Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide Ex Vivo

Resumo

Neste estudo, uma técnica microscópica de luz detalhada foi otimizada para observação e análise em tempo real do movimento dos cílios CPEC ex vivo, juntamente com um método de microscopia eletrônica para análise ultraestrutural.

Resumo

O plexo coróide está localizado na parede ventricular do cérebro, cuja principal função é a produção de líquido cefalorraquidiano. As células epiteliais do plexo coróide (CPECs) que cobrem a superfície do tecido do plexo coróide abrigam vários cílios únicos, mas a maioria das funções desses cílios ainda precisa ser investigada. Para descobrir a função dos cílios CPEC com referência particular à sua motilidade, um sistema de observação ex vivo foi desenvolvido para monitorar a motilidade ciliar durante os períodos embrionário, perinatal e pós-natal. O plexo coróide foi dissecado do ventrículo cerebral e observado em microscópio de contraste aprimorado por vídeo, equipado com óptica de contraste de interferência diferencial. Sob esta condição, um método simples e quantitativo foi desenvolvido para analisar os perfis móveis dos cílios CPEC por várias horas ex vivo. Em seguida, as alterações morfológicas dos cílios durante o desenvolvimento foram observadas por microscopia eletrônica de varredura para elucidar a relação entre a maturidade morfológica dos cílios e a motilidade. Curiosamente, este método pode delinear mudanças no número e comprimento dos cílios, que atingiram o pico no dia pós-natal (P) 2, enquanto a frequência de batimentos atingiu um máximo em P10, seguido por cessação abrupta em P14. Essas técnicas permitirão a elucidação das funções dos cílios em vários tecidos. Embora técnicas relacionadas tenham sido publicadas em um relatório anterior¹, o presente estudo se concentra em técnicas detalhadas para observar a motilidade e morfologia dos cílios CPEC ex vivo.

Introdução

Os cílios são projeções semelhantes a pêlos na superfície da maioria das células vertebradas, que têm atraído a atenção de pesquisadores médicos por causa de uma classe de doenças denominadas ciliopatias^2–4. Apesar da expressão ubíqua da organela, uma ampla variedade de funções ciliares tem sido relatada, incluindo motilidade e biossensoriamento. Por exemplo, cílios móveis na superfície mucoepitelial transportam muco⁵ e detritos epiteliais para a saída dos tratos, prevenindo doenças ao limpar a superfície do epitélio. Além disso, durante os primeiros períodos de desenvolvimento e estágios embrionários, os cílios regulam a proliferação de células-tronco⁶ e estão envolvidos na determinação da assimetria esquerda-direita do corpo dos vertebrados⁷.

As células epiteliais do plexo coróide (CPECs) são derivadas de células neuroepiteliais que cobrem a superfície do tecido do plexo coróide no cérebro, que desempenham papéis importantes na manutenção da homeostase do ambiente intracraniano pela produção de líquido cefalorraquidiano (LCR). Foi demonstrado anteriormente que os CPECs têm vários cílios imóveis que regulam a produção de LCR por meio de receptores acoplados à proteína G que estão especificamente concentrados nos cílios⁸. Embora esses cílios tenham sido considerados cílios imóveis quiescentes, descobriu-se que alguns cílios CPEC exibem motilidade transitória durante o período neonatal¹. Esse achado foi muito importante porque revelou que os chamados cílios imóveis não são necessariamente imóveis desde o início do desenvolvimento e podem exibir motilidade transitória durante janelas de tempo específicas, possivelmente em resposta a demandas e funções fisiológicas específicas⁹. Para descrever com precisão a natureza móvel dos cílios CPEC, é necessário desenvolver um sistema de observação ex vivo que englobe a análise dos perfis cinéticos exclusivos dos cílios CPEC.

Com relação à motilidade, embora vários relatórios técnicos tenham descrito observações dos cílios móveis do epitélio traqueal^5,10, flagelos móveis de célula única¹¹, os chamados cílios móveis convencionais¹² e cílios nodais¹³, métodos analíticos detalhados aplicáveis a estruturas relativamente onduladas, como o plexo coróide, não foram bem documentados até o momento. Além disso, é necessária uma alta resolução de tempo para analisar o movimento ciliar dos CPECs, nos quais câmeras caras de alta velocidade são indispensáveis. Para contornar essa necessidade e simplificar o monitoramento da motilidade ciliar de vários tipos de células, uma câmera de baixo custo e alta velocidade foi introduzida, e um método facilmente acessível e conveniente para registrar a motilidade dos cílios móveis, especialmente para descrever a velocidade e o padrão de movimento de cada cílio, foi desenvolvido¹. Além disso, o software de análise de imagem original "TI Workbench" foi usado aqui para facilitar a análise detalhada da motilidade. Coletivamente, este método fornece uma nova estratégia concisa para analisar o movimento ciliar em conjunto com a microscopia eletrônica de varredura correlativa (MEV), que pode ser adotada em uma ampla gama de pesquisas sobre cílio.

