Estudar a função da proteína eo papel da expressão proteína alterada pela interferência de anticorpos e reconstruções tridimensionais

Resumo

Controlar a expressão de proteínas não é apenas essencial para todos os organismos vivos, mas também uma estratégia importante para investigar as funções das proteínas em modelos celulares. O protocolo apresentado mostra a aplicação da interferência de anticorpos em células de mamíferos, incluindo neurônios primários do hipocampo, e demonstra o uso de reconstruções tridimensionais no estudo da função proteica.

Resumo

Uma gestão rigorosa da expressão da proteína não é apenas essencial para todos os organismos vivos, mas também uma estratégia importante para investigar as funções das proteínas em modelos celulares. Portanto, a investigação recente inventado ferramentas diferentes para atingir a expressão de proteínas em linhas de células de mamíferos ou mesmo modelos animais, incluindo ARN e interferência anticorpo. Enquanto a primeira estratégia reuniu muita atenção durante as últimas duas décadas, os péptidos medeiam uma translocação de cargas de anticorpos através das membranas celulares e em células, obtido muito menos interesse. Nesta publicação, é proporcionado um protocolo detalhado para utilizar como um transportador de péptido denominado Carruagem em células embrionárias de rim humano, bem como em neurónios do hipocampo primárias para realizar experiências de interferência de anticorpos e ilustrar ainda mais a aplicação de reconstruções tridimensionais em analisar a função da proteína. Nossos resultados sugerem que Chariot é, provavelmente devido ao seu sinal de localização nuclear, particularly bem adequada para alvejar proteínas residentes no soma e o núcleo. Surpreendentemente, quando se aplica Chariot às culturas de hipocampo primários, o reagente acabou por ser surpreendentemente bem aceite pelos neurônios dissociados.

Introdução

Um controlo rigoroso da expressão da proteína é essencial para todos os organismos vivos para comandar o seu desenvolvimento, bem como para reagir a sinais ambientais. Assim, uma multiplicidade de mecanismos foi inventado durante a evolução para regular com precisão o nível de cada proteína codificada pela aplicação expressão. 20000 genes existentes em qualquer célula eucariótica, em determinado momento da sua vida. Levando-se em diferentes fases da produção de proteína, os mecanismos reguladores variar desde a administração da estrutura da cromatina, a transcrição de ARN e de manuseamento à direcção de modificações pós-tradução de proteínas, o transporte e a degradação.

Portanto, não é surpreendente que disfunções no máquinas moleculares e níveis de expressão de proteína alterada subjacente têm sido associados a diversas doenças como o cancro ou deficiência intelectual. Na verdade, olhando para a complexidade excepcional do desenvolvimento neuronal e função do cérebro dos mamíferos, a sensidade desses sistemas sofisticados para alterações na expressão da proteína se manifesta em vários déficits intelectuais bem conhecidos, incluindo Alzheimer e doença de Parkinson (AD e PD), bem como distúrbios do espectro do autismo (ASD) como a Síndrome do X Frágil (FXS). A última doença é caracterizada por uma extensa misexpression de uma variedade de proteínas, o que é devido à perda de uma única regulação de tradução de proteínas, FMRP (Frágil Proteína retardo mental X) ^1-4. Proteína Além disso, rearranjos cromossômicos que afetam a carga variável x ligada A (VCXA), uma proteína, que gere a estabilidade do mRNA e tradução modificando mRNA tampando ^5, recentemente têm sido associados com déficits intelectuais, enquanto que mutações pontuais não foram identificados em pacientes com deficiências cognitivas a partir de agora ^{6, 7,} sugerindo que as deficiências mentais observados são originários de expressão VCXA alterado e expressão desregulada de sua prote-alvoins. Em linha com esses achados, um estudo investigando se de novo no número de cópias variações de genes estão associados com ASD estabelecido que os novos duplicação gênica e supressões são um fator de risco significativo para ASD ^8, apoiando assim a ideia de que os níveis de expressão de proteína elevadas ou diminuídas pode causar déficits intelectuais.

Notavelmente, a investigação recente fornecido mais provas de que o nível de um dado expressão de proteína é ajustada precisamente para impedir a sua agregação como consequência de quantidades elevadas de proteína, com quase sem margens de segurança ^9. Por conseguinte, tem sido proposto que mesmo pequenos incrementos são suficientes para induzir doenças, tais como a DA e DP ^9. Embora a variedade de máquinas moleculares que contribuem para controlar a expressão de proteínas sugere um regime de regulação complexa à luz destes resultados, um estudo investigando o nível de mais de 5.000 genes ¹⁰ de mamíferos expressão demonstrou quenatureza preferido um esquema mais parcimoniosa: A abundância celular de proteínas mostrou-se predominantemente regulada a nível da tradução ^10, ilustrando assim que a gestão da disponibilidade RNA serve principalmente para afinar a expressão da proteína.

