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Artigo de método

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

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DOI:

10.3791/53072

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14 de outubro de 2015

 ,  , 
1Department of Cell Biology & Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 3McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Relatamos um método confiável para isolar e cultivar células endoteliais primárias específicas do tumor a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

Células específicas do tumor isoladas de fresco endoteliais (TEC) pode ser usada para explorar mecanismos moleculares de angiogénese tumoral e servem como um modelo in vitro para o desenvolvimento de novos inibidores da angiogénese para o cancro. No entanto, a longo prazo expansão in vitro de células endoteliais de murino (CE) é um desafio devido à deriva fenotípica em cultura (transição endotelial-a-mesenquimal) e contaminação com não-CE. Isto é especialmente verdadeiro para o TEC que são prontamente outcompeted por fibroblastos co-purificada ou células de tumor em cultura. Aqui, um método de isolamento de alta fidelidade, que tira vantagem de enriquecimento imunomagnética acoplada com selecção de colónias e expansão in vitro é descrita. Esta abordagem gera frações CE puros que são totalmente livre de contaminação de células do estroma ou tumorais. Também é mostrado que traçou-linhagem Cdh5 CRE: ratinhos repórter / l ZsGreen L / S, utilizada com o protocolo aqui descrito, são uma ferramenta valiosa para verificar a célulapureza como as colônias isoladas CE destes ratos mostram durável e brilhante fluorescência ZsGreen em cultura.

Introdução

Células endoteliais (EC) são essenciais durante o desenvolvimento de tumores sólidos. Do início do interruptor angiogênico em tumores dormentes para divulgação e propagação de metástases em locais distantes, CE constituem as condutas que fornecem sangue, oxigênio e nutrientes para sustentar o crescimento do tumor 1. Como sugerido recentemente, CE também têm funções independentes de perfusão e formar um nicho que suporta o crescimento de células-tronco cancerígenas e outras células do estroma do tumor 2-5. Assim, altamente purificado CE (TEC) para a cultura in vitro específicos do tumor permite estudos funcionais de rotina que irá lançar luz sobre os mecanismos moleculares que medeiam a angiogênese do tumor e conversas cruzadas com células tumorais.

CE são altamente especializados, dependendo do tecido de origem 6. Devido à natureza heterogénea de diferentes tipos de tumores e o microambiente do tumor, TEC também pode exibir características únicas que reflectem uma especialização o específico de tumorf a vasculatura. Por exemplo, existe uma variabilidade notável nas assinaturas de expressão de genes em TEC isoladas de diferentes tipos ou graus de tumores 7,8. No entanto, freqüente co-purificação de não-CE, especialmente fibroblastos associados a tumores e células tumorais, com TEC pode confundir expressão de todo o genoma analisa. Estes tipos de células não desejadas são especialmente problemáticos em estudos que dependem de longo prazo expansão in vitro de culturas TEC.

Aqui descrito é um método de alta fidelidade, que produz consistentemente culturas puras CE de tumores e outros tecidos. Seguindo imunomagn�ica enriquecimento de frações da CE e remoção de co-purificado não-CE coluna, um passo de clonagem-ring adicional para capturar colônias CE puros é usado 9. Cada colônia podem ser expandidas em cultura para várias passagens sem o surgimento de contaminação não-CE. Este método também produz vários clones de CE de um único procedimento de isolamento, o qual é ideal para o estudo de endoheterogeneidade endotelial. Além disso, é mostrado que Cdh5 cre: / l ratos ZsGreen l / s repórter são uma ferramenta valiosa para gerar CE "mapeado-destino" e indelevelmente marcadas que manter ZsGreen fluorescência na cultura 10. Com pequenos ajustes para o protocolo, este método deve ser adaptável a diferentes tipos de tumores ou tecidos normais.