Protocolo

Os protocolos e uso de animais de laboratório foram aprovados pelos cuidados com os animais e uso comitês institucionais da Universidade de Yamanashi e Universidade de Waseda. Cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preparação CPEC

1. Preparar os seguintes aparelhos e materiais: um microscópio estéreo, de um modo preferido capaz de transmitir luz a partir do fundo; um par de fórceps Dumont relojoeiro (# 3 ou # 4), esterilizada por chama, tesouras operacionais em linha reta, esterilizada por chama; dois pratos de 10 centímetros de plástico estéreis contendo 20 ml de gelo-frio Leibovitz L-15 de forma; Pratos com fundo de vidro 35 milímetros contendo 2 ml RT Leibovitz meio L-15; Num copo de 100 ml contendo 70% de etanol; filhotes de rato recém-nascidos.
2. Resumidamente mergulhe um rato neonatal em 70% de etanol e eutanásia rapidamente por decapitação usando a tesoura operacionais.
3. Coloque a cabeça imediatamente em gelo frio Leibovitz L-15, na forma estéril 10 centímetros dish.
4. Remover a pele dos calvária usando o par de pinças de relojoeiro, abriu o crânio para expor o cérebro, e depois cortar os nervos cranianos para isolar todo o cérebro.
5. Transferir o cérebro para uma nova placa contendo gelada Leibovitz L-15 médio e observar ao microscópio estéreo, certificando-se que o cérebro está completamente imerso no meio.
6. Defina o aspecto dorsal do cérebro voltado para cima, e orientar o cérebro para que os bulbos olfatórios residir na posição de três horas (para pessoas destras). Segure o cérebro suavemente com a pinça na mão esquerda.
7. Usando a pinça de dissecação fina (Dumont # 3 ou # 4) na mão direita, corte do corpo caloso e debaixo do parênquima conectando os hemisférios cerebrais, ao longo da fissura longitudinal do cérebro.
8. Com cuidado, empurre os hemisférios cerebrais longe para os lados laterais e expor a fissura transversa do cérebro.
9. Separe os hemisférios por beliscar fora the parênquima entre o hemisfério e tálamo.
10. Retire cuidadosamente o plexo coróide ventriculares laterais que é anexado para o lado lateral do hipocampo pelo Affixa lâmina.
11. Transferir o plexo coróide isoladas para o prato fundo de vidro 35 milímetros contendo fresco Leibovitz meio L-15, e sobrepor o peso máximo (Lista de Materiais) com cuidado para segurar o tecido no lugar.

2. Imagens ao vivo da CPEC Cilia

1. Confirmar ultravioleta adequada (UV) e filtro (s) inferida (IR) de corte para bloquear luz inferior a 400 nm e acima de 700 nm, e que a densidade neutro (ND) os filtros (25% e 6%), são inseridos no caminho da luz do microscópio invertido.
2. Ajuste o foco da lente objetiva aproximadamente por olho, e então ajustar o condensador de modo que o centro e foco para estar de acordo com a iluminação Köhler. Inserir um contraste de interferência diferencial adequado (DIC) prisma, um elemento DIC, bem como elementos do analisador e polarizador na licaminho lutar para estar de acordo com a ótica DIC.
3. Ajustar o contraste de vista pela posição do prisma DIC modo que a estrutura da superfície do tecido é mais reconhecível. Se todos os cílios das células alvo são móveis, uma visão clara dos cílios móveis não podem ser obtidos por olho por causa do seu movimento.
4. Altere o caminho de luz para a câmera de vídeo e remova os filtros ND para aumentar o poder de luz.
5. Use a câmera no modo de focagem para ajustar o campo de visão e foco. Durante focagem, em que as imagens de vídeo são exibidas em tempo real no monitor, uma visão clara dos cílios móveis não está disponível.
6. Use a câmera em 200 Hz com um tempo de exposição de 0,1 ms para o período desejado (segundos a minutos). Após a aquisição da pilha de imagens, quadros únicos irá exibir estruturas ciliares claras. Se bordas ciliares são borradas, aumentar a taxa de quadros ou use um tempo de exposição mais curto.
7. Grave o movimento de CPEC cílios dentro de 25-60 minutos após a eutanásia em LeibovitzMeio L-15.

