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Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

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DOI:

10.3791/53073

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1 de dezembro de 2015

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1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Neste artigo

Resumo

Apresenta-se um protocolo experimental para formar uma bicamada lipídica suportado sobre substratos sem a utilização de vesículas lipídicas. Nós demonstramos um método de um só passo para formar uma bicamada lipídica em dióxido de silício e ouro, bem como membranas suportadas com o domínio enriquecida em colesterol durante várias aplicações biológicas.

Resumo

A fim de imitar as membranas celulares, a bicamada lipídica suportado (SLB) é uma plataforma que permite atraente na investigação de processos in vitro relacionadas com a membrana, enquanto que confere biocompatibilidade e biofuncionalidade a substratos sólidos. A adsorção e ruptura espontânea de vesículas fosfolipídicas é o método mais comummente utilizado para formar SLBS. No entanto, sob condições fisiológicas, a fusão das vesículas (VF) é limitado a apenas um subconjunto das composições de lipidos e suportes sólidos. Aqui, nós descrevemos um procedimento geral de um chamado passo do método de formação assistida por solvente bicamada lipídica (SALB), a fim de formar SLBS que não necessita de vesículas. O método envolve SALB a deposição de moléculas de lípidos sobre uma superfície sólida, na presença de solventes orgânicos miscíveis em água (por exemplo, isopropanol) e subsequente troca de solvente com uma solução aquosa de tampão, a fim de provocar a formação de SLB. O passo de troca de solvente contínua permite a aplicação dométodo em uma configuração de fluxo adequado para a formação de bicamada monitorização e alterações subsequentes que utilizam uma vasta gama de biossensores sensíveis à superfície. O método SALB pode ser usado para fabricar SLBS sobre uma vasta gama de superfícies sólidas hidrofílicos, incluindo aqueles que são intratáveis ​​a fusão das vesículas. Além disso, permite a fabricação de compostos SLBS de composições de lípidos que não pode ser preparado utilizando o método de fusão das vesículas. Nisto, nós comparar os resultados obtidos com os métodos de fusão de vesícula SALB e convencionais em duas superfícies hidrofílicas ilustrativos, dióxido de silício e ouro. Para optimizar as condições experimentais para a preparação das bicamadas de alta qualidade preparados através do método de SALB, o efeito de vários parâmetros, incluindo o tipo de solvente orgânico no passo de deposição, a taxa de permuta de solvente, e a concentração de lípido é discutido juntamente com dicas de resolução de problemas . Formação de membranas apoiadas contendo altas frações de colesterol é também demôniostrados com o método SALB, destacando as capacidades técnicas da técnica SALB para uma ampla gama de configurações de membrana.

Introdução

O sólido suportado bicamada lipídica 1 (SLB) é uma plataforma versátil que preserva as características básicas das biomembranas tais como a espessura da bicamada, difusividade lípido bidimensional, e a capacidade de acolher biomoléculas associadas a membranas. Devido à complexidade das membranas celulares naturais, esta plataforma simples tem sido demonstrado funcionar como uma plataforma eficiente para estudos in vitro de processos relacionados com a membrana, tais como formação de jangada 2, proteína de ligação 3, vírus e ligação partícula semelhante a vírus 4,5 e sinalização de 6 células. Formou-se em estreita proximidade com um suporte sólido, a plataforma SLB é compatível com uma gama de medições de superfície sensível técnicas tais como microscopia de reflexão interna total (TIRF), microbalança de cristal de quartzo de dissipação (QCM-D), e espectroscopia de impedância.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para produzir diferentes tipos de SLBS bolha de ar, incluindocolapso 7 e dip-pen nanolithography 8 para pontos de lipídios tamanho submicrométricas-, 9 para pilhas bicamada e Langmuir-Blodgett (LB) de 10 e fusão de vesícula (VF) 11 para full-spanning, revestimentos bicamada lipídica individuais de revestimento de spin. O método consiste em FV a adsorção de pequenas vesículas unilamelares a um suporte sólido e subsequente ruptura espontânea e fusão para formar uma bicamada lipídica contínua. No entanto, sob condições fisiológicas, rotura espontânea de vesículas é principalmente limitada a materiais à base de silício, tais como o dióxido de silício, vidro, e mica. Além disso, a ruptura de vesículas não ocorre espontaneamente em vesículas de composições de lípidos complexos, tais como aqueles contendo elevadas fracções de colesterol ou lípidos carregados negativamente. Dependendo do sistema, a ruptura da vesícula pode ser induzida através da adaptação ainda mais as condições experimentais, tais como a temperatura de 12, o pH da solução de 13, 14 e salinidade, choque osmótico 15 16 ou a pressão, ou a adição de iões divalentes, tais como Ca 2+ 17. Alternativamente, o péptido HA-activo da membrana pode ser introduzido, de modo a desestabilizar uma camada de vesículas adsorvidas, levando a ruptura das vesículas e formação de bicamada numa gama de superfícies 18-22.