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Protocolo

O protocolo a seguir é realizada de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Departamento de Medicina Laboratorial Animal da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Prepare os seguintes materiais e reagentes Antes da partida

  1. Prepare meios CE, completando 400 ml de baixo teor de glucose (1 g / L de D-glucose ou LG) de Dulbecco modificado por meio Eagle (DMEM) com 50 ml de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 50 mL de Nu-Soro IV, 5 ml de antibiótico-antimicótico, e o hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, heparina e os componentes do kit comercial.
  2. Preparar 500 ml de tampão FACS (0,5% de BSA e EDTA a 2 mM em PBS); filtrar através de um estéril 0,22 um copo do filtro.
  3. Esterilizar ou desinfectar dissecando bordo.
  4. Esterilizar pinos dissecção, tesoura cirúrgica e dissectores.

2. Isolamento CE (Dia 1, ~ 5 h)

  1. Euthanize rato com dióxido de carbono ou outros métodos sagacidade compatívelh Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) políticas.
    Nota: Múltiplos tumores mamários que variam em tamanho (5 - 15 mm de diâmetro) pode se desenvolver em um único rato geneticamente modificado, como C3-tag, certifique-se de colher todos eles para o isolamento do TCE. Se estiver usando os tumores que são ortotopicamente enxertados em ratos, piscina, duas a três um centímetro 3 tumores para um único isolamento CE. Aqui usamos tumores mamários como uma demonstração, mas o protocolo pode ser modificado para outros tipos de tumores.
  2. Desinfetar rato por aspersão ou limpando o rato lado ventral com uma ampla quantidade de 75% v / v de etanol.
  3. Ressecção de tumores com um par de tesouras e pinças usando técnicas assépticas em uma capa estéril ou em uma bancada limpa.
    1. Estique-se e fixar os membros dos ratos em uma placa de dissecação. Faça uma incisão na linha média ventral com a tesoura sem abrir o peritônio. Dissecar lateralmente entre a pele e o peritoneu para as glândulas mamárias em que os tumores são localizados.Não abra o peritônio.
    2. Excise único tecido do tumor das glândulas mamárias, deixando de fora as margens mamárias normais. Corte com cuidado tecidos não tumorais, como a pele e músculos, e coloque tumores dissecados em um tubo cônico, contendo 30 ml de DMEM-LG no gelo.
  4. Trazer amostras de tumores para capa de cultura de tecidos; lavar tecidos com estéril LG-DMEM 1 - 2 vezes.
  5. Tumores transferência do tubo cônico para um estéril cultura de tecidos de petri prato, adicione 2 ml de DMEM-LG no prato, e pique com um par de tesouras estéreis em pedaços <5 mm.
  6. Adicionar 5 ml de colagenase (banco = 2 mg / ml em solução salina equilibrada de Hank, daqui em diante HBSS), 1 ml de dispase (estoque = 2,5 U / mL em HBSS) e 75 ul de desoxirribonuclease (estoque = 1 mg / ml em PBS ) para dentro do prato de petri. O volume total é agora ~ 10 ml.
  7. Transferir a mistura de colagenase / tecido do prato de Petri para um tubo de tecido-Dissociator e executado em um Dissociator tecido durante 60 segundos duas vezes (pré-definido de dissociação PRogram no Dissociator: 1.270 Total de Rodadas por corrida). Incubar com luz agitando num agitador durante 75 min a 37 ° C.
  8. Filtro de tecido digerido através de um filtro de células de 100 mm ao longo de um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 5 ml de tampão de FACS para lavar quaisquer células restantes. Girar a 280 xg durante 5 min e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento celular.
  9. Dilui-se 1 ml de tampão de lise de RBC estoque (10x) em 9 ml de água estéril. Lisar células vermelhas do sangue com 10 ml de tampão de lise (1x), e imediatamente girar 5 min a 280 x g. Nota: Esta etapa pode ser ignorada se pouco sangue é visível.
