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Artigo de método

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

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DOI:

10.3791/53032

⸱

21 de agosto de 2015

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

Neste artigo

Resumo

Estimulação do nervo vago (VNS) emergiu como uma ferramenta para induzir plasticidade sináptica alvejado na parte frontal do cérebro para modificar uma série de comportamentos. Este protocolo descreve como implementar VNS para facilitar a consolidação da memória de extinção do medo.

Resumo

Extinção descreve o processo de atenuação das respostas comportamentais a estímulos neutros quando eles não fornecem mais o reforço que vem mantendo o comportamento. Há uma estreita correspondência entre o medo e a ansiedade humana e, portanto, os estudos de aprendizagem da extinção podem fornecer informações sobre a natureza biológica dos transtornos relacionados à ansiedade, como o transtorno de estresse pós-traumático, e podem ajudar a desenvolver estratégias para tratá-los. A pesquisa pré-clínica visa ajudar no aprendizado da extinção e induzir plasticidade direcionada em circuitos de extinção para consolidar a memória recém-formada. A estimulação do nervo vago (VNS) é uma abordagem poderosa que fornece liberação temporal e específica de neurotransmissores em tempo apertado, resultando na modulação de redes neuronais envolvidas em uma tarefa contínua. O VNS aumenta a consolidação da memória em ratos e humanos, e o emparelhamento do VNS com a exposição a pistas condicionadas aumenta a consolidação do aprendizado de extinção em ratos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a preparação de peças feitas sob medida e os procedimentos cirúrgicos necessários para VNS em ratos. Usando este protocolo, mostramos como o VNS pode facilitar a extinção de respostas de medo condicionado em uma tarefa de condicionamento de medo auditivo. Além disso, fornecemos evidências de que o VNS modula a plasticidade sináptica na via entre o córtex pré-frontal medial infralímbico (IL) e o complexo basolateral da amígdala (BLA), que está envolvido na expressão e modulação da memória de extinção.

Introdução

Medo condicionado clássico fornece um modelo animal amplamente utilizado para estudar a função biológica de perturbações de ansiedade. Durante o condicionamento do medo, um estímulo aversivo (o estímulo não condicionado, EUA, por exemplo, um choque eléctrico na pata) é apresentada em conjunto com um estímulo neutro, tal como um tom e / ou um quadro (o estímulo condicionado; CS). Durante o condicionamento do medo, as associações entre o CS e os EUA são formadas. Eventualmente, a apresentação do CS sozinho induz uma resposta de medo (resposta condicionada; CR). Em extinção medo, o CS é apresentada repetidamente na ausência de os EUA, fazendo com que o CR a diminuir gradualmente 1. Assim, a extinção do medo condicionado é um processo ativo em que as respostas comportamentais medo de estímulos neutros são atenuados quando já não prever resultados aversivos. Extinção de respostas condicionadas requer a consolidação de novas memórias que competem com as associações aprendidas. Uma característica dos transtornos de ansiedade é impaextinção Ired 2-4. Assim, a extinção do medo condicionado em modelos animais serve como um paradigma importante tanto para a aprendizagem inibidor e como um modelo de terapia comportamental para transtornos de ansiedade humanos 5,6.

Porque existe uma estreita correspondência entre o medo ea ansiedade humana, pensa-se que estes estudos podem fornecer insights sobre a natureza biológica de distúrbios relacionados com a ansiedade como o transtorno de estresse pós-traumático e ajudará a desenvolver estratégias para tratá-los. Um objetivo importante da pesquisa pré-clínica é ajudar aprendizagem extinção e para induzir plasticidade alvejado em circuitos de extinção para consolidar a aprendizagem extinção. Estimulação do nervo vago (VNS) é uma abordagem neuroprosthetic minimamente invasivo que pode ser usado para fornecer modulação temporal e específico do circuito apertado de áreas do cérebro e sinapses envolvidos em uma tarefa contínua. Uma série de estudos recentes do grupo de Michael Kilgard na Universidade do Texas em Dallas temmostraram que o emparelhamento VNS com estímulos sensoriais ou motoras discretas (por exemplo, um tom ou um puxão alavanca) é altamente eficaz na promoção da plasticidade cortical para tratar o zumbido 7, ou para superar os défices motores após acidente vascular cerebral 8-10. Além disso, não contingente VNS que ocorre dentro de um intervalo de tempo curto depois de saber semelhante promove plasticidade cortical e melhora a consolidação da memória em ratos e em seres humanos 11-13.