3. Análise do Movimento ciliar

1. Controlar manualmente batendo padrões de cada cílio no monitor do computador. Marcar posições de ponta ciliar em cada quadro com o ponteiro do mouse, que são montados para informação trajetória de cada cílio. Ou analisar a informação trajetória utilizando o mesmo software ou exportar para outras aplicações mais gerais para uma análise mais aprofundada. A eficiência deste passo de análise é descrito na discussão.
2. Classifique as trajetórias em dois modos de movimento, volta-e-vem de rotação, ou por olho.
3. Calcula-se a frequência de batimento ciliar (CBF), utilizando a seguinte fórmula: [CBF = (número de quadros por segundo) / (número médio de imagens para um único batimento)] ^14, que pode ser obtido a partir de um diagrama de ponta movimento ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiplos ciclos de batimento ciliar, porque outra cílios na mesma célula pode interferir com o movimento de cada cilium, resultando em irregularidade.
4. Para analisar a uniformidade angular do batimento ciliar eixos dentro de uma única célula, definem o ângulo θ batida para cada trajectória (Figura 4). Para trajetórias de vai-e-vem, se encaixam as posições da ponta dos cílios para uma linha reta, e definir θ como o ângulo da linha faz com eixo x. Para trajectórias de rotação, encaixam as posições de uma elipse, e definir θ como o ângulo do eixo maior da elipse faz com eixo x. Detalhes da instalação são descritos na secção de resultados representativos.
5. Para obter uma descrição quantitativa de cada trajetória, calcular generalizada proporção AR. Resumidamente, rodar a trajectória por - θ e definir AR como a relação entre as larguras da distribuição ao longo - x e y -axes (Figura 4B). Detalhes são mostrados na seção Resultados Representante, ea interpretação, Significado ea limitação do parâmetro são descritos na discussão.

4. Preparação de Amostras para SEM

Nota: SEM é um importante método para avaliar o estado dos cílios em CPECs de uma forma abrangente. Para preparar as amostras para SEM, um procedimento padrão reportada anteriormente ¹⁵ é empregue com ligeiras modificações.

1. Antes de dissecação do tecido a partir do cérebro, preparar o fixador em um frasco de vidro de 5 ml com uma tampa de polietileno. O fixador é constituído por 2% de paraformaldeído, glutaraldeído a 2,5% (metade da solução de Karnovsky ¹⁶⁾ em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
2. Dissecar o tecido do cérebro, tal como descrito no passo 1.
3. Resumidamente enxaguar o tecido isolado com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) numa nova placa e, em seguida, fixar o tecido no fixador no frasco de vidro, durante 1 h à temperatura ambiente. Use pipetas de transferência descartáveis ​​e manipular os espécimes gently. Depois de enxaguar em HBSS, o tecido torna-se pegajosa.
   1. Para transferir as amostras para a solução fixadora, lentamente expulsar uma pequena quantidade de solução que continha o tecido a partir da pipeta de transferência como uma gota e adicionar ao fixador.
4. Após a fixação, descartar o fixador e lavar o tecido com tampão fosfato de três vezes.
5. Mergulha-se o tecido numa solução de sacarose a 10% para lavar os aldeídos restantes. Para assegurar a eliminação total de aldeídos, imergir as amostras na solução durante 10 min e, em seguida, repetir duas vezes com sacarose a 10% fresco. Este passo é importante para garantir a boa pós-fixação em etapas subseqüentes.
6. Mergulha-se o tecido numa solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão de fosfato durante 30 min e, em seguida, colocar em gelo para pós-fixação. Julgar o grau de osmification pela cor da amostra: quando os aldeídos são completamente removidas, a amostra é preto.
7. Lave as amostras pós-fixadas de tecido extensivamente com duplo Distilled água várias vezes.
8. Desidratar as amostras por imersão em concentrações graduadas de etanol, geralmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, e 100%, durante 10 min cada. Obtenção de etanol anidro, colocando peneiras moleculares em etanol 99,5% de uma garrafa recém-adquirido. Repita desidratação com etanol anidro três vezes.
9. Coloque as amostras desidratadas em acetato de isoamilo, um reagente para a substituição ponto crítico de secagem, durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes. Este reagente e evapora-se rapidamente a amostra pode tornar-se seca, resultando na destruição pela tensão superficial. Portanto, não secar a amostra completamente.
10. Após a última troca de acetato de isoamilo, remover a maior parte do solvente, imediatamente embrulhar o frasco de vidro aberta com uma folha de alumínio e coloque o frasco em gelo seco. Utilizando uma agulha ou uma pinça fina, fazer vários orifícios na folha que cobre a boca do frasco, de modo que o dióxido de carbono líquido flui facilmente para dentro do frasco no secador de ponto crítico. Prossiga para a próxima etapao mais rápido possível.
11. Nesta etapa, minimizar a transição de acetato de isoamilo na câmara do secador, mas não deixe que a amostra secar completamente antes de secar ponto crítico. Além disso, não deixe a amostra em gelo seco para um desnecessariamente muito tempo para evitar a formação de geada no frasco.
12. Transferir os frascos de vidro envolto com folha de alumínio contendo as amostras de tecido em secador de ponto crítico a que assegura a estrutura da superfície do tecido permanece intacta, enquanto a remoção da água contida no tecido. Informações pormenorizadas sobre a operação do secador de ponto crítico pode ser obtido a partir de instruções do fabricante.
13. Lidar com as amostras cuidadosamente usando um palito para minimizar danos mecânicos. As amostras de tecidos secos resultantes são frágeis. Monte as amostras em bases metálicas e revestimento com ouro-paládio usando uma pulverização catódica de íons.