  10. Ressuspender em 10 ml de tampão de FACS. Misturar 10 ul de suspensão celular com 10 ul de azul de tripano e contagem de células vivas utilizando um hemocitómetro.
  11. Ressuspender as células em 10 ~ 7 células / 100 uL. Adicionar 10 ul de FcR bloco por 100 ul de suspensão de células, e incuba-se em gelo durante 10 min.
  12. Adicionar anticorpo CD31 anti-rato rato conjugado com PE de acordo. a Tabela 1 Incubar em gelo durante 10 - 15 minutos e o tubo de filme ocasionalmente.
  13. Adicionar 10 ml de tampão de SCAF e para o tubo de centrifugação a 280 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente, e lava-se a pelete de células novamente com 5 mL de tampão de FACS. Centrifugar para sedimentar as células. Aspirar o sobrenadante sem perturbar sedimento celular.
  14. Adicionar tampão e anti-PE FACS microesferas de acordo com a Tabela 2 Incubar em gelo durante 10 -. 15 min. Tubo Flick ocasionalmente.
  15. Adicionar 10 ml de tampão de amostras e de rotação a 280 xg FACS durante 5 min; lavar uma vez com 5 mL de tampão de FACS e centrifugar novamente. Aspirar o sobrenadante sem perturbar pellet.
  16. Levar o volume até 300 ml em tampão de SCAF. Gire a 35 mm de células-filtro tampado tubo 5 min a 280 x g. Utilize tubos 2 e um volume maiores, se necessário.
  17. Configurar multistand magnética e colunas magnética na capa, uma coluna para fixar o separador e equilibrar a coluna com 2 mL de tampão de FACS.
  18. Aspirate o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 0,5 - 1 ml de tampão de FACS.
  19. Passar a suspensão de células através de uma coluna magnética equilibrada.
  20. Lava-se a coluna três vezes com 2 ml de tampão de FACS, e recolher o fluxo de passagem (FT) em um tubo de 15 ml (fracção FT).
  21. Aqui a coluna fora do separador e elui-se com 2 mL de tampão de FACS para outro tubo de 15 ml (fracção de eluato). Use êmbolo para assegurar que todas as células estão a sair da coluna. Repetir a eluição duas vezes mais com 2 ml de tampão de FACS de cada vez.
  22. Girar o eluato a 280 xg durante 5 min.
  23. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de CE.
  24. Igualmente dividir a fracção de eluato (~ 6 ml) em placas revestidas com gelatina de 10 cm. Para três tumores 1 3 cm, placa de células eluída em pelo menos quatro placas. Células Alternativamente, placa eluidas a diferentes concentrações em várias placas (por exemplo., De sementes de 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml e 3 ml do eluato em quatro placas) para garantir que umt menos uma placa de baixa densidade é semeada com células eluídas. Verificar que a confluência das células ligadas é a ~ 1% no dia seguinte (ou seja, aproximadamente 1,0 - 2,0 x 10 5 células ligadas).
    Nota: As células têm de ser banhado escassa, de forma que podem formar colónias CE sem ser contaminado por outros tipos de células.
  25. Placa fração FT em uma placa de 10 cm para permitir que as células recuperar O / N. Verificar que a placa é de 80 - 100% confluentes no dia seguinte. Congelar-se as células (-80 ° C) em 250 meios de congelamento de células em um ul cryotube e armazená-los em nitrogênio líquido no dia seguinte. Nota: fracção FT pode ser usado para isolamento de células de tumor numa fase posterior, e / ou como um controlo negativo para a análise dos clones isolados a expressão do gene da CE CE.
  26. Mudança de mídia a cada 2 - 3 dias. Colónias começam a se formar após 7 - 10 dias. As pequenas colónias CE pode ser identificado como o mais cedo dia 3. Marcar as colónias com um marcador de ponta fina na parte inferior do prato.
  27. Raspar não específica cells que cercam as colônias identificadas com um estéril 200 ul pippet ponta.