O estudo da dose de proteínas de interesse (POIs) é, por conseguinte, não é apenas importante para a compreensão das funções endógenos de uma proteína, mas também para a investigação de muitas doenças e o desenvolvimento de terapias. Assim, as últimas décadas viram o avanço de várias estratégias com RNA de interferência para manipular dosagem POI. Apesar de interferência de RNA é amplamente utilizado para estudar a função da proteína e é mesmo a ser aplicada em ensaios clínicos para o tratamento do cancro ou oculares doenças, bem como para perseguir terapias antivirais em pacientes ^11-13, algumas dificuldades podem surgir o que pode tornar a estratégia impossível. Por exemplo, a sequência de semente, que acciona o knockdown por homologia é COMPARAefeitos a curto, daí que promovem off-alvo ble. Desde sequências altamente eficientes são raras e devem ser encontrados entre milhares de opções (revisto em ^14), identificando a seqüência correta pode ser demorado e caro, mas os resultados ainda podem ser decepcionante.

Uma estratégia alternativa é alvejar diretamente o POI por anticorpos. Aqui, ilustramos a utilização da Carruagem transportador de proteína (fabricado pelo Active Motif) para reduzir a disponibilidade de proteína celular, e o emprego de reconstruções tridimensionais para estudar a função da proteína seguinte knock-down.

O motivo de activa Carruagem, ele próprio um péptido de 2,8 kDa, é utilizado para os péptidos de transporte, proteínas e anticorpos através das membranas de células de mamífero ^15. Os associados de peptídeos com POIs através da formação não-ligado de forma covalente complexos macromoleculares utilizando interações hidrofóbicas, quando então complexos Chariot-POI são internalizados em células em uma endosome-indforma ependent. Importante, Carruagem foi indicado para não afectar a localização intracelular de proteínas Transportado, nem de exercer efeitos citotóxicos ou para afectar a actividade biológica da sua carga ^15.

Protocolo

1. Soluções de Stock

1. Ressuspender o pó motivo activo liofilizado estéril em H ₂ O para uma concentração final de 2 ug / uL. Toque cuidadosamente para misturar.
2. Prepare pequenas alíquotas (por exemplo, 12 ul de cada, 2 ul são necessários por reacção) e armazená-las a -20 ° C.

2. Preparação de células

1. células de mamíferos, tais como células de sementes HEK293 ou neurónios primários sobre um meio de crescimento de placa de 24 poços em 500 ul incluindo antibióticos.
   NOTA: Ao usar os neurônios, semear as células em baixa densidade e usar apenas as duas linhas do meio da placa de 24 poços. Cada poço terá assim uma contrapartida vazio para abrigar o meio durante a incubação (passo 4.2). Ao manusear os neurônios, sempre se certificar de que as células não são mantidos fora da incubadora por mais de alguns minutos.
2. Cultura das células em condições adequadas (humidificada, 5% de CO ₂ e 37 ° C) até que as células são app. 50%confluente.
   NOTA: Ao usar os neurônios, a cultura das células até à fase de desenvolvimento desejado seja atingido e alterar app. 25-50% do meio duas vezes por semana. Meio: meio Neurobasal (1x contendo B27, 5 mM de L-glutamina e penicilina e estreptomicina 1x; comparar com a ref 16).

3. Chariot Formação Complex

1. Por reacção, dilui-se 0,1-2 ug do PI ou o anticorpo correspondente, bem como a proteína de controlo, ou o anticorpo de controlo, respectivamente, em 50 ul de PBS.
   NOTA: A técnica também funciona com complexos macromoleculares que consiste de anticorpos primários e secundários pré-ligado (cp 'Resultados' representativos, Figura 1.). Misture e rotação.
2. Para cada amostra, dilui-se 2 ul de solução de estoque Carruagem em 50 ul de PBS utilizando tubos separados, a fim de evitar a auto-associação da carruagem. Misture e rotação.
3. Transferir o POI ou anticorpo (passo 3.1) diluído para a diluição Chariot por pipetating. Misture e rotação.
4. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente (complexos Carruagem-POI vai formar).

4. Transfecção de células

1. Dilui-se a complexos de Carruagem (passo 3.4) em 100 ul de meio de crescimento pré-aquecido (37 ° C, sem qualquer aditivo). Remover o meio e lava-se as células uma vez que utilizam pré-aquecido PBS 1x.
   NOTA: Ao usar os neurônios, não descarte o meio, ele será reutilizado. Mantê-la a 37 ° C. Para a lavagem, utilizar PBS contendo 0,5 mM de MgCl ₂ e CaCl _2.
   Sugestão: manter o meio em poços vazios enquanto incubando a placa (passo 4.5).
2. Aplicar a solução de complexo de Carruagem (passo 4.1) para as células e agitar suavemente as células para assegurar uma distribuição uniforme da solução. Cresça as células em condições padrão (Passo 2.2), durante 1 h. Adicionar a uma concentração sérica final de 10%. Ao usar os neurônios, adicionar a forma do passo 4.1. Crescer as células durante 1 a 2 horas mais.
   Note otempo de incubação óptimo depende do tamanho e propriedades da carga e podem ter de ser ajustadas empiricamente. As seguintes sugestões podem servir como orientação: Para os péptidos, de 1 hora é geralmente suficiente, para as proteínas de 02/01 h são recomendados, para anticorpos de duas horas, e para a transfecção de neurónios com anticorpos de 4 h.
3. células de processo para a análise, como de costume. Por favor, note: a técnica é compatível com experimentos utilizando protocolos de fixação, bem como imagens ao vivo.