Considerando o papel do nervo vago na via parassimpático, não é surpreendente que possa participar na modulação da plasticidade sináptica e memórias. Altamente eventos emocionais tendem a produzir memórias mais fortes do que as memórias não-emocionais. Isto é provavelmente devido à influência dos hormônios do estresse sobre a consolidação da memória. Pós-treino administração da adrenalina hormônio do estresse aumenta a consolidação da memória em animais humanos e não-humanos, mas a adrenalina não atravessar a barreira sangue-cérebro-barreira 14, 15 . Portanto, a liberação de adrenalina induzida por estresse deve impactar o cérebro indirectamente para melhorar a consolidação da memória. Fortes evidências sugerem que o nervo vago pode ser o elo entre a adrenalina circulante eo cérebro. Miyashita e Williams 16 acharam que a administração sistêmica da adrenalina aumentou disparo do nervo vago, e aumento dos níveis de norepinefrina na amígdala 17. A administração sistémica de adrenalina não melhora a consolidação da memória quando os receptores β-adrenérgicos são bloqueados na amígdala 18 sugerindo que o nervo vago desempenha um papel importante no caminho que se transforma experiências emocionalmente carregadas em memórias de longo prazo.

Assim, o emparelhamento com VNS treinamento tem o potencial de melhorar as mudanças do cérebro que suportam a consolidação da memória e exposição a estímulos condicionados, na ausência de reforço aumenta a consolidação da aprendizagem extinção em ratos 19,20. Aqui descreve-se a utilização de um VNSsa ferramenta para promover a plasticidade cortical e facilitar a extinção de uma resposta de medo condicionada.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e eles foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade do Texas em Dallas animal Institucional.

