Artigo de método

Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo ( Microcystis aeruginosa) Utilizando citometria de fluxo

DOI:

10.3791/53036

⸱

29 de janeiro de 2016

 ,  , 
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

Neste artigo

Resumo

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Populações microbianas contêm heterogeneidade celular substancial, que pode ditar o comportamento geral. Análise sonda molecular através de citometria de fluxo pode determinar estados fisiológicos de células, no entanto a sua aplicação varia entre as espécies. Este estudo fornece um protocolo para determinar com precisão a mortalidade de células dentro de uma população cianobactéria, sem subestimar ou gravar resultados falsos positivos.

Resumo

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Subpopulações microbianas em estudos de campo e de laboratório foram mostrados para exibir elevada heterogeneidade em parâmetros morfológicos e fisiológicos. A determinação do estado de uma célula microbiana tempo real ultrapassa categorias vivas ou mortas, tal como micróbios podem existir num estado dormente, pelo qual a divisão celular e actividades metabólicas são reduzidos. Dada a necessidade de detecção e quantificação de micróbios, a citometria de fluxo (FCM) com sondas moleculares proporciona um método rápido e preciso para ajudar a determinar a viabilidade da população em geral. Usando SYTOX Verde e Laranja SYTOX no modelo de cianobactérias Microcystis aeruginosa para detectar a integridade da membrana, desenvolvemos um método transferível para indicação rápida de mortalidade única célula. As sondas moleculares utilizados nesta revista serão referidas sondas de ácidos nucleicos como verdes ou laranja, respectivamente (embora existam outros produtos com comprimentos de onda de excitação e emissão semelhantes que têm uma modos comparáveis ​​de action, que se referem especificamente à tona mencionado sondas). Protocolos que utilizam sondas moleculares variam entre espécies, diferindo principalmente na concentração e de incubação vezes. Seguindo este protocolo descrito em M.aeruginosa a sonda de ácido nucleico verde foi optimizada em concentrações de 0,5 uM, após 30 min de incubação e a sonda de ácido nucleico de laranja a 1 uM, após 10 min. Em ambas as concentrações sondas menos do que o ideal afirmou levou a uma subnotificação de células com danos na membrana. Por outro lado, as concentrações de 5 | iM e mais elevada em ambas as sondas exibiu um tipo de coloração não específica, por meio de que as células "ao vivo" produziu uma fluorescência alvo, levando a uma representação através do número de células não viáveis ​​''. Os controlos positivos (mortos pelo calor), desde biomassa morta testável, embora a adequação da geração controlo mantém-se sujeita a debate. Ao demonstrar uma seqüência lógica de etapas para otimizar as sondas de ácidos nucleicos verde e laranja de nós,monstrate como criar um protocolo que pode ser utilizado para analisar o estado fisiológico de cianobactérias eficaz.

Introdução

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A célula é um sistema complexo, que responde constantemente para o meio ambiente, modificando parâmetros fisiológicos e alterar a sua função. A dinâmica populacional das populações microbianas isog�nicas tanto na natureza eo laboratório são afectados pelo desenvolvimento de subpopulações, ocorrendo mesmo em condições ambientais relativamente constantes 1 - 3. A variabilidade das comunidades microbianas naturais surge devido à natureza altamente variável de condições ambientais. Estes processos estocásticos, por vezes, posteriormente produzir subpopulações que são muito diferentes para a média da população. Evidências recentes têm revelado que estes subpopulações fisiológicas respondem diferentemente a condições ambientais e pode produzir compostos inibidores do sinal ou que afectam dramaticamente e influenciam a 3,4 população geral.

O estabelecimento de um método para definir a heterogeneidade dentro de uma população é fundamental para untendimento a ecologia dos micróbios em diversos ambientes e é essencial na construção de conhecimento de cianobactérias incômodo, como a Microcystis tóxica, que tem um forte impacto sobre segurança hídrica humana. Espécies como Anabaena exibir heterogeneidade morfológica em resposta a flutuações ambientais, desenvolvendo células especializadas, como heterocistos e akinetes 2. Em contraste, as células de Microcystis não apresentam heterogeneidade morfológica óbvia durante uma resposta ao estresse. A discriminação entre as células viáveis ​​e não viáveis ​​é o aspecto mais importante de diferenciação fisiológica e permite uma melhor compreensão da dinâmica das populações microbianas. No entanto, o problema conceitual da viabilidade bacteriana em si continua a ser difícil e pouco caracterizada 1,5,6.