Além disso, a formação de bicamada bem sucedida requer uma preparação de uma população bem controlada de pequenas vesículas unilamelares, que pode ser demorado e difícil de conseguir para certas composições de membrana. Portanto, apesar da sua elevada eficiência, em casos ideais (por exemplo, depois de extensa pré-tratamento de congelamento-descongelamento de vesículas 23), a aplicação geral de fusão das vesículas está limitado pelo âmbito de substratos adequados e composições de membrana.

O método assistido por solvente 24-28 bicamada lipídica (SALB) é uma técnica de fabricação alternativo que não requer vesículas lipídicas. O método baseia-se na deposição óf moléculas lipídicas sobre uma superfície sólida, na presença de um solvente orgânico miscível com água, seguido por troca gradual de este solvente com uma solução tampão aquosa, a fim de provocar a formação de SLB. Durante o passo de permuta de solvente, a mistura ternária de lípidos, solvente orgânico, e a água passa por uma série de transições de fase com o aumento da fracção de água, o que leva à formação de estruturas de fase lamelar em solução em massa e um SLB no substrato sólido. Importante, este trajecto de auto-montagem evita a necessidade de ruptura de vesículas, que geralmente é o passo limitante para a transformação de vesículas adsorvidos num SLB. O protocolo é aplicável a uma ampla variedade de superfícies, incluindo o dióxido de silício, óxido de alumínio, de cromo, óxido de índio e estanho e ouro. Neste papel e no vídeo acompanhante, uma comparação de deposição de lípidos pela SALB e métodos de fusão de vesículas é apresentado. Em particular, a influência dos parâmetros experimentais, incluindo a concentração de lípido, A taxa de fluxo, e a escolha de água solvente orgânico miscível, sobre a qualidade da bicamada formado pelo método SALB são discutidos. A caracterização analítica dos SLBS fabricados é realizada pela QCM-D, microscopia de fluorescência, e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) técnicas. Monitorização QCM-D é uma técnica de medição de massa sensíveis à superfície que, uma vez que o trabalho pioneiro conduzido por Keller e Kasemo 29, tem sido amplamente utilizada para investigar quantitativamente formação em bicamada. A microscopia de fluorescência permite a inspecção de homogeneidade da membrana, bem como a visualização de domínios de membrana. A técnica FRAP é uma ferramenta padrão para determinar a mobilidade lateral das moléculas de lípidos em uma SLB, que é uma propriedade essencial das membranas fluídicos.

A primeira parte deste estudo envolve a análise QCM-D do SALB e métodos de fusão de vesículas aplicada para tentar a formação de bicamada em dióxido de silício e ouro. Na segunda parte,a preparação e caracterização das membranas de suporte contendo uma gama de concentrações de colesterol com o método SALB são demonstradas e os resultados são comparados com os obtidos pelo método de fusão das vesículas.

Protocolo

1. Formação da bicamada lipídica suportados sobre um suporte sólido Hidrofílico

  1. Preparar soluções de lípido de 10 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-fosfocolina (DOPC) e 1 mg / ml de 1,2-sn-glicero-dioleoyl- 3-phosphoethanolamine- N - (lissamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por dissolução dos respectivos pós de lípidos (devidamente pesado previamente com um balanço de massa analítica) em solução de isopropanol.
  2. Dilui-se e misturar as soluções de reserva em isopropanol a fim de preparar a mistura de lípidos desejada na concentração final. Para a microscopia de fluorescência e FRAP experiências, 0,5% em peso de Rh-PE deve ser incluído na mistura lipídica.
  3. Injectar a mistura de lípidos em isopropanol para dentro do canal microfluídico até que seja preenchido.
  4. Incubar a mistura de lípidos na superfície de vidro durante cerca de 10 min.
  5. Substituir gradualmente a solução de lipidos com água ou solução de tampão utilizando uma bomba peristáltica a um caudal muito baixo(10-50 ul / min). Alternativamente, substituir a mistura de lípidos por pipetagem repetida.
  6. Enxaguar minuciosamente o canal com o tampão em excesso, de modo a remover o isopropanol residual.