1. Construção de VNS Punhos

  1. Criar uma ferramenta de perfuração por serrar a ponta de uma agulha 22 G ½.
  2. Execute o fim agora sem corte dos 22 ½ G agulha sobre um arquivo de metal várias vezes para achatá-lo. Segure a agulha em um ângulo de 45º para o arquivo e executá-lo várias vezes sobre o arquivo enquanto gira-lo. Isso fará com que o metal para tornar-se mais fino e enrolar para dentro. CUIDADO: Insira a ponta do bisturi na extremidade cortada da agulha e girar com alguma força para baixo para desfraldar o metal.
  3. Use binóculos de ampliação para as etapas restantes na seção 1.
  4. Utilizando um escalpelo (10 ou 15 da lâmina) cortar quatro milímetros segmentos de tubagem.
  5. Coloque um segmento de quatro milímetros ao longo de umbroca pequena ou outra ferramenta de forma semelhante. Isto é para manter o tubo no lugar enquanto está a ser manipulado.
  6. A broca 4 orifícios na tubagem (Figura 1A). Furos devem fazer os quatro pontos de um 2 milímetros por 2 milímetros quadrados e deve ser limpa, sem arestas.
    NOTA: A ferramenta de perfuração tem de ser afiadas (passo 1.2) a cada 2 ou 3 buracos. Dificuldade com este passo é quase certamente devido a uma ferramenta de perfuração que não é nítida o suficiente.
  7. Com o tubo ainda sobre a broca, usar um bisturi para cortar o tubo longitudinalmente entre os orifícios, de modo que dois furos acabam em ambos os lados do corte (Figura 1B).
  8. Usando uma agulha de costura e fio de sutura, passa através dos orifícios de sutura para criar o equipamento para o posicionamento final da braçadeira em torno do nervo vago. Comece com a agulha no interior da bainha e passá-la através de um dos furos, em seguida, voltar através do orifício adjacente do lado de fora (Figura 1C). Amarre a thread juntos ~ 2 cm do plástico de modo que o tubo e fio fazer um triângulo. Permitir ~ 8 centímetros da linha após o nó e guarnição. Repita o processo para os buracos no lado oposto do corte. O tubo está agora pronto para ser ligado.
  9. Prepare os fios de algemas.
    1. Cortar o fio de irídio platina em 70 segmentos mm.
    2. Usando a melhor dica para a tocha de jóias, criar uma chama afiado com o azul centro que é tão refinado quanto possível e usá-lo para tirar ~ 1 cm do revestimento plástico do fio. Aplique o centro azul da chama ao fim listrada do fio para criar uma pequena bola. Aplicar o centro azul da chama a vários pontos da parte descarnada para fundir os sete fios juntos. O fio nestes pontos aparece a dobrar.
    3. Na extremidade oposta do fio, aplicar o centro azul da chama ao fim para criar uma pequena bola. Minimizar a decapagem plástico nesta extremidade.
  10. Conectar o manguito (Figura 1D).
    NOTA: Steps no ponto 1.10 deve ser feito sob binóculos de ampliação.
    1. Tape o punho para baixo usando os fios de modo a que está orientado com o corte funcionando horizontalmente. Puxe os fios rígido para que o manguito é puxado aberto e fita adesiva para baixo os fios.
    2. Segure a extremidade do lado enrolado listrada do fio preparado com # 5 fórceps e empurre através do orifício inferior direito. Puxar a pinça para fora do furo, deixando a extremidade do fio no meio do punho.
    3. Re-agarrar o fim enrolado do fio descascado (agora no meio do manguito) e empurrá-lo através do orifício superior direito. Puxar a pinça para fora do furo, deixando o fio passou completamente através da braçadeira e solto no lado superior do punho.
    4. Re-agarrar o fim enrolado do fio descascado (agora fora do manguito na parte superior) e empurre-a de volta através do orifício superior direito do interior. Continue fazendo isso até que o fio é firmemente no lugar: teste puxando na extremidade oposta do fio.
      NOTA:Durante este processo, é crítico para diferenciar as porções isoladas / descascada do fio. O fio que está posicionada na última análise 'calha' do punho deve ser removido, mas tudo abaixo dos orifícios de fundo (fora do balonete na extremidade inferior) deve ser isolada. Isto assegura o fornecimento de corrente apenas para o nervo vago.
    5. Agarrar a extremidade do lado enrolado isolado e empurrá-lo através do orifício inferior direita a partir do interior da manga, em torno de looping que uma vez.
    6. Repita os passos 1.10.2 - 1.10.5, no lado esquerdo da braçadeira de modo que dois fios de acabar fixo ao tubo, uma do lado direito e outra do lado esquerdo.
    7. Coloque um alfinete de ouro no braço da mão de ajuda com o buraco virado para cima. Encha o buraco com fluxo.
    8. Soldar a extremidade isolada do cabo (agora ligado ao punho) para o pino.
    9. Permitir que a solda arrefecer, e em seguida fundir de novo. Isto assegura uma boa ligação entre a extremidade do fio e a inside do pino. Aplique mais de solda, se necessário. Repita o procedimento para segundo fio.
    10. Com as pontas de correr para a direita, marcar a parte superior do punho com marcador permanente. Também marca o alfinete de ouro ligado ao topo de chumbo.

