Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Utilizando citometria de fluxo

Resumo

Populações microbianas contêm heterogeneidade celular substancial, que pode ditar o comportamento geral. Análise sonda molecular através de citometria de fluxo pode determinar estados fisiológicos de células, no entanto a sua aplicação varia entre as espécies. Este estudo fornece um protocolo para determinar com precisão a mortalidade de células dentro de uma população cianobactéria, sem subestimar ou gravar resultados falsos positivos.

Resumo

Subpopulações microbianas em estudos de campo e de laboratório foram mostrados para exibir elevada heterogeneidade em parâmetros morfológicos e fisiológicos. A determinação do estado de uma célula microbiana tempo real ultrapassa categorias vivas ou mortas, tal como micróbios podem existir num estado dormente, pelo qual a divisão celular e actividades metabólicas são reduzidos. Dada a necessidade de detecção e quantificação de micróbios, a citometria de fluxo (FCM) com sondas moleculares proporciona um método rápido e preciso para ajudar a determinar a viabilidade da população em geral. Usando SYTOX Verde e Laranja SYTOX no modelo de cianobactérias Microcystis aeruginosa para detectar a integridade da membrana, desenvolvemos um método transferível para indicação rápida de mortalidade única célula. As sondas moleculares utilizados nesta revista serão referidas sondas de ácidos nucleicos como verdes ou laranja, respectivamente (embora existam outros produtos com comprimentos de onda de excitação e emissão semelhantes que têm uma modos comparáveis ​​de action, que se referem especificamente à tona mencionado sondas). Protocolos que utilizam sondas moleculares variam entre espécies, diferindo principalmente na concentração e de incubação vezes. Seguindo este protocolo descrito em M.aeruginosa a sonda de ácido nucleico verde foi optimizada em concentrações de 0,5 uM, após 30 min de incubação e a sonda de ácido nucleico de laranja a 1 uM, após 10 min. Em ambas as concentrações sondas menos do que o ideal afirmou levou a uma subnotificação de células com danos na membrana. Por outro lado, as concentrações de 5 | iM e mais elevada em ambas as sondas exibiu um tipo de coloração não específica, por meio de que as células "ao vivo" produziu uma fluorescência alvo, levando a uma representação através do número de células não viáveis ​​''. Os controlos positivos (mortos pelo calor), desde biomassa morta testável, embora a adequação da geração controlo mantém-se sujeita a debate. Ao demonstrar uma seqüência lógica de etapas para otimizar as sondas de ácidos nucleicos verde e laranja de nós,monstrate como criar um protocolo que pode ser utilizado para analisar o estado fisiológico de cianobactérias eficaz.

Introdução

A célula é um sistema complexo, que responde constantemente para o meio ambiente, modificando parâmetros fisiológicos e alterar a sua função. A dinâmica populacional das populações microbianas isog�nicas tanto na natureza eo laboratório são afectados pelo desenvolvimento de subpopulações, ocorrendo mesmo em condições ambientais relativamente constantes ^{1 - 3.} A variabilidade das comunidades microbianas naturais surge devido à natureza altamente variável de condições ambientais. Estes processos estocásticos, por vezes, posteriormente produzir subpopulações que são muito diferentes para a média da população. Evidências recentes têm re....

Protocolo

1. Preparação da sonda molecular e Citómetro de Fluxo

1. Dilui-se as soluções de reserva das sondas de ácidos nucleicos, que são fornecidos como uma solução a 5 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) a alíquotas de concentrações requeridas em ultrapura filtrada _H2O
2. Armazene as sondas de ácido nucleico em condições escuras entre -5 ^{° C e} - ²⁵ ° C até o uso.
3. Ligue o citômetro de fluxo e pacote de software de carga (veja a tabela de materiais / equipamentos para as especificações FCM).
4. Coloque um tubo de hemólise vazio (12 x 75 mm) na sonda de injecção de amostra (SIP), clique desobstruir e, em seguida, lave ....

Resultados

Dispersão directa da luz (FSC) e luz dispersão lateral (SSC) saídas a partir de uma cultura de lote M.aeruginosa em fase exponencial fornece informação sobre o tamanho das células (diâmetro) e granularidade interna, respectivamente (Figura 1A). FSC pode discriminar células que são demasiado grandes e / ou pequenos para serem M.aeruginosa. Esta discriminação ou gating pode ser feito por dados refinação entre certos pontos da saída de um FSC (Figu.......

Discussão

O aumento do número de publicações que utilizam sondas moleculares indica que dados confiáveis ​​e informativas podem ser obtidas ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Como ainda não há nenhuma mancha perfeita para a viabilidade das células que podem ser eficazes em todas as espécies com a mesma concentração e tempo de incubação ^6,10. Mesmo o mesmo tipo de sonda com emissões de fluorescência alteradas mostra a necessidade de estabelecer a concentração e tempo de incubação correta (Tabe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Cianobactérias	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Solução concentrada de água doce (diluição x50)
Fluido de descontaminação	BD Biosciences	653155	Funciona por 2 min quando as saídas são superiores a 12 eventos por segundo em rápido ou uma taxa de fluxo de 66 µ l/min.  Seguido por 2 min de bainha H2O.
Citômetro de fluxo	BD Biosciences	a pedido	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Coloração de ácido nucleico – Solução de 5 mM em DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Coloração de ácido nucleico – Solução de 5 mM em DMSO