A citometria de fluxo (FCM) é um método fiável e rápido de análise de células individuais. Para aumentar a compreensão do fisioterapeuta única célulalogia através FCM, sondas moleculares têm sido utilizados para distinguir uma série de processos metabólicos e bioquímicos 7. Isto levou a um maior conhecimento das espécies em um nível celular e da população e, por sua vez ajudou a gestão dos recursos hídricos 8,9. No entanto, os organismos diferem em termos de captação de sonda molecular e efluxo devido aos poros e bombas nas paredes celulares e membranas, que levaram a uma série de design de sonda molecular e implementação do protocolo 6,10,11. Sondas moleculares disponíveis para fins comerciais e de pesquisa são muitas vezes fornecidos com um protocolo genérico que pode ser aplicável a um tipo de célula muito diferente. É preciso ser muito cauteloso na transferência de protocolos desenvolvidos para um tipo de célula para outra 6, é, portanto, uma tarefa essencial para otimizar sondas moleculares de forma eficaz antes da utilização.

As sondas de verde e laranja ácidos nucleicos se ligam a ambos os ácidos nucleicos de cadeia simples e duplas com base minimalista selecioneivity e são utilizados para avaliar a integridade da membrana plasmática das células. A sonda de ácido nucleico verde tem um sinal de fluorescência marcação celular marcadamente melhorado em comparação com outras sondas moleculares, tais como os compostos à base de iodeto de propídio 12, que também pode actuar como um indicador da viabilidade celular. O termo "viabilidade celular 'aqui assume que a degradação do DNA ocorre após a perda da integridade da membrana plasmática. As sondas de ácidos nucleicos são corantes assimétricos cianina com três cargas positivas e não podem entrar nas células com membranas íntegras sob concentrações caracterizadas, em ambos os eucariotas e procariotas 14,15 11,13 organismos. A ligação de uma sonda de ácido nucleico de ácidos nucleicos podem resultar em até um aumento> 500 vezes de emissões de fluorescência de sinais endógenos em células que tenham a sua integridade da membrana comprometida. Embora sondas moleculares, tais como o verde sonda de ácido nucleico pode ser um bom indicador da fisiologia da célula única, há uma necessidade To otimizar cada sonda com o organismo-alvo a que se destina, como os tempos de incubação variaram de 7 min - 30 min e concentração varia de 0,1 mM - 0,5 M em experimentos Microcystis sozinho 15-19.

Aqui apresentamos um protocolo para otimizar os ensaios de citometria de verde e os relativamente novos laranja sondas de ácidos nucleicos (o que até à data não foram testados nas espécies de cianobactérias M.aeruginosa). A seguinte metodologia desenvolvida pode então ser transferido para outras espécies e usado como uma plataforma para optimizar protocolos de outras sondas moleculares, aumentando assim a compreensão de micróbios e o seu comportamento ecológico.

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Protocolo

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1. Preparação da sonda molecular e Citómetro de Fluxo

  1. Dilui-se as soluções de reserva das sondas de ácidos nucleicos, que são fornecidos como uma solução a 5 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) a alíquotas de concentrações requeridas em ultrapura filtrada H2O
  2. Armazene as sondas de ácido nucleico em condições escuras entre -5 ° C e - 25 ° C até o uso.
  3. Ligue o citômetro de fluxo e pacote de software de carga (veja a tabela de materiais / equipamentos para as especificações FCM).
  4. Coloque um tubo de hemólise vazio (12 x 75 mm) na sonda de injecção de amostra (SIP), clique desobstruir e, em seguida, lave novamente para iniciar o processo de limpeza FCM.
    NOTA: Algumas etapas de exemplo para a SIP pode acomodar vários tipos de tubos, incluindo tubos de microcentrífuga. O diluente e a bainha da sonda molecular de fluido usado no aparelho é de uma FCM grau analítico "tipo 1" membrana de 0,22 um filtrado fonte.
  5. Lugarum tubo de hemólise fresco com 2 ml de ultrapura filtrada H2O na SIP, defina um limite de tempo para 10 - 15 min e uma velocidade fluidic a jejuar (ou uma taxa de fluxo de> 66 mL / min).
  6. Selecione uma nova célula de dados, colocar em limiares relevantes para a fluorescência e canais de dispersão de luz para reduzir o ruído de fundo e clique em "Executar".
  7. Se o total de eventos por segundo não são inferiores a recomendação dos fabricantes, em seguida, executar uma amostra de 2 ml de solução de descontaminação por 2 min em rápida e repita as etapas 1.4 e 1.5.
    NOTA: Verifique as recomendações dos fabricantes para FCM start-up limpeza protocolos, como eles podem variar entre os modelos. Testes de limites específicos também precisa estar em linha com o modelo FCM como algum equipamento permite que o usuário aplique tensões ganhos para os tubos fotomultiplicadores (PMTs) aumentando ou diminuindo o sinal elétrico gravado a partir de detectores ópticos. O modelo utilizado na presente FCM expemento fixou PMT tensão e utilizado um limiar de 80.000 dispersão frontal de luz (FSC-H) para excluir as partículas menores que 2,0 mm e de ruído eletrônico.