2. formação das membranas suportadas enriquecidas com colesterol

Nota: A superfície sólida (SiO2) apoia fusão de vesícula, mas a composição da membrana (colesterol alto) inibe a fusão das vesículas porque vesículas enriquecidas com colesterol têm alta rigidez de flexão 30.

  1. Prepara-se uma solução de reserva contendo 10 mg / ml de lípido DOPC, 10 mg / ml de colesterol, e 1 mg / ml de Rh-PE dissolvendo em primeiro lugar os respectivos pós em isopropanol.
  2. Repita os passos 1,2-1,6 utilizando as soluções de reserva preparada no passo 2.1.

3. Fluidez de Membrana Assay

  1. Imergir a lâmina de vidro na solução de sulfato de dodecil de sódio (SDS) (1%) durante 10 min.
  2. Lavar as lâminas cuidadosamente com água deionizada e lave sagacidadeh etanol.
  3. Seque slides usando uma corrente suave de azoto.
  4. Expor os slides a plasma de oxigênio durante 30 segundos à potência máxima de radiofreqüência na câmara de plasma de oxigênio.
  5. Remova o revestimento de película protetora do fundo comercial câmara microfluídicos (Figura 1A), usando uma pinça e coloque a lâmina de vidro para o lado pegajoso da câmara (Figura 1B).
  6. Montar os conectores e tubagens para as posições de entrada e de saída da câmara e colocar o canal microfluídico na platina do microscópio (Figura 1C).
  7. Formar uma bicamada lipídica fluorescentemente marcado suportado no canal microfluídico [repetir o passo 1, utilizando a composição de lípido desejada (por exemplo, 0,5 mg / ml de DOPC), incluindo 0,5% em peso de Rh-PE em solvente orgânico].
  8. Localizar o plano da bicamada com uma objectiva de imersão em óleo de 60X (NA 1.49), a fim de capturar as imagens.
  9. Tome duas imagens pré-branqueamento, em seguida, foto-branqueador a 301; m de largura ponto circular com um feixe de laser de 532 nm mW, 100. Antes de fotodegradação, aquecer o laser até sua intensidade tornou-se estável. Imediatamente após a fotodegradação, captar uma série de imagens a cada 1 s durante 2 minutos, a fim de seguir a recuperação da intensidade de fluorescência no local branqueada.

