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Artigo de método

Eletrofisiologia no isolado do tronco encefálico-espinal Preparações do cordão umbilical de recém-nascidos Roedores permite a gravação de saída Neural Rede Respiratory

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DOI:

10.3791/53071

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19 de novembro de 2015

 , 
1Department of Pediatrics, Laval University

Neste artigo

Resumo

O impulso respiratório central está localizado no tronco cerebral. A saída motora respiratória espontânea de um tronco encefálico-medula espinhal isolado é registrada pela colocação de um eletrodo na quarta raiz ventral. Essa abordagem experimental é valiosa para investigações farmacológicas ou para a avaliação de desafios respiratórios e manipulações genéticas no comportamento motor rítmico.

Resumo

Embora seja bem conhecido que o impulso respiratório central está localizado no tronco cerebral, vários aspectos de sua função básica, desenvolvimento e resposta a estímulos ainda precisam ser totalmente compreendidos. Para superar a dificuldade de acesso ao tronco encefálico em todo o animal, é realizado o isolamento do tronco encefálico e de parte da medula espinhal. Esta preparação é mantida no líquido cefalorraquidiano artificial, onde gases, concentrações e temperatura são controlados e monitorados. O sinal de saída da rede respiratória é registrado por um eletrodo de sucção colocado na quarta raiz ventral. Dessa maneira, os estímulos podem ser aplicados diretamente no tronco cerebral e o efeito pode ser registrado diretamente. O sinal registrado está ligado ao sinal inspiratório enviado ao diafragma através do nervo frênico e pode ser descrito como rajadas (cerca de 8 rajadas por minuto). A análise dessas rajadas (frequência, amplitude, comprimento e área sob a curva) permite a caracterização precisa do efeito do estímulo na rede respiratória. A principal limitação deste método é a viabilidade do preparo além dos estágios iniciais pós-natais. Assim, este método se concentra muito no estudo de toda a rede sem as entradas periféricas no rato recém-nascido.

Introdução

A respiração é uma actividade fundamental complexo e controlado pelo cérebro, permitindo dioxigénio (O2) e a absorção de dióxido de carbono (CO 2) eliminação. O comando central da respiração é gerado por uma complexa rede localizado no tronco cerebral em ambos os mamíferos 1, 2 anfíbios, répteis, pássaros 3 4 5 e peixes. Mesmo se o estudo de respiração pode ser processada in vivo, investigações mecanicistas precisos requerem acesso directo à rede de controlo respiratório. Para este fim, Adrian e Buytendijk desenvolveu uma preparação peixinho reduzida, no qual os eletrodos posicionados na superfície do tronco cerebral registro do ritmo gerado associada a ventilação branquial 5. Esta abordagem foi subsequentemente adaptado por Suzue em 1984 6 para utilização em roedores recém-nascidos. O advento desta preparação tem levado a avanços significativos na neurobiologia respiratória. Uma vez que é relativamente simples, a técnica apresentada here é passível de uma ampla gama de investigações básicas de comportamentos motores rítmicas e as suas origens em roedores recém-nascidos.

O objetivo geral deste método consiste em gravar o correlato neural da atividade inspiratória, um ritmo respiratório, chamado respiração fictício, produzido pela rede respiratória. Este método pode ser utilizado em uma ampla gama de objetivos de pesquisa, visando respostas inspiratória a variações respiratórias ou farmacologia em ambos os selvagens tipo 7 e 8 animais transgênicos. Dado que as experiências são realizadas a uma temperatura baixa, sem aferentes sensoriais, e sob condições nas quais as concentrações de glicose e O 2 no interior da aCSF são elevados, foram levantadas questões sobre a relevância fisiológica do sinal gravado. Embora existam diferenças claras entre in vivo e in vitro condições (por exemplo., A freqüência de rajadas inspiratória) permanece o fato de que a presença deos principais elementos da rede respiratória 6 torná-lo possível estudar um ritmo robusto associado a uma função homeostática vital 9,10.

A lógica por trás do desenvolvimento e da utilização dessa técnica é facilitar o acesso direto aos elementos do tronco cerebral da rede respiratória, que são de difícil acesso in vivo, especialmente em recém-nascidos. O tronco cerebral é colocado sob condições estritamente controladas: o ritmo gravada não é modulada por entradas aferentes periféricas dos pulmões ou dos órgãos carótidas, permitindo o estudo para se concentrar no comando central da respiração em si 11. Assim, este acesso é utilizada para aplicar estímulos e gravar o sinal de saída. Em contraste com pletismografia gravações, o ritmo respiratório é modulada por todos os seus componentes ao longo do corpo (por ex., A distensão do pulmão, sensores químicos periféricas), tornando-o difícil de aplicar estímulos precisos.