2. Preparação de Culturas e contagens iniciais de células

  1. Autoclave 98 ml de ultrapura filtrada H2O e 2 ml de meio (concentração de algas x50) em um copo de 250 ml durante 20 min a 120 ° C.
  2. A partir de uma monocultura inicial de M.aeruginosa (PCC 7806) em um lugar alto densidade estado estacionário 2 ml da amostra para um tubo sob a SIP. Desagregar qualquer formação de colónias por vórtex ou sonicação 20 e confirmar células uniformemente dispersas através da microscopia de luz.
    NOTA: A exposição excessiva à ondas ultra-sônicas pode levar a lise celular e deve ser usado com cautela. Desde sonicação pode recolher vesículas de gás (como os encontrados em espécies como M.aeruginosa) saídas, tais como luz dispersão lateral (SSC-H) pode se tornar mais intensidade sensitive.
  3. Dentro do software FCM, seleccionar um histograma para gravar dados de dispersão de luz para a frente (FSC-H) e configurar as especificações de plotagem, clicando em "log" para ver em uma escala logarítmica no eixo.
  4. Em uma saída separada, selecione outro histograma (eixo log) para gravar fluorescência natural, como o phycocyanin acessório pigmento fotossintético (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), encontrado em M.aeruginosa.
  5. Utilizar uma fonte de luz que pode excitar ficocianina e um detector que pode filtrar as emissões de fluorescência resultante.
    NOTA: fotossintético pigmento tais como clorofila pode ser animado com o comumente usado 488 nm laser azul, enquanto phycocyanin está animado mais de 600 nm e será detectado apenas com uma fonte de luz vermelha 21. Verifique com o fabricante citómetros de fluxo para fontes de luz de excitação e os espectros de detectores de emissão, tanto aqui a 488 nm e um laser de 640 nm foram usadas juntamente comum 675 ± 12,5 nm, filtro óptico.
  6. Para a gravação das configurações escolha de mais alta resolução mais próximo do tamanho do núcleo do organismo alvo (10 pM) e uma taxa de fluxo relativamente lento (14 ul / min).
    NOTA: Para obter os melhores amostras de resolução deve ser executado de acordo com a recomendação fabrica de eventos por segundo.
  7. Antes de aquisição de dados usar um limiar para deixar de fora a dispersão de luz e / ou sinais de fluorescência que são causados ​​pelo ruído de fundo eletrônico ou detritos amostra de células.
  8. Selecione uma nova célula de dados, criar uma trama densidade com parâmetros SSC-H FSC-H e em uma escala log e clique em Executar.
  9. Se a densidade da amostra leva a uma taxa de eventos em excesso, podem ser tomadas medidas de diluição para aumentar a precisão e precisão.
  10. Na trama densidade aplicar portões de software a partir do histograma anterior para excluir sinais de baixa nível de dispersão, produzidos pelo ruído de fundo ou detritos (FSC <320.000). Por outro lado a porta de fluorescência relativa mais elevadaficocianina sinais de células e incluem apenas esses eventos (FL4, 56.000 - 1.950.000).
  11. Use o número de células registrados nas áreas fechadas e dividi-lo pelo volume total da amostra que passou pela FCM, trabalhar para fora como muitas células por ml.
    NOTA: O modelo utilizado aqui FCM tem um sistema de bomba peristáltica microprocessador controlado, o volume da amostra a ser determinada. Outro equipamento FCM pode necessitar de uma suspensão de esferas calibrado ou um cálculo de diferenças de H 2 S de peso / volume para verificar se o volume total da amostra.
  12. Adicionar o volume necessário de células para os meios recém-preparados, a fim de iniciar um ciclo de crescimento de lote (250.000 células / ml) de M.aeruginosa.
    NOTA: Espécie serão diferentes das taxas de crescimento em função das suas parâmetros in-situ ambientais e disponibilidade de nutrientes, assim um ciclo de lote deve ser pré-gravadas para determinar as fases do ciclo de vida.