2. Construção de headcap para VNS Input do Site

  1. Cortar 30 mm segmentos de 26 AWG fio de cobre. Tira uma pequena porção em cada extremidade.
  2. Corte a extremidade estreita off pinos de ouro soltas e solda final listrada do fio à extremidade cortada do alfinete de ouro. Criar dois compostos fio / pino para cada local de entrada desejado. Coloque um conector nas mãos ajudando e soldar a extremidade do fio de um fio de composto / pino para a cada um dos dois dentes fluxado do conector (Figura 2G).
  3. Mark um dos fios com sharpie. Durante a cirurgia, a posição do implante com o rostral fio marcante com o fio isolado.

3. VNS Cirurgia

  1. Criar ferramentas de vidro sob encomenda para manuseio de vagus nervo durante a cirurgia.
    1. Use de vidro de borossilicato para puxar uma micropipeta de modo que tenha uma longa ponta afunilada. Se não está disponível extrator pipeta, quebrar o vidro para criar uma borda mais.
    2. Segure a extremidade não afilada da pipeta com um pano grosso (para evitar queimaduras) e pressione a / final quebrado cônico em uma superfície resistente ao fogo suave durante a aplicação da chama azul da tocha jóias para a extremidade cónica. O vidro vai dobrar, uma vez que é pressionado para dentro da superfície. Aplicar chama até um gancho ou formas forma J.
  2. Procedimentos cirúrgicos VNS
    1. Reúna e esterilizar todas as ferramentas. Prepare a área cirúrgica sanitária, aquecida.
    2. Anestesiar animais com cetamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Avaliar a profundidade do plano anestésico, monitorando vocalizações do animal e de abstinência-reflexos em resposta aos pés e / ou cauda beliscar.
    3. Raspar a parte superior da cabeça e do lado esquerdo do pescoço do animal. Proteger os olhos do animal com a mineradoraóleo al ou pomada. Aplicar solução de iodo a limpeza com gaze e álcool, em seguida, com gaze para as áreas raspadas. Repetir uma vez.
    4. Injectar 0,05 ml marcaína subcutaneamente no topo da cabeça e permitir que o bólus se dispersar ao mesmo tempo a colocação do animal no instrumento estereotáxico.
    5. Usar um bisturi para fazer uma incisão na pele sobre o crânio para expor ambos lambda e bregma. Prepara-se uma via para a braçadeira, utilizando fórceps rombas para túnel subcutaneamente a partir do local de incisão para o lado esquerdo em frente da orelha do lado esquerdo do pescoço.
    6. Puxe o local da incisão aberta com hemostats. Usando cotonetes, aplicar o peróxido de hidrogênio ao crânio exposta para remover qualquer tecido remanescente.
    7. Usando um bisturi, faça dois furos de arranque rasas no crânio para colocar parafusos de fixação. Eles devem ser colocados longe o suficiente para permitir espaço para o implante, mas não muito perto do tecido circundante. Evite colocar parafusos diretamente na linha média.
      1. Com vigorps e chave de fenda, dirigir um parafuso de osso em ambos os buracos. Os parafusos devem ser apertados nos orifícios, com as tampas de 2 - 3 mm acima da superfície do crânio para permitir espaço para o acrílico para preencher sob e em torno dos parafusos.
    8. Encher o espaço debaixo, em torno, e entre os parafusos com uma pequena quantidade de acrílico, evitando o tecido circundante. Em seguida, coloca uma maior quantidade do acrílico no meio do crânio entre os dois parafusos.
    9. Agarre o implante de modo que o fio marcado é orientada rostral ao fio sem marcação e rapidamente colocar o implante no acrílico, tomando cuidado para não ficar acrílico para os pinos de ouro, a área de fecho, ou o local de entrada no topo. Uma vez posicionado deixar solidificar ~ 5 min até secar. Isto também pode ser feito usando o braço de suporte para o estereotáxico. Preencha todas as rachaduras ou lacunas entre o implante eo crânio com uma baixa viscosidade de mistura de acrílico. Deixe secar.
