Neste estudo, uma técnica microscópica de luz detalhada foi otimizada para observação e análise em tempo real do movimento dos cílios CPEC ex vivo, juntamente com um método de microscopia eletrônica para análise ultraestrutural.
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Artigo de método
Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide
Neste artigo
Resumo
Resumo
O plexo coróide está localizado na parede ventricular do cérebro, cuja principal função é a produção de líquido cefalorraquidiano. As células epiteliais do plexo coróide (CPECs) que cobrem a superfície do tecido do plexo coróide abrigam vários cílios únicos, mas a maioria das funções desses cílios ainda precisa ser investigada. Para descobrir a função dos cílios CPEC com referência particular à sua motilidade, um sistema de observação ex vivo foi desenvolvido para monitorar a motilidade ciliar durante os períodos embrionário, perinatal e pós-natal. O plexo coróide foi dissecado do ventrículo cerebral e observado em microscópio de contraste aprimorado por vídeo, equipado com óptica de contraste de interferência diferencial. Sob esta condição, um método simples e quantitativo foi desenvolvido para analisar os perfis móveis dos cílios CPEC por várias horas ex vivo. Em seguida, as alterações morfológicas dos cílios durante o desenvolvimento foram observadas por microscopia eletrônica de varredura para elucidar a relação entre a maturidade morfológica dos cílios e a motilidade. Curiosamente, este método pode delinear mudanças no número e comprimento dos cílios, que atingiram o pico no dia pós-natal (P) 2, enquanto a frequência de batimentos atingiu um máximo em P10, seguido por cessação abrupta em P14. Essas técnicas permitirão a elucidação das funções dos cílios em vários tecidos. Embora técnicas relacionadas tenham sido publicadas em um relatório anterior1, o presente estudo se concentra em técnicas detalhadas para observar a motilidade e morfologia dos cílios CPEC ex vivo.
Introdução
Os cílios são projeções semelhantes a pêlos na superfície da maioria das células vertebradas, que têm atraído a atenção de pesquisadores médicos por causa de uma classe de doenças denominadas ciliopatias2–4. Apesar da expressão ubíqua da organela, uma ampla variedade de funções ciliares tem sido relatada, incluindo motilidade e biossensoriamento. Por exemplo, cílios móveis na superfície mucoepitelial transportam muco5 e detritos epiteliais para a saída dos tratos, prevenindo doenças ao limpar a superfície do epitélio. Além disso, durante os primeiros períodos de desenvolvimento e estágios embrionários, os cílios regulam a pr....
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Protocolo
Os protocolos e uso de animais de laboratório foram aprovados pelos cuidados com os animais e uso comitês institucionais da Universidade de Yamanashi e Universidade de Waseda. Cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.
1. Preparação CPEC
- Preparar os seguintes aparelhos e materiais: um microscópio estéreo, de um modo preferido capaz de transmitir luz a partir do fundo; um par de fórceps Dumont relojoeiro (# 3 ou # 4), esterilizada por chama, tesouras operacionais em linha reta, esterilizada por chama; dois pratos de 10 centímetros de plástico estéreis contendo 20 ml de gelo-frio Leibovitz L....
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Resultados
Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1, incluindo imagens dos dispositivos.
Observações de movimento ao vivo de CPECs
Filme 1 mostra um filme de CPECs isoladas de um rato perinatal, e Filme 2 mostra uma visão expandida das imagens em filme 1. Deve-se notar que as pontas ciliares individuais são menos claras nas imagens fixas comparados com os dos filmes. A Figura 2
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Discussão
Perspectivas deste método
Embora a técnica aqui descrita não proporciona uma análise mais detalhada dos cílios do que os métodos previamente publicados, o significado desta técnica reside na simplicidade do sistema e relação custo-eficácia, que pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo de rastreio de motilidade ciliar ex vivo. Em particular, TI Workbench fornece uma interface simples e fácil de usar que permite aos pesquisadores observar e analisar a motilidade ciliar mais facilm.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este trabalho tem como objetivo relatar metodologia detalhada para observar a motilidade ciliar em tecidos isolados do plexo coróide. Novidades científicas têm sido relatados em estudos anteriores 1,8.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por um Projeto para Universidades Privadas: subsídio de fundo correspondente do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão (T.I.) e Grants-in-Aid for Scientific Research (C) do MEXT (S.T. e K.N).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes necessários | |||
| para imagens de células vivas | |||
| etanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| para preparação de MEM | |||
| etanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Solução salina balanceada de Hank | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldeído | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldeído | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| acetato de isoamila | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Peneiras Moleculares 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | de etanol anidro |
| salina (PBS) | Tampão de fosfato Sigma-Aldrich | D1408 | |
| , 0.1 M | Para fazer 100 ml, misture 19.0 ml de 0.1 M NaH2PO4 e 81,0 ml de 0,1 M Na2HPO4 | ||
| fosfato monossódico (di-hidratado) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| fosfato dissódico (anidro) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| tetróxido de ósmio | Nisshin EM | 300 | |
| gelo | |||
| [header] | |||
| Ferramentas e materiais para dissecação | |||
| para imagens ao vivo e preparação para SEM | |||
| microscópio estéreo | Toalha | ||
| Prato | |||
| de 10 cm 100 ml copo | |||
| tesoura de operação reta | Sansyo | S-2B | |
| pinça de relojoeiro | Dumont | No.DU-3 ou -4, INOX | |
| para imagens de células vivas | |||
| prato de fundo de vidro | Matsunami Glass | D110300 | |
| para preparação de MEM | |||
| folha | |||
| frasco de vidro de 5 ml com tampa de polietileno | Pipeta de transferência Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| Samco Scientific | SM251-1S | para | |
| palito | |||
| pulverização catódica de íons de transferência de amostra com ouro-paládio | Hitachi | E-1030 | |
| secador de ponto crítico | Hitachi | HCP-2 | |
| [cabeçalho] | |||
| Equipamentos e materiais microscópicos | |||
| para imagens de células vivas | |||
| invertido | Olympus | IX81 | |
| Caixa de mercúrio de 100 W e fonte de alimentação | Olympus | U-ULH e BH2-RFL-T3 | |
| Lâmpada de mercúrio de 100 W | Condensador Ushio | USH103D | |
| DIC, n.a. 0,55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 e obturador manual VMM-D1 | podem ser usados. | |
| filtro passa-banda (400-700 nm, Φ 45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| Filtro ND (Φ 45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combinação de filtros ND de 25% e 6% são usados |
| lente objetiva (imersão em água) com elemento DIC | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 com câmera de vídeo de alta velocidade IX-DPAO40 | |
| Allied Vision Technologies | GE680 | ≥ Taxa de quadros de 200 Hz e tempo de exposição de 1 ms | |
| Software de aquisição / análise de imagem | Software interno | TI Workbench | capaz de aquisição em altas taxas de quadros. |
| PC para controle / análise | de | Mac Pro | |
| Meiritsu Seiki | AD0806 | ||
| peso para tecido | Warner Instruments | kits de ancoragem de fatia | Pode ser feito com malha de nylon colada a um U em forma de U esmagado Φ 0,5 mm fio de platina. |
| vidro de cobertura (peso alternativo para tecido) | Matsunami | feito sob encomenda | Um vidro de cobertura pode ser usado como peso de tecido. |
| para SEM | |||
| inverted microscópio | Olympus | IX81 | |
| microscópio eletrônico de varredura | JEOL | JSM-6510 |
Referências
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in d....
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