5. Imagiologia

1. Usando um microscópio de varrimento laser, tomar-z pilhas de células e / ou compartimentos de células de interesse, utilizando, aproximadamente, 0,25-0,5 uM distância. A distância camada precisa depende do tamanho da estrutura a ser reconstruída e deve ser determinada individualmente.

6. Reconstrução

1. Nas etapas a seguir, use o fundo Esc para alternar entre seleccionar e navegar, Cntr para selecionar vários objetos, clicando on eles e tecla shift para cortar objetos (cp. passo 6.10).
2. Abra o arquivo lsm em Imaris.
3. Usando o ajuste de exibição para cada canal, contrastar a imagem até que as estruturas mais brilhantes atingir a saturação. Por favor note que este ajustamento não vai influenciar a construção de superfície, serve apenas para auxiliar o pesquisador em limiarizar a imagem.
4. Clique no ícone Adicionar novas superfícies. Um assistente será aberta.
5. Selecione: Segmento apenas uma região de interesse. Vá para a próxima etapa.
6. Ajustar as margens da caixa de seleção para ajustar seu objeto de interesse. Por favor, tenha em mente que a imagem tem 3 dimensões e que a seleção precisa ser ajustado no plano z também. Se a forma rectangular da caixa de seleção não deve coincidir com o objeto de interesse corretamente, desligue o objeto e / ou ampliar a caixa até que todas as estruturas necessárias estão embutidos. objetos indesejados podem ser removidos mais tarde (cp. passo 6.10). Proceder.
7. Selecione o ch apropriadaannel. O nível de detalhe da área de superfície ou diâmetro da esfera deve ser definido para coincidir com as estruturas sendo reconstruído. Dependendo das características de sinal, pode ser usado tanto intensidade absoluta ou de contraste local. Geralmente, Contraste local funciona melhor para sinais difusos. Em qualquer caso, as configurações necessitam de ser ajustadas separadamente para cada sinal ou estrutura de interesse, respectivamente.
8. Usando a ferramenta de Thresholding, reconstruir a estrutura de interesse.
9. Completar a reconstrução clicando na parte inferior seta verde.
10. Ajuste o objeto ainda mais usando a ferramenta de lápis para cortar e remover superfícies, conforme necessário. Só é possível cortar no sentido norte-sul, portanto, inclinar a imagem, a fim de cortar o objeto desejado.
11. Obter medições de volume, área e intensidades para cada superfície, selecionando Estatística, Estatísticas detalhadas e valores médios.
12. (Etapa opcional) Para observar estatísticas codificadas por cores (cp. Figura 2E e F), selecione a guia cor da superfície correspondente e marcar 'Estatística Coded' em vez de 'base'. Várias opções serão exibidas.

Resultados

Nos parágrafos seguintes, os resultados exemplares que ilustram um knockdown funcional de um POI (Simiate, para mais pormenores, ver ^{16, 17)} utilizando o reagente Chariot e da interferência de anticorpos são apresentados. Os resultados demonstram que a expressão diminuída de Simiate prejudica a actividade de transcrição, e, de um modo dependente de dosagem, induz a apoptose, culminando nas taxas de mortalidade de mais de 99% se forem aplicadas quantidades de anticorpos mais elevados (>...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o significado dos níveis de expressão de proteína em controlar funções celulares de uma forma orientada dose. O protocolo descrito permite uma manipulação de ajuste entre a expressão da proteína em diferentes tipos de células de mamíferos, incluindo os neurónios do hipocampo, facilitando assim estudos detalhados da função da proteína sobre o nível celular.

Apesar de interferência de RNA representa uma estratégia bem conhecida para regular POIs, el...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Chariot	Active Motif	30025	loja a -20 ° C
Meio neurobasal	Tecnologias de vida	21103-049	aquecem até 37 ° C antes de usar
1x tecnologias B27	Life	17504044	armazenar a -20 &graus; C
L-glutamina	Life technologies	25030-149	loja a -20 ° C
Penicilina e estreptomicina	Life technologies	15140-122	loja a -20 ° C
Imaris software	Bitplane	n.a.caro	, mas incomparável
Microscópio de varredura a laser	Zeiss	n.a.