    10. Use binóculos de ampliação para as etapas restantes na seção 3.2.
    11. Remover the animais do instrumento estereotáxico. Colocar o animal em seu lado direito, girando-o levemente para a posição ventral.
    12. Fazer uma pequena incisão de aproximadamente sobre a veia jugular esquerda. O osso da mandíbula e clavícula deve ser mais ou menos equidistante ao local da incisão. Alargar a incisão utilizando uma dissecção romba até que a camada muscular é atingido. Os Sternomastoid, esterno hioideo, e omo-hióideo músculos devem estar visíveis. Use afastadores musculares para manter o local aberto.
    13. Continue dissecação romba ao longo dos sulcos naturais entre os músculos. Olhe para a pulsação da artéria carótida. A posição através do músculo para a pulsação irá revelar a artéria carótida. Puxe os músculos de volta com o retrator muscular. O invólucro que contém a artéria carótida também contém o nervo vago. Cuidadosamente neutralizar dissecar a bainha com a tesoura.
    14. Identificar o nervo vago. É o maior dos nervos na bainha carótida e é, geralmente, para o lado esquerdo do animal da artériamas pode ser encontrado em qualquer lado. Mudar para as ferramentas de vidro personalizados e separar o nervo vago a partir da artéria carótida. O nervo deve estar livre de qualquer outro tecido durante pelo menos 5 mm.
    15. A partir da incisão na cabeça, utilizando-se as roscas no lado oposto do manguito as ligações, puxar a manga através do túnel subcutâneo anteriormente com fórceps hemostáticos ou pequenos. Empurra-o através do tecido no local de incisão no pescoço.
    16. Suavemente levantar o nervo-se usando as ferramentas de vidro e empurrar os fios do lado oposto do manguito os fios sob o nervo. Puxe os fios durante todo o tempo, tomando cuidado para não esfregar contra o nervo. O balonete deve ser imediatamente adjacente ao nervo.
    17. Verifique se o manguito está orientada com o 'top' lado marcado superior. Largar o nervo para o meio do manguito. O nervo deve agora se encontram em ambos os fios na calha do manguito (Figura 2B). Amarre os fios em conjunto para fechar o punho.
    18. No headcap, conecte os pinos ligados à braçadeira para os pinos de ouro no local de entrada de estimulação. Conecte o pino marcado para o alfinete de ouro anexado ao dente mais anterior no site entrada simulação.
    19. Para verificar que a braçadeira estimula adequadamente o nervo vago, realizar um teste de cessação de respiração por, o estimulador de ligação para o local de entrada de estimulação sobre o headcap e executando estimulação (0,2 mA, 60 Hz, até 10 segundos). A respiração deve parar momentaneamente e freqüência cardíaca deve cair, verificando função manguito.
    20. Prenda os pinos no local de entrada estimulação com acrílico. Cobrir os fios e verifique se os pinos e fios expostos não provocar curto-circuitos. Use acrílica para alisar todas as colisões ou para preencher eventuais lacunas. Deixe secar.
    21. Sutura fechada ambos os locais de incisão. Injectar 0,05 ml por via subcutânea marcaína perto do local da incisão no pescoço. Aplicar pomada antibiótica à incisão sites. Opcionalmente, deixe um conector macho no lugar no site de entrada para estimulaçãoevitar danos ou obstrução durante o processo de cura.
    22. Tratar com antibiótico e siga cuidados pós-operatórios padrão, incluindo analgesia adequada. Retorno animais para instalação de alojamento dos animais depois que eles recuperar a mobilidade. Permitir 5 dias para recuperação. Para assegurar a longevidade máxima e função do headcap, animais domésticos individualmente durante o resto da experiência.
      NOTA: ratos Sham-VNS submeter o mesmo a cirurgia, no entanto, o circuito é concebido para curto no plano da headcap (isto é, um headcap é implantado e o nervo vago é separado a partir da artéria carótida, mas sem balonete eléctrodo é colocado em torno do nervos).