4. O colesterol Quantificação Assay

  1. Expor o chip sensor de silício de cristal de quartzo revestido de dióxido de plasma de oxigénio durante 30 segundos à potência máxima de radiofrequência na câmara de plasma de oxigénio. Remover o chip da câmara e imediatamente montar o chip na câmara de medição.
  2. Antes da experiência, em primeiro lugar adquirir a frequência e a dissipação do chip do sensor no ar, a fim de garantir uma montagem correcta.
    1. Para que o instrumento Q-Sense E1 ou E4 QCM-D comercial, execute o programa de software Q-Soft e clique em "Aquisição" e selecione "Medição Setup".
    2. Na nova janela que aparece, verifique a 3, 5, 7, 9, 11 e 13 tons e, em seguida, clique em Localizar e executar, a fim de verificar o espectro de ressonância. Definir a temperatura a 24 ° C. Se uma ou mais freqüências de ressonância não concordar com os valores esperados, verificar o chip de montagem e re-executar esta etapa até que seja alcançado um acordo.
  3. Comece a bomba peristáltica e o fluxo da solução tampão (10 mM Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5) para a câmara de medição a uma taxa de fluxo de 100 mL / min.
  4. No programa de software, clique em "Aquisição" e selecione "Restart Medição", a fim de gravar os sinais de dissipação de frequência de ressonância e de energia. Repita este passo até uma linha de base estável é obtido para os deslocamentos de frequência e de dissipação. Nota: Para ver as etapas a seguir, haverá deslocamentos de frequência e de dissipação adicional que pode ser registada como uma função do tempo.
  5. Injectar isopropanol (sem lípido) durante 10 min.
  6. Injectar a mistura de lípido DOPC / colesterol norazão molar desejada, com uma concentração de lípido total de 0,5 mg / ml em isopropanol, durante 10 min.
  7. Injectar tampão durante 20 min a um caudal de 100 ul / min.
  8. Injectar uma solução de 1 mM de metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado em tampão (caudal 100 l / min) até que o sinal de frequência atinge um valor estável.
  9. Medir as mudanças de freqüência positivos relativos que é causada pela etapa de tratamento MβCD e calcular a massa de colesterol e DOPC lipídios, convertendo os valores Af cho e Af DOPC para valores de massa, usando a equação de Sauerbrey [Dm = - (C / n) × Af, em que C = 17,7 ng / cm 2, N: Bifónico].
  10. Calcula-se a fracção molar de colesterol no SLB, tendo em conta os pesos moleculares de lípido DOPC (786,1 g / mol) e colesterol (386,6 g / mol).

Resultados

Fabricação de bicamadas lipídicas suportados em substratos hidrofílicos.

Os métodos de formação de VF e SALB foram tentadas em dióxido de silício e ouro, e os processos de formação foram monitorados em tempo real por meio da técnica de medição QCM-D. Os QCM-D instrumento mede alterações na frequência de ressonância (f Δ) de um cristal de quartzo piezoeléctrico oscilante sobre a adsorção de massa para a superfície do cristal. Além disso, o instrumento QCM-D mede a dissipação de energia de oscilação, a fim de caracterizar as propriedades visco-elásticas (rigidez e suavidade) do adlayer. Experimentos fusão das vesículas foram realizados como previamente descrito 31. Resumidamente, uma linha de base foi estabelecida em primeiro lugar para os sinais de frequência e de dissipação em solução aquosa de tampão [Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5; (Figura 2A e B)]. Em seguida, pequenas vesículas lipídicas unilamelares DOPC no mesmo tampão foram emprojetada em t = 10 min (seta 1) sobre dióxido de silício (Figura 2A) e o ouro (Figura 2B). Para a fusão das vesículas em dióxido de silício, cinética de adsorção em duas etapas foram observados com mudanças finais na frequência e dissipação de energia de -26 (± 1) Hz e 0,3 (± 0,2) x 10 - 6, respectivamente. Estes valores são consistentes com a formação de uma bicamada lipídica 29 suportado.

Tal como mostrado na Figura 2B, a adição da solução de vesícula para a superfície de ouro levou a uma redução simultânea e aumento da f e Δ D sinais ô, respectivamente, até que os seus valores atingido -150 (± 10) Hz e (7,5 ± 2) × 10 - 6, respectivamente. Estes valores correspondem à formação de uma camada adsorvida vesícula. Assim, como esperado, uma SLB não foi formada em ouro através do método de fusão das vesículas.

QCMD análise para a formação de bicamada em dióxido de silício e ouro pelo método SALB é apresentada na Figura 2C e D. Em dióxido de silício, e f ô Δ D turnos finais de -25,6 (± 0,55) e 0,4 Hz (± 0,27) x 10 - 6, respectivamente, foram alcançados e estes valores indicam a formação de um SLB. Gamas semelhantes de Δ f e Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10 - 6) foram observadas em ouro. Estes resultados confirmam que o método permite SALB formação de bicamadas lipídicas suportados em superfícies que impedem a ruptura da vesícula.

Efeito da taxa de fluxo de solvente de troca sobre a qualidade de bicamadas lipídicas suportados.

Para determinar as condições ideais para a fabricação de alta qualidade apoiados bicamadas lipídicas vium método SALB, a influência da concentração de lípidos, a taxa de troca de solvente e a escolha do solvente orgânico foram examinados.

A Figura 3 mostra a variação da frequência QCM-D durante a etapa final do protocolo SALB, como realizado em dióxido de silício em duas taxas diferentes de fluxo (100 e 600 ul / min) e duas concentrações de lipidos diferentes (0,125 e 0,5 mg / ml) .