Numarato ewborn, o protocolo consiste em gravar o quarto sinal ventral raiz em um tronco cerebral isolado e uma medula espinhal truncado, mantida no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF). O ritmo gerada pelos preparativos da medula do tronco cerebral-espinhal é composta de explosões lentas individuais que estão ligadas ao sinal inspiratória 9. Isolado preparações da medula do tronco cerebral-espinhal são facilmente graváveis ​​em ratos de pós-natal dia 0-4 (P0 - P4) 7. Esta abordagem é vulgarmente usado para avaliar a resposta hipóxica da rede respiratória, e também a resposta a hipercapnia, acidose ou drogas. Um protocolo de hipóxia aguda é apresentado aqui. Esta estimulação é obtido por retirada de O 2 no aCSF; esta abordagem é utilizada para avaliar a tolerância e a capacidade de resposta a insultos hipóxicos. O protocolo induz uma depressão do ritmo a partir do primeiro minuto até ao final da exposição a hipoxia (Figura 1) 12. Esta depressão é invertidadurante a pós-hipóxica 12 recuperação. No que respeita ao delineamento experimental, é importante notar que a ponte, localizada na parte rostral do tronco cerebral, tem uma ação inibitória sobre o gerador de ritmo 8. Assim, as preparações de tronco cerebral e da medula espinal integral rostral exibir um ritmo inferior. Inclusão da ponte na amostra isolada para a gravação é determinado de acordo com o objetivo do experimento 13; o estudo da influência pontina na rede medula oblongata exigiria gravações com e sem a ponte para comparar os resultados 14. Além disso, uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de estender a porção rostral do preparado para incluir mesencefálico e / ou regiões diencefálica 15,16, tornando-se possível avaliar o efeito destas regiões na rede ponto-medular respiratória.

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Protocolo

Este método necessária a utilização de matérias de origem animal, permitidas pelo Comitê de Laval University animal Ética (protocolo nº 2012-170).

1. Configuração e Preparação

  1. Soluções
    1. Preparar soluções stock aCSF de acordo com as seguintes receitas 7,17. Outras receitas com variações de concentração estão disponíveis na literatura. Soluções de armazenar a 4 ° C durante até um mês.
      1. Solução de sal: adicionar 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Dissolver em 800 ml de água destilada, em seguida, enche-se a 1 L com água destilada.
      2. Solução de bicarbonato de: adicionar 17,65 g de NaHCO3 (21 mM final). Dissolver em 900 ml de água destilada, em seguida, enche-se a 1 L com água destilada. Variações da concentração de bicarbonato irá resultar em variações do pH.
      3. Solução de glicose: adicionar 54,06g de glucose (30 mM final). Dissolver em 400 ml de água destilada, em seguida, preencher a 500 ml com água destilada.
    2. Prepare aCSF, diluindo 100 ml de solução salina, 100 ml de solução de bicarbonato, e 50 ml de solução de glucose em 1 L de água destilada. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
    3. Prepare um eletrodo de vidro por aquecimento e alongamento um tubo de vidro até que quebre. Areia para baixo a ponta antes de usar. O eléctrodo pode ser reutilizado muitas tempo, desde que ele permaneça limpo.
  2. Setup Experimental
    Nota: Os detalhes de configuração são apresentados na Figura 2.
    1. Ligue o amplificador, averager, sistema de aquisição de dados, controlador de temperatura e bomba em movimento. Verifique a amplificação do sinal (ganho = 10.000), a filtração (baixo limiar, 10 Hz; limiar alto, 5 kHz), e a taxa de amostragem da conversão de analógico para digital do sinal bruto (2,5 kHz).
    2. Encha uma garrafa com aCSF e bolha com carbogênio (95% O 2 , 5% de CO 2). Induzir uma bubbled- e aqueceu-aCSF fluxo na câmara de gravação (volume de 5 ml) a 4 ml / min. Manter a temperatura na câmara de gravação em 26 (± 1) ° C. O pH deve ser 7,4 nestas condições padrão.
    3. Mantenha 50 ml de RT e borbulhou-carbogénio aCSF em uma seringa de 50 ml, perto da câmara de dissecção.
    4. Ligue o computador e iniciar o software de gravação.