5. Observação por SEM

1. Observe por SEM e gravar imagens com uma câmera digitalequipado com microscópio eletrônico de varredura.
2. Transferir os dados de imagem digitais para um PC para análise.

Resultados

Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1, incluindo imagens dos dispositivos.

Observações de movimento ao vivo de CPECs

Filme 1 mostra um filme de CPECs isoladas de um rato perinatal, e Filme 2 mostra uma visão expandida das imagens em filme 1. Deve-se notar que as pontas ciliares individuais são menos claras nas imagens fixas comparados com os dos filmes. A Figura 2

Discussão

Perspectivas deste método

Embora a técnica aqui descrita não proporciona uma análise mais detalhada dos cílios do que os métodos previamente publicados, o significado desta técnica reside na simplicidade do sistema e relação custo-eficácia, que pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo de rastreio de motilidade ciliar ex vivo. Em particular, TI Workbench fornece uma interface simples e fácil de usar que permite aos pesquisadores observar e analisar a motilidade ciliar mais facilm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes necessários
para imagens de células vivas
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
para preparação de MEM
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Solução salina balanceada de Hank	Life Technologies	14170112
paraformaldeído	Merck	1040051000
glutaraldeído	Nacalai tesque	17003-05
acetato de isoamila	Nacalai tesque	02710-95
Peneiras Moleculares 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	de etanol anidro
salina (PBS)	Tampão de fosfato Sigma-Aldrich	D1408
, 0.1 M			Para fazer 100 ml, misture 19.0 ml de 0.1  M NaH2PO4 e 81,0 ml de 0,1  M Na2HPO4
fosfato monossódico (di-hidratado)	Nacalai tesque	31718-15
fosfato dissódico (anidro)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
tetróxido de ósmio	Nisshin EM	300
gelo
[header]
Ferramentas e materiais para dissecação
para imagens ao vivo e preparação para SEM
microscópio estéreo	Toalha
Prato
de 10 cm 100 ml copo
tesoura de operação reta	Sansyo	S-2B
pinça de relojoeiro	Dumont	No.DU-3 ou -4, INOX
para imagens de células vivas
prato de fundo de vidro	Matsunami Glass	D110300
para preparação de MEM
folha
frasco de vidro de 5 ml com tampa de polietileno	Pipeta de transferência Nichiden Rika-Glass	PS-5A
	Samco Scientific	SM251-1S	para
palito
pulverização catódica de íons de transferência de amostra com ouro-paládio	Hitachi	E-1030
secador de ponto crítico	Hitachi	HCP-2
[cabeçalho]
Equipamentos e materiais microscópicos
para imagens de células vivas
invertido	Olympus	IX81
Caixa de mercúrio de 100 W e fonte de alimentação	Olympus	U-ULH e BH2-RFL-T3
Lâmpada de mercúrio de 100 W	Condensador Ushio	USH103D
DIC, n.a. 0,55	Olympus	IX-LWUCD
	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 e obturador manual VMM-D1	podem ser usados.
filtro passa-banda (400-700  nm, Φ 45  mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
Filtro ND (Φ 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combinação de filtros ND de 25% e 6% são usados
lente objetiva (imersão em água) com elemento DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 com câmera de vídeo de alta velocidade IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ Taxa de quadros de 200 Hz e tempo de exposição de 1 ms
Software de aquisição / análise de imagem	Software interno	TI Workbench	capaz de aquisição em altas taxas de quadros.
PC para controle / análise	de	Mac Pro
	Meiritsu Seiki	AD0806
peso para tecido	Warner Instruments	kits de ancoragem de fatia	Pode ser feito com malha de nylon colada a um U em forma de U esmagado Φ 0,5  mm fio de platina.
vidro de cobertura (peso alternativo para tecido)	Matsunami	feito sob encomenda	Um vidro de cobertura pode ser usado como peso de tecido.
para SEM
inverted microscópio	Olympus	IX81
microscópio eletrônico de varredura	JEOL	JSM-6510