3. Optimização da Sonda Molecular Captação celular

  1. Colheita metade da cultura M.aeruginosa preparado no passo 2 a partir de uma fase exponencial e usar como um controle 'ao vivo'.
    NOTA: As amostras diluídas a partir de uma cultura de alta densidade em linha reta a uma fase exponencial podem afetar os resultados de otimização através de renovação celular morto, comparada com a de culturas inoculadas a partir de uma fase inicial lag / indução.
  2. Preparar a outra metade como um controlo "morto", utilizando métodos tais como etanol 70%, as amostras de aquecimento a 60 ° C durante 1 h, paraformaldeído ou formaldeído a 4% durante 30 min 6,11,22. Verificar variações no microambiente amostras (por exemplo., Ph).
    NOTA: A, controle positivo mortos pelo calor "morto" em M.aeruginosa se ​​distingue de uma amostra de "ao vivo" através da sua redução em sinais ficocianina. Induzindo a mortalidade por outros métodos podem não provocar o mesmo resultado e vary em espécies.
  3. Configurar amostras misturadas em proporções diferentes de "ao vivo" e amostras de 'mortos' (por exemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Desagregar a formação de colónias por vórtex ou ultra-sons e verificar o pH.
  5. Selecione um laser de 488 nm ao lado de detectores que podem gravar fluorescência do verde (FL1, 530 ± 15 nm) e laranja (FL2, 585 ± 20 nm) sondas de ácido nucleico e o laser 640 nm para gravar sinais de ficocianina através de seu respectivo detector.
    NOTA: Quando ligado ao DNA, a sonda verde ácido nucléico tem um comprimento de onda de excitação de fluorescência de aproximadamente 504 maxima nm e emissão de 523 nm, enquanto a sonda de laranja ácido nucléico tem um comprimento de onda de excitação de 547 nm e as emissões maxima de 570 nm. Um ião árgon laser em estado sólido a 488 nm pode ser utilizado para excitar as duas sondas moleculares, no entanto, um laser verde (547 nm até) irá produzir uma maior fluorescência laranja.
  6. Como ponto de partida, introduzir asonda molecular com os fabricantes de concentração recomendada para os 50% "ao vivo" e 50% de cultura "morto" e incubar no escuro.
  7. Selecione uma nova célula de dados, colocar a amostra sob a SIP com limites e gatilhos que irão reduzir o ruído de fundo (FSC-H 80.000).
  8. Criar uma trama densidade com parâmetros SSC-H FSC-H e, e três histogramas. Um histograma usando a respectiva sonda molecular canal detector óptico (FL1 ou 2), um para detectar emissões de ficocianina (FL4-H) e o outro FSC-H, tudo numa escala logarítmica.
  9. Incubar as amostras de M.aeruginosa com as sondas de ácido nucleico no escuro durante até 60 minutos, a gravação de dados em células separadas, a um número de pontos de tempo (1, 5, 10, 15, 30 e 60 min).
    NOTA: Ao ajustar os parâmetros, tais como verificação de pH com os fabricantes para reações potenciais de certos produtos químicos (para o ácido nucleico testado investiga um buffer não pode conter fosfatos ou altos níveis de monovalente ou divacátions emprestados, como a ligação com DNA será reduzida).
  10. Aplicar um portão de software para incluir apenas o histograma do FSC-H (320.000 - 1.500.000) para o alvo de organismos tamanho de célula, para o respectivo canal do histograma de fluorescência da sonda.
    NOTA: As concentrações utilizadas neste protocolo foram 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 um, que podem ser alteradas aumentando ou diminuindo o volume de amostra M.aeruginosa ou solução estoque inicial de sondas nucleicos.
  11. No canal de sonda fluorescente, aplique outro portão software inclusivo para o pico mais alto do histograma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, laranja FL2-H, 30.000 - 165.000) e, posteriormente, portão que sonda positivo de fluorescência na trama densidade.
  12. Executar os passos 3.1 - 3.11 com 100%, e todas as amostras de cultura mista "mortas" 100% "ao vivo", ajustando as concentrações de sondas moleculares (por exemplo, 0,1 x a x 10) e / ou a temperatura e os níveis de pH, se necessário.
  13. comparar o número de sinais positivos de fluorescência da sonda molecular para a densidade de células inicial de células "mortas" (feita a partir de metade total de FSC-H ou um de 100% de cultura 'morta') para encontrar a percentagem total de células coradas com o ácido nucleico sondas.
  14. Faça isso para cada período de tempo dentro de cada concentração para encontrar o protocolo ideal para o maior percentual de nucleico celular captação sonda sem produzir coloração não específica (usar os meios em um One-Way ANOVA ou Teste de Kruskal-Wallis, Se os dados são não-paramétrico).