2. Dissecção

  1. Pesar e visualmente determinar o sexo do animal (machos têm um ano genital distância mais longa, enquanto as fêmeas têm uma distância ano-genital curto; machos genitais são muitas vezes escuro, enquanto órgãos genitais femininos são cor de rosa).
  2. Anestesiar os roedores recém-nascidos por uma das seguintes opções: Crioanestesia (imergir completamente o animal em gelo durante 4 - 5 min 18), a injecção (equitensine a 4 ml / kg) 19 ou inalação de anestésicos voláteis (isoflurano 20 ou éter 21). Confirm um plano adequado de anestesia pela ausência de um reflexo de retirada da pata.
  3. Colocar o animal no banco, cara ventral para baixo. Secção da parte da cabeça rostral coronalmente com um bisturi ao nível da bregma (visíveis através da pele e do crânio). Execute esta etapa imediatamente após o animal é anestesiado.
  4. Seção do corpo coronalmente com um bisturi sob os membros anteriores.
  5. Retire a pele, músculos, tecidos adiposos e víscera com tesouras cirúrgicas e finas e um alicate. Como os ossos são moles nesta idade, ser cauteloso para não danificar o sistema nervoso. Execute esta etapa no banco.
  6. Coloque a preparação na câmara de dissecção. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação. A partir deste ponto para o fim da gravação, usar um microscópio.
  7. Na face dorsal da preparação, cortar o crânio e vértebras do rostral à parte caudal ao longo do eixo médio com tesouras cirúrgicas finas e e um alicate. Abra o crânio cortee vértebras de modo a expor o tecido nervoso. Use a aCSF strored na seringa para oxigenar a preparação.
  8. Com os alicates, remover a membrana aracnoideia, um tecido fino que cobre a superfície do tecido nervoso. Manter a pia-máter e vasos sanguíneos contra o tecido nervoso. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação.
  9. Coloque a preparação com o dorsal viradas para baixo, e cuidadosamente derrubar o tronco cerebral ea medula espinhal, cortando os nervos e tecido conjuntivo com a tesoura, segurando a preparação no local. Uma abordagem dorsal também é possível. Manter as raízes dos nervos e o maior tempo possível. Remover os ossos para isolar o tronco cerebral e da medula espinhal. Utilizar a aCSF armazenado na seringa para oxigenar a preparação.
  10. Remover o cerebelo e restantes estruturas rostral seccionando-los com o bisturi. Utilizar a aCSF armazenado no interior da agulha para oxigenar a preparação.
  11. Opcionalmente, dependendo experimenprojeto tal, remova a ponte com o bisturi por uma seção coronal anterior à artéria cerebelar inferior 22. Note-se que manter os pons inteiras vai abrandar o ritmo em ratos e totalmente inibi-la em camundongos. Preparações que incluem apenas a parte caudal da ponte exibir uma atividade respiratória, como com uma frequência estável na raiz C4.

3. A gravação

  1. Coloque a preparação na câmara de gravação, ventral face para cima. Corrigir a preparação com os pinos na parte mais baixa da medula espinhal e rostral mais-parte do tronco cerebral.
  2. Usando uma seringa ligada ao eléctrodo por sua agulha, induzir uma depressão no eléctrodo (diâmetro da ponta de vidro: 150 - 225 uM), puxando o êmbolo da seringa, a fim de preencher parcialmente o eléctrodo com aCSF.
  3. Utilizando um micromanipulador, colocar cuidadosamente o eléctrodo próximo de uma das quarta raízes ventrais. Outras raízes ventrais também poderia apresentar um respiratório-like atividade (e.g., nervo craniano XII, C1 raiz ventral).
  4. Induzir uma depressão no reservatório de eléctrodo através da seringa puxando o êmbolo para fora, a fim de aspirar suavemente a radícula nervo. Em seguida, mova cuidadosamente o eléctrodo de aplicá-la contra a medula espinhal.
    Nota: Idealmente, o tamanho das radículas corresponde ao tamanho da abertura do eléctrodo e, portanto, cria uma vedação entre os compartimentos internos e externos do eléctrodo. Desde amplificadores diferenciais são normalmente utilizados para tais gravações, qualquer abertura entre o interior do eléctrodo e a câmara de registo reduz a qualidade do sinal e faz com que seja difícil de eliminar o ruído de fundo.
  5. Comece a gravação.
  6. Grave o ritmo produzido pela preparação sob condições de normóxia (isto é, borbulhada com carbogénio aCSF: 95% de O2 e 5% de CO 2) durante pelo menos 20 minutos para determinar os parâmetros de linha de base de preparação.
  7. Alterne a perfusão de borbulhou-carbogénio aCSF paraaCSF estímulo (isto é, feito borbulhar com 95% de N2 e 5% de CO 2 por estímulo hipoxia) durante 15 min. Alterar a duração da exposição, dependendo do protocolo experimental. Grave a duração da exposição sobre a gravação e animal folha de dados. Utilize tubos de aço inoxidável entre a garrafa e a câmara de aCSF sempre que possível para evitar a difusão de gás para o exterior do tubo.
  8. Alterne a perfusão de volta para aCSF borbulhou-carbogénio padrão para, pelo menos, 15 min para uma gravação de recuperação. Grave este na gravação e animal folha de dados.
  9. Fim da gravação.

