonella). Com base nestes portões a percentagem de bactérias citosólicas e vacuolares pode ser d.......

Discussão

Diferencial de permeabilização é um método fácil e robusto para analisar e quantificar a distribuição subcelular de agentes patogénicos bacterianos entre compartimentos vacuolares e o citosol. O mesmo ensaio foi usado com sucesso com bactérias tais como Francisella novicida ^2,4 e ¹² Shigella flexneri. No entanto, uma vez que muitos patógeno intracelular alterar ou modificar as estruturas de acolhimento de Endomembrane, a robustez da permeabilização digitonina terá de ser determina.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Digitonin	Sigma	D5628	50 μ g / ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Acetato de potássio	Sigma	791733
MgCl2< / sub>	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexina	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponina	Sigma	47036
Meio de montagem Vectashield	Vectorlabs	H-1200
Anti Coelho anticorpo-488	Molecular Sondas	A-11070	1/500
Glicina	Sigma	G8898
Gentamicina	Life Technologies	15710-49	100 μ g/ml e 10 μ g/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Microscópio confocal	Zeiss		imagem feita a 63X
FACS Fortessa	BD tecnologias		detecção mCherry 610 nm
Detecção de tecnologias		FACS Fortessa	FITC 530 nm

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