4. Auditivo Medo Condicionado

NOTA: Este protocolo medo condicionado é mais intensa do que a maioria 21 porque o objetivo desses experimentos é aumentar extinção. Com medo condicionado leve que pode ser facilmente extinto, um efeito chão pode obscurecer esse aprimoramento.

  1. Casa animais em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz com acesso ad libitum a comida e água. Lidar com os animais diariamente durante a recuperação da cirurgia.
  2. Defina-se o aparelho de condicionamento e ensaio, que consiste de uma caixa de operante alojado numa câmara atenuada-som (Figura 2C). A caixa tem paredes operante de plástico transparente, de 20 x 20 x 20 cm, e tem um chão de grelha de aço inoxidável, que está ligado a um gerador de choque nas patas. Use uma casa de luz branca para iluminar a câmara para gravação de vídeo. Use um kHz 9, 85 dB SPL tom como o estímulo condicionado.
  3. Comportamento registro usando uma câmera digital localizada no interior da câmara, acima da caixa operante. Ver e monitorar a sessão em um computador localizado fora da sala de comportamento. Salvar vídeos para posterior análise.
  4. Wipe câmaras com etanol a 70% antes e depois de cada sessão para eliminar pistas olfactivas.
  5. Medo-condicionar os ratos de 2 dias (Figura 3A). Confirme que os ratos não estão emalternadamente medo do tom, apresentando 5 tons (9 kHz, 85 db, 30 seg) no primeiro dia. Certifique-se de que os níveis de congelamento são desprezíveis.
    1. Siga as apresentações iniciais com tom tom 8-footshock (1 seg, 0,5 mA) pares em cada um dos dois dias consecutivos. Repita os emparelhamentos tom-choque nas patas novamente no segundo dia. Varie a inter-estímulo-intervalo (ISI) entre 2 e 4 min, com média de 3 min para cada julgamento. Randomizar o ponto em que ocorre durante o choque do tom.
  6. No terceiro dia, testar a força da associação tom / choque. Jogue 4 tons com um ISI de 3, 4, ou 5 min (4 min média) na ausência de choques nas patas e registrar o comportamento de congelamento dos animais durante as apresentações de tom e durante as inter-estímulo-intervalos como medidas da resposta de medo condicionado (CFR).
  7. No dia 4, começar a treinar com VNS extinção ou Sham VNS.
    1. Tapar os ratos para o estimulador, inserindo os conectores macho do stimulator no sítio de entrada de estimulação. Colocar os animais na câmara (Figura 2A, 2C). Defina o estimulador para 0,4 mA, 500 mS largura de pulso em 30 Hz. Definir estimulação para uma duração total de 30,15 segundos, a partir de 150 ms antes do início do tom. Jogar animais 4 tons (como na etapa 4.6) e emparelhar cada apresentação tom com VNS ou Sham VNS.
  8. Periodicamente testar a integridade elétrica do manguito e entrada de site usando um osciloscópio.
    1. Ligue o animal como normal e em dividir a saída do estimulador para o osciloscópio.
    2. Defina o intervalo no osciloscópio como -20 V a +20 V e executar a estimulação. A forma de onda da estimulação de 30 Hz deve ser visível no osciloscópio. Estímulos superiores a 10 V em tamanho indicam alta impedância e um manguito não está funcionando corretamente ou conexão no local de entrada de estimulação.
  9. Para testar o efeito sobre a formação de VNS extinção executar um segundo teste CFR (como no passo 4.6)no dia 5. Anote o tempo gasto congelamento durante as apresentações de tom e compare com o congelamento da linha de base registada durante o primeiro teste CFR (passo 4.6).
  10. Analisar os vídeos usando um observador independente que é cego para as condições de tratamento. Medir o tempo gasto congelamento durante as apresentações do tom usando um cronômetro. Congelamento é definida como a imobilidade completa, durante o qual o rato apresenta respiração rápida, cabeça baixa, e se espalhou patas 22. A análise do comportamento de congelação pode ser dividida em duas fases: durante a apresentação tom e durante o intervalo inter-estímulos.