3. Colony Seleção Anéis Usando Clonagem

  1. Mudança de mídia a cada 2 - 3 dias. CE pureza pode ser verificada por LDL (DII-Ac-LDL) além de cerca de 5-7 dias. Adicionar 50 ul de LDL por 10 ml de meio CE e incubar por 3-4 horas antes de verificar as células em microscópio de fluorescência.
    Nota: LDL Múltipla + clones CE pôde ser observada a ~ 7 dias.
  2. Comece a colheita colônias CE quando atingem diâmetros de 3 - 5 mm de tamanho. (Escolha grandes colônias que são embalados com pequenas células de LDL + para obter melhores resultados.)
  3. Antes da colheita CE com anéis de clonagem, pré-coat algumas placas de 6 poços com 0,5% de gelatina. Aspirar gelatina, adicionar 2 ml de meio CE a cada poço, e manter as placas em uma incubadora até que seja necessário.
  4. Raspar não-CE nas bordas das colónias para se certificar não há outros tipos de células irá ficar preso entre o anel de clonagem.
  5. Usando ummicroscópio de contraste de fase (4x ou 10x objectivo), o contorno com um marcador de ponta fina na parte inferior da placa de cultura as áreas que continham colónias CE.
  6. Lava-se a placa com 10 ml de PBS e deixar uma camada muito fina de PBS na placa quando a aspiração. (Importante: uma pequena quantidade (~ 0,5 ml) de PBS vai manter as células vivas durante o procedimento de clonagem de anel, também, adesivo de tecido precisa de água para se relacionar.)
  7. Escolha um anel de clonagem de tamanho apropriado. Use um par de pinças de dissecação para pegar um anel, e com uma pipeta de ponta 10 ul aplicar uniformemente uma pequena quantidade de adesivo tecidual sobre o anel de clonagem.
    Nota: usar apenas uma quantidade mínima (~ 0,2 mL para um pequeno anel) de adesivo de tecido em anéis de clonagem, e fazer adesivo de tecido certeza é se espalhar uniformemente ao redor da superfície do fundo para garantir uma boa vedação. Adesivo tecidual excessiva produz calor e faz filmes que podem matar as células.
  8. Coloque o anel de clonagem sobre a colônia CE. Pressione suavemente para baixo o anel de clonagem para colar as ring sobre a placa. Certifique-se de que as colônias não estão secas antes de colar o anel.
  9. Imediatamente pipeta 25 ul de solução de separação celular enzimática para dentro do anel de clonagem e incubar ~ 1 min ou até que as células são frouxamente ligado.
  10. Pipetar as células no anel clonagem gota a gota, para um poço de uma placa de 6 poços contendo meio CE pré-aquecido. (Importante: Não agite a placa para dispersar as células; CE preferem crescer em clusters apertados.) Lave o anel de clonagem com 50 - 100 media CE ul para coletar tantas células quanto possível, e transferir todas as lavagens na mesma 6 poços .
  11. Se algumas colônias na placa de 10 cm são demasiado pequenas para colher, adicionar 10 ml de mídia fresco, deixar as colônias crescer por mais alguns dias, e repita o procedimento de clonagem anel novamente.
  12. Cresça colhidas colónias em placas de 6 poços até 80 - 100% confluentes, e transferência de células a 3 poços de uma placa de 6 cavidades, antes de se expandir-los em uma 10 cm prato de cultura de tecidos. Raspe as células contaminantes. Repitaoutra rodada de procedimento anel de clonagem (Passos 3,5-3,10), se necessário. Mantenha as células relativamente confluente (~ 60 - 70%) quando se expandindo. CE pode parar de crescer, se banhado muito escassa.
  13. Caracterizar CE por FACS, coloração, PCR, etc. Note que Dil-Ac-LDL é fluorescente e pode interferir com PE ou outros anticorpos fluorescentes para FACS.

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Resultados

CE representam apenas uma fracção pequena da população total de células na maioria dos tecidos adultos 11. É, portanto, importante para digerir completamente o tecido colhido numa suspensão de célula única que assegura a libertação máxima de CE de matriz extracelular (ECM) e tecidos conjuntivos. Em nossa experiência, a seleção imunomagn�ica mediada por CD31 só fornece frações CE enriquecidos mas não puros; portanto, um passo crucial é a remoção física de co-purificado não-CE e seleção / expansão de colônias...