4. Molecular Probe Fluorescência Discriminação

  1. Para os testes de interferência fluorescência / sobreposição de coloração celular intrínseca ou não-específica selecionar os dados cultura mista "mortas" 50% "ao vivo" e 50% e tirar todas as portas.
  2. Aplicar um portão de software para incluir apenas o histograma do FSC-H (320.000 - 1.500.000) para o alvo de organismos tamanho de célula, para a ficocianinahistograma canal.
  3. Portão ao pico mais alto phycocyanin e etiqueta como "ao vivo", com a adição do menor pico rotulados como "morto".
  4. Execute mais um passo portão para o respectivo canal do histograma de fluorescência sonda molecular, usando um de cada vez, sinais do "ao vivo" e, em seguida, phycocyanin 'morto' (FL4), a gravação de ambos os comprimentos de onda médios.
    NOTA: O modo para induzir mortalidade neste experimento foi feito por tratamento térmico, que ao abrigo deste protocolo diminui claramente sinais ficocianina. Outros métodos de produção de populações de células "mortas" podem originar diferentes resultados nos funcionamentos adquiridos.
  5. Rácio os comprimentos de onda médios da fluorescência positivo molecular sonda ("morto") eo sinal intrínseco / não-específico ("ao vivo") para determinar a sensibilidade do protocolo.
    NOTA: Para melhorar a fluorescência de discriminação "ao vivo" e popul "morto"ções, aumentar a fonte de carbono para a absorção da mancha activa em células sem nutrientes ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para melhorar a permeabilidade da parede celular e sinais de fluorescência resultantes 6. Compensação limitado em alguns modelos FCM para sobreposição espectral pode ser realizada por correção de pares manipulado pelo usuário durante a aquisição da amostra (variações de tensão PMT) ou de software especializado de pós-analítica.
  6. Seleccionar o protocolo optimizado onde a maior quantidade de células "mortas" foi corado sem a ocorrência de coloração não específica. Se um número de teste tem resultados semelhantes aceitar o protocolo com o menor tempo de incubação e concentração, juntamente com uma boa discriminação do sinal de fluorescência. Siga instruções do fabricante para o procedimento de desligamento citômetro.

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Resultados

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Dispersão directa da luz (FSC) e luz dispersão lateral (SSC) saídas a partir de uma cultura de lote M.aeruginosa em fase exponencial fornece informação sobre o tamanho das células (diâmetro) e granularidade interna, respectivamente (Figura 1A). FSC pode discriminar células que são demasiado grandes e / ou pequenos para serem M.aeruginosa. Esta discriminação ou gating pode ser feito por dados refinação entre certos pontos da saída de um FSC (Figu...

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Discussão

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O aumento do número de publicações que utilizam sondas moleculares indica que dados confiáveis ​​e informativas podem ser obtidas 5,6,8 - 15,19,22,23. Como ainda não há nenhuma mancha perfeita para a viabilidade das células que podem ser eficazes em todas as espécies com a mesma concentração e tempo de incubação 6,10. Mesmo o mesmo tipo de sonda com emissões de fluorescência alteradas mostra a necessidade de estabelecer a concentração e tempo de incubação correta (Tabe...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer doutorando Dave Hartnell e da Universidade de Bournemouth para apoio e financiamento para a pesquisa e instalações.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de CianobactériasSigma-AldrichC3061-500MLBG-11 Solução concentrada de água doce (diluição x50)
Fluido de descontaminaçãoBD Biosciences653155Funciona por 2 min quando as saídas são superiores a 12 eventos por segundo em rápido ou uma taxa de fluxo de 66 µ l/min.  Seguido por 2 min de bainha H2O.
Citômetro de fluxoBD Biosciencesa pedidoBD Accuri C6
SYTOX GreenLife TechnologiesS7020Coloração de ácido nucleico – Solução de 5 mM em DMSO
SYTOX OrangeLife TechnologiesS11368Coloração de ácido nucleico – Solução de 5 mM em DMSO

Referências

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