4. Análise estatística

  1. A partir do sinal integrado, calcular a frequência como o número de rajadas por minuto (expressa em rajadas / min), a amplitude como a diferença entre a linha de base e o pico do sinal de sincronismo (expressa em mV), a duração do sincronismo como a duração de o início até ao fim do sinal de sincronismo (expresso em segundos), a área de explosão como a área sob a curve da explosão sobre o sinal integrado (expressa em mV · s) (Figura 3).
  2. Calcular a frequência, amplitude, duração e área de estourar estourar sob normóxica (baseline), hipóxia (estímulo) e pós-condições de hipóxia (pós-estímulo) de recuperação como a média da última 5 min das gravações para cada condição. Não analisam a primeira porção de cada condição, porque existe um atraso entre a ligação da perfusão e aCSF homogeneização na câmara de gravação.
  3. Expresse então estímulo (ou seja, a hipóxia) e pós-estímulo (ou seja, pós-hipóxia) valores de recuperação como uma percentagem dos valores de referência para a gravação correspondente. Exprimir os resultados em média ± SD

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Resultados

Como mencionado na introdução, uma das vantagens mais importantes desta técnica é o acesso directo ao tronco cerebral para aplicar vários estímulos. Como um exemplo, a hipoxia foi aplicado aqui. Figura 1. AB exibe uma gravação protocolo completo, com ambas as condições de normóxia e de hipóxia. A Figura 1.CE exibe o ritmo registada em condições de normóxia (isto é, aCSF borbulhar com 95% de O2 e 5% CO2 a 26 ° C). Como anteriormente demonstrado nesta prepar...

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Discussão

Quantificação exata da atividade respiratória pode ser um desafio. Na verdade, a respiração é uma função que pode ser tanto automática e voluntária, e que é modulada de acordo com o ambiente, as necessidades do corpo, o estado emocional eo comportamento. A vantagem desta técnica é o isolamento de elementos neurais responsáveis ​​por produzir o comando respiratória. Assim, as gravações electrofisiológicas de preparações da medula espinal e do tronco cerebral-pletismografia são técnicas complementares para estudar toda a ...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesses a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem sinceramente ao Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 e à Star Foundation for Children's Health Research, juntamente com a Molly Towell Foundation, pelo fornecimento do centro de pesquisa e apoio financeiro. Os autores também agradecem sinceramente ao Dr. Kinkead Richard pela revisão e aconselhamento do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
SylgardSigma Aldrich761036-5EAUso sob o capô
NaClBioshopSOD002
KClBioshopPOC888
CaCl2BioshopCCL444
MgCl2BioshopMAG510
NaHCO3BioshopSOB999
NaH2PO4BioshopSPM306
D-glicoseBioshopGLU501
CarbogenLinde343-02-0006 
Controlador de temperaturaWarner Instruments, Hamden, CT, USATC-324B
Eletrodo de sucçãoA-M Systems, Everett, WA, EUAmodelo 573000
Amplificador diferencial ACA-M Systems, Everett, WA, EUAmodelo 1700
Média móvelCWE, Ardmore, PA, EUAmodelo MA-821
Sistemade aquisição de dadosDataq Instruments, Akron, OH, EUAmodelo DI-720
LabChart softwareADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA
Prism sofwareGraphpad, La Jolla, CA, EUA
Câmara de dissecaçãoCaixa de plástico (por exemplo, caixa de Petri) fará
Câmara de gravaçãoHome made
BaseKanetec, Bensenville, IL, EUAMB
MicromanipuladorWorld Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, EUAKITE-R
BaseKanetec, Bensenville, IL, EUAMB
Bomba peristálticaGilson, Middleton, WI, EUAMINIPULS 3
Faraday CageComputador caseiro

Referências

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