Quando foi usado 0,5 mg / ml de lípido DOPC (Figura 3A), a formação de bicamada não foi afectada pela taxa de fluxo e um deslocamento final, de cerca de -26 Af Hz foi obtida em ambas as taxas de fluxo.

Em contraste, quando uma concentração de lípido mais baixo foi usado, a quantidade de lípido adsorvido depois de troca de solvente total foi significativamente afectada pela taxa de fluxo (Figura 3B). A uma taxa média de fluxo de 100 mL / min, formação em bicamada foi completa (Af em torno de -26 Hz). No entanto, a um caudal de 6 vezes mais elevada (600? L / min), uma camada dupla completa não foi formada (Af em torno de -17 Hz). Estes resultados fornecem uma orientação para a escolha das condições experimentais adequadas para a formação de bicamada sucesso utilizando o método SALB com isopropanol como solvente orgânico de escolha.

Caracterização das bicamadas lipídicas formadas a partir de diferentes apoiadas concentrações lipídicas em várias soluções de álcool.

Concentração de lípido é um outro parâmetro que afecta a qualidade dos SLBS obtidos usando o método de SALB. A microscopia de fluorescência revelou que, a 0,05 mg / ml de concentração de lípidos, apenas estruturas lipídicas isoladas, sub-microscópicas foram formadas (Figura 4A). Com o aumento da concentração de lípido usado no processo de SALB, a intensidade de fluorescência das estruturas de lípidos tornaram-se mais homogéneo. A 0,1 mg / ml de concentração de lípidos, havia manchas lipídicas microscópicas embora as estruturas não atravessam por toda a field de vista (Figura 4B). No entanto, quando 0,25 mg / ml de concentração de lípido foi usada, uma bicamada lipídica homogénea foi formada (Figura 4C). Portanto, existe uma concentração mínima de lípido requerida para formar um sistema completo, completa-medindo SLB.

A influência da concentração de lípido sobre o resultado final das experiências SALB também foi examinada ao longo de uma gama mais larga de concentração de lípidos (0,01 a 5 mg / ml) e em diferentes solventes orgânicos (isopropanol, etanol, e n-propanol). A valores Δ D correspondente ao passo final do processo de SALB f Δ e são apresentados na Figura 5.

Definiu-se a formação de duas camadas com base em mudanças na frequência finais e dissipação de energia entre -25 e -30 Hz e inferior a 0,5 x 10 -6, respectivamente. Com base nestes critérios, a gama de concentração óptima de lípido para formar uma bicamada lipídica suportado foi determinado para ser entre 0,1 e 0,5 mg/ ml em grande parte independentes do tipo de solvente orgânico. Os desvios na Δ F e Δ D adquirida desloca fora do intervalo acima mencionado é devido à presença de massa adicional (por exemplo, pilhas de duas camadas), a ocorrência de morfologias não-bi-camada (por exemplo, vesículas semelhantes a vermes micelas), e a presença de ilhas de bicamada fragmentados com morfologia incompleta ao longo do substrato.

Enquanto o procedimento de SALB obtidos bicamadas lipídicas suportados é relativamente robusta, a concentração de lípido optimizada para a formação de bicamada de alta qualidade pode exigir ajuste dependendo da configuração experimental específica. Basicamente, não há apenas um mínimo de concentração de lípidos, mas também uma concentração máxima de lípidos necessária para a formação de bicamada óptimo através do método SALB. A gama de concentração óptima depende da taxa de fluxo e também pode ser ser afectada pela composição do substrato e dos lípidos. Empiricamente, em muitos casos, temos found que uma concentração de lípido de 0,5 mg / ml e uma taxa de fluxo de 100 mL / min é o melhor conjunto de condições para a formação de uma bicamada lipídica homogéneo suportado. No entanto, dependendo da composição lipídica e célula de fluxo geometria-o último dos quais afecta o perfil de fluxo durante a optimização da concentração de lípido-solvente adicional de troca pode ser necessário. Assim, recomendamos a realização de experimentos piloto SALB usando um 0,5 mg / ml concentração de lipídios e avaliar a qualidade bicamada utilizando as técnicas de microscopia QCM-D ou de fluorescência. Se as camadas duplas aparecem incompletos, então a concentração de lipídios deve ser aumentada em incrementos de 10% até serem alcançados resultados satisfatórios. Se a bicamada parece co-existir com estruturas de lípidos adicionais, em seguida, a concentração de lípido deve ser diminuída em incrementos de 10% até se obterem resultados satisfatórios.