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Discussão

Devido às dificuldades na obtenção de culturas puras TEC primária, muitos estudos in vitro TEC substituto com linhas CE comercialmente disponíveis ou CE primário, como veia umbilical humano CE (HUVEC) 13. No entanto, essas populações da CE a partir de tecidos normais só podem servir como uma proxy para a TEC que diferem marcadamente dos seus homólogos normais. Por exemplo, a TEC são fenotipicamente e funcionalmente anormal in vivo e algumas destas alterações podem ser transmissível in vi...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

ACD é apoiado por uma bolsa do National Institute of Health (R01-CA177875). LX é membro do programa de medicina translacional financiado pelo HHMI na UNC Chapel Hill. A JVM é apoiada por uma bolsa de pré-doutorado T32 do Programa de Biologia Vascular Integrativa da UNC Chapel Hill. Agradecemos a Clayton Davis pela assistência com a microscopia confocal.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antibiótico-Antimicótico Sigma-AldrichA5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)Gibco11885-084
EGM-2 Bullet Kit LonzaCC4176Nem todos os componentes usados
Soro bovino fetal (Hyclone)Thermo ScientificSH30071.03Calor inativado a 56 > C por 30 min
Nu-Serum IVCorningCB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)Gibco14175-095
Phosphate-buffered salina (PBS)Gibco14190-144
FACS buffer 0,5% BSA e 2 mM EDTA em PBS, filtrado através de um 0,22 μ filtro m
75% v/v etanol para desinfecção
Microesferas anti-PE Miltenyi Biotech130-048-801
Albumina de soro bovino (BSA) fração V, 7.5%Gibco15260-37
Meio de congelamento celular (Bambanker)Wako Chemicals302-14681
Colagenase tipo II   Worthington BiochemicalLS004176Fazer concentração de estoque de 2 mg / ml em HBSS
Desoxirribonuclease I (DNase)Worthington BiochemicalLS002004Fazer concentração de estoque de 1 mg / ml em PBS
Dil-Ac-LDLBiomedical TechnologiesBT-902
EDTA, 0,5M, pH 8,0Cellgro46-034-CL
Solução de desprendimento de células enzimáticas (Accutase)Gelatina Sigma-AldrichA6964-100ML
, 2% em água, grau de cultura de tecidosSigma-AldrichG1393-100MLDiluir em PBS para fazer solução de gelatina a 0,5%
Reagente de Bloqueio FcR de Camundongo Miltenyi Biotech130-092-575
Protease neutra (Dispase)Worthington BiochemicalLS02104Concentração de estoque de 2,5 U / ml em HBSS
PE-rat anti-camundongo CD31 anticorpo BDPharmingen553373
tampão de lise RBC (BD Pharm Lyse)BD Pharmingen555899
Água
Azul de tripano, 0,4 % Life Technologies15250-061
Placas de cultura de tecidos de 10 mm TubosCorning
de 15 ml (estéreis)Corning
de 50 ml (estéreis) Placas
de 6 poçosTubos
(gentleMACS) C tubes) Miltenyi Biotech130-093-237
Separador de Células  (MidiMACS)Miltenyi Biotech130-042-302
Filtro de células 100 μ m Corning352360
(tamanhos sortidos)Bel-Art Products378470000
CryotubesThermo Scientific
PlacaEsterilize ou desinfete com etanol a 75% v/v antes de usar 
Pinça e tesouraEsterilize antes de usar 
Pinos de dissecação 2"Esterilize antes de usar 
Tubos FACS com 35 μ m tampa do filtroCorning352235
Copo de filtro (Stericup, 0.22 μ m)MilliporeSCGPU05RE
Marcador
Hemocitômetro
LS ColunasMiltenyi Biotech130-042-401
Multistand magnéticoMiltenyi Biotech130-042-303
Adesivo tecidual (Vetbond)Centrífuga
Eppendorf5810ROu uma centrífuga com capacidade semelhante para centrifugação de tubo cônico de 15 ml e 50 ml
Capuz
Dissociador de tecidos (gentleMACS)Miltenyi Biotech130-093-235Programa predefinido "m_impTumor_01" usado para dissociação de tecidos 
Congelador
Microplaca ou agitador
Microscópio
estéril cônicos Tubos cônicos de cultura de tecidos Corning dissociadores de tecidos Corning Anéis de clonagem de dissecação de dissecação de ponta fina 3M 1469SB de cultura de tecidosde nitrogênio líquidorotativo de luz de contraste de fase

Referências

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