5. In Vivo As gravações de campo Potenciais evocados

Nota: Esta etapa é opcional. Potenciais de campo evocada (EFPs) são registados 24 horas depois de testes de recuperação (Dia 5) em ratos anestesiados com isoflurano montados num aparelho estereotáxico, seguindo procedimentos padrão 23,24.

  1. Reúna e esterilizar todas as ferramentas.
  2. Induzir a anestesia com isoflurano (5% em 100% de oxigénio, caudal 1l / min) numa câmara de plástico transparente. Avaliar a profundidade do plano anestésico, monitorando vocalizações do animal e de abstinência-reflexos em resposta aos pés e / ou cauda beliscar. Use óleo mineral ou pomada para proteger os olhos.
  3. Injectar 0,05 ml marcaína subcutaneamente no topo da cabeça e permitir que o bólus se dispersar. Usar um bisturi e hemostáticos para remover o headcap do crânio. Use o mínimo de força possível para evitar obscurecer bregma.
  4. Colocar o animal no instrumento estereotáxico. Usar um bisturi para alargar a incisão para expor ambos lambda e bregma. Manter plano anestésico com isoflurano (3% em 100% de oxigénio, caudal de 1 L / min) através de um cone de nariz.
  5. Faça furos no crânio acima do córtex pré-frontal infralimbic (IL) ea amígdala basolateral (BLA). Abaixe um microeletrodos de vidro (KCl 2M; 1-2 MOhms resistência) na BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4.9 de bregma) e um stimulateléctrodo de iões para a região de IL do córtex pré-frontal medial (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 a partir da bregma) (Figura 4A).
  6. Estimular a IL evocar EFPs no BLA. Os dados apresentados na Figura 4 foi adquirida com as seguintes definições: Um pulso de estimulação de 0,3 mseg de duração, utilizando uma intensidade de estimulação que correspondeu a 40% da intensidade de corrente mínima que provocou uma resposta máxima de campo (com base em uma curva de entrada-saída determinada antes recolha de dados de base), entregue a cada 15 segundos.
  7. Coletar dados de base para um mínimo de 10 - 15 min antes de induzir plasticidade sináptica.
    NOTA: O protocolo utilizado para evocar a plasticidade sináptica irá variar de acordo com os requisitos das experiências e deve ser cuidadosamente seleccionada por cada experimentador. Os dados na Figura 4C mostra mudanças na EFP seguinte três rajadas de 100 pulsos a 50 Hz (2 seg), com intervalos inter-burst 20 seg na intensidade mínima corrente que evocamd a resposta máxima campo.
  8. Medir a amplitude de EFP como a diferença entre a média de uma janela de 5 ms antes de o artefacto de estímulo e a média de uma janela de 5 mseg em torno de 20 - 25 mseg após o artefacto de estimulação, correspondente ao pico negativo do campo potencial. Normalizar os dados da linha de base e para definir a média de uma linha de base de 10 minutos como 100%. Use as amplitudes EFP médios de outro período de 10 minutos após a indução de plasticidade (por exemplo, 40 - 50 minutos após a indução) para avaliar as mudanças de longo prazo na amplitude EFP.
  9. Após o fim da gravação decapitar o animal anestesiado e extrai-se o cérebro. Prepare tecido para verificação histológica de colocação do eletrodo.

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Resultados

Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através da utilização de VNS em combinação com a aprendizagem extinção para reduzir a expressão da resposta de medo condicionado em ratos. Para Dias 1 e 2 (Auditivo Medo Condicionado), os ratos foram treinados em uma tarefa auditiva medo condicionado em choques nas patas que foram pareados com um tom. No Dia 3 (Pré-Tratamento de teste), tons foram apresentados na ausência de choques nas patas para medir os níveis de congelamento e inferir aquisição respost...

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Discussão

Nós apresentamos aqui um protocolo que é usado para facilitar a extinção do medo condicionado durante uma única sessão de exposição a estímulos condicionados 19 e modular a plasticidade na via entre o córtex infralimbic ea amígdala basolateral que podem mediar a aprendizagem extinção 20. Um passo crucial para o sucesso deste protocolo é a entrega dos VNS durante o treinamento de extinção. Portanto, um cuidado especial deve ser dada para a construção dos eléctrodos de punho e a colocação da manga em...

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Divulgações

Os autores não têm interesses ou conflitos conflitantes.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde Mental MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Álcool
AtropinaFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Peróxido de hidrogênio CVS209478
Cetamina Henry Schein 1129300
MarcaínaHenry Schein6312615
Óleo MineralCVS152355
NeosporinaCVS629451
OxigênioHome Depot304179
PenicilinaFisherPENNA-10MU
PropanoHome Depot304182
XilazinaHenry Schein 4019308
Tools
SmithEquipment 23-1001D
Agulha de CosturaWalgreens441831
#5 Fórceps (2)Ferramentas de Ciência Fina11254-20
Ferro de SoldaHome Depot 
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Placa de Circuito Boom Microscópio Estéreo + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Ferramentas de Ciência Fina10003-12
Lima de MetalHome Depot6601
RéguaHome Deopt202035324
Hemostáticos Curvos Fine Science Tools130009-12
Tesoura FinaFine Science Tools14058-09
EspátulaFine Science Tools
Chave de fenda pequenaHome Depot646507
Sistema de retração do fixador magnéticoFerramentas Fine Science18200-04, 18200-01, 18200-05
Almofada de aquecimentoWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
GramposSharpie125328
Pinça de AnelFerramentas de Ciência Fina11103-09
Ferramentas de Vidro Micropipeta Personalizadas (forma J e Reta) - Vidro borossilicatoSutter InstrumentB150-110-10
Pinça Adson Ferramentasde Ciência Fina11006-12
Tubulação de Punhos
Braintree Scientific IncMRE-065
Fio de Irídio de PlatinaMedwire10IR9/49T
Pinos de OuroMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Fio de SuturaHenry Schein100-5797
Agulhas de 22 GFisher 14-815-525
Fita de PapelFisher 03-411-602
SolderHome Depot327793
Flux 300142Home Depot
, 10 ou 15Stoelting52173-10
Tubulação de Laboratório Silastic .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
Peças de Conector de
Cabeça (macho)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Peças de Headcap (fêmea)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets DentalA-M Systems525000, 526000
Gramposde Fio de Cobre Sólido de 26 Gauge1016882  
Parafusos de Cirurgia
OssosStoelting+CB33:C6151457
Lâminas de Bisturi, 10 ou 15Stoelting52173-10
Seringas de 1 ml AgulhasFisher14-826-261
22 G Fisher 14-815-525
27 G AgulhasFisher14-826-48
2" x 2" GazeFisher22-362-178
CotonetesFisher19-120-472
Almofadas para FilhotesPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Câmara e Ambiente Comportamental 
Armário Base Frontal de Metal Husky (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Barreira Silenciosa&tímido; Material de Insonorização HD (Folha) (PSA)soundproofcow.comPainel de
soundproofcow.com10432400
Estimulador de Pulso Isolado Modelo 2100A-M Systems720000
Câmera Digital - Webcam Logitech C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Osciloscópio de canal único de 10 MHzLinômetroCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
potenciômetro de 5k ohmAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 Medidor de nível de som digital de 40 a 130 decibéisExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, embaralhado choqueKinder Scientific Co
Tocha de Joalheria 203525863Suporte de Lâmina de Bisturi Lâmina de bisturi para Espuma Acústica Enrolada 10203041

Referências

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