Fabricação de bicamadas lipídicas suportados com diferentes composições de lípidos e dfrações de colesterol ifferent.

Em seguida, os métodos de SALB e VF foram empregues, de maneira a formar SLBS enriquecidas com colesterol. A Figura 6 mostra imagens de fluorescência representativos (100 x 100 mm) de membranas contendo colesterol suportados preparados pelo método SALB. As membranas consistem em domínios excluídos-dye em forma circular cercado por uma fase contínua caracterizados pelo brilho fluorescente uniforme. Os domínios escuro aumentou com o aumento na área fracção de colesterol na mistura precursora de lípidos. Em seguida, foram realizadas medições de FRAP, a fim de examinar a fluidez da bicamada lipídica das películas. As medições de fluorescência FRAP revelou recuperação quase completa na fase circundante, o que indica a mobilidade lateral dos lípidos e, assim, a formação de uma única bicamada lipídica. Desde partições Rh-PE preferencialmente na fase de fluido, os domínios escuras são provavelmente composto de estruturas densas enriquecidas com colesterol.

Para efeitos de comparação, o fabrico de bicamadas DOPC / Chol, usando o método da VF foi também tentada. DOPC vesículas com o aumento de colesterol (fracções 10 - 40% mol) foram preparados pelo método de vesículas de extrusão. Rh-PE lipídico (0,5% em peso) foi utilizada como marcador para imagiologia fluorescente. A Figura 7 mostra imagens de fluorescência representativos (100 x 100 mm) de estruturas criadas por incubação dos substratos de vidro com vesículas contendo colesterol. FRAP análise mostrou a formação de uma bicamada lipídica fluídica usando vesículas que continha 20% em mol ou menos Chol. No entanto, as amostras preparadas usando vesículas com fracções de colesterol mais elevados não apresentaram recuperação, indicando a presença de vesículas adsorvido mas não rotos.

A fracção de colesterol que acabou por ser incorporados nas bicamadas lipídicas suportados foi quantificada como uma função da fracção de colesterol que tinham sido incluídos no lábio precursorID mistura em solvente orgânico no método SALB ou nas vesículas em solução aquosa no método VF. Usando a técnica QCM-D, formação em bicamada foi monitorizada e, em seguida, foi adicionado MβCD, a fim de extrair especificamente Chol das bicamadas lipídicas com suporte 32. A perda de massa devido à remoção de colesterol conduziu a uma diminuição do valor absoluto do deslocamento de frequência (| ô f |) associado com o SLB. Os desvios de frequência positivos relativos provocados por o passo de tratamento MβCD são mostrados na Figura 8A. A fracção molar de colesterol foi calculada com base no desvio de frequência, tal como apresentado na Figura 8B.

A fracção de colesterol incorporado em bicamadas lipídicas suportados preparados pelo método SALB era quase linearmente proporcional ao teor de colesterol na mistura precursora de lípidos. Curiosamente, a fracção de colesterol em bicamadas preparado pelo método VF (vesículas contendo até20 mol% Chol) foi substancialmente mais baixa do que a contida nas vesículas precursoras. Na verdade, a maior fracção de colesterol obtido pelo método VF foi de apenas cerca de 10% molar.

Observação de listra superestrutura na região de co-existência de duas fases β de colesterol-fosfolípido suportado bicamadas lipídicas.

SALB experiências foram ainda realizados usando uma mistura de lípidos com uma fracção ainda maior de colesterol. Quando um 4: 6 foi utilizada mistura de DOPC e colesterol, um desmistura gradual de uma fase líquida uniforme em duas fases coexistentes visualizadas como domínios em forma de listras brilhantes sobre um fundo escuro (excluindo-corante) foi observado (Figura 9). Está estabelecido que Rh-PE é excluído de domínios ricos em colesterol 33 e, consequentemente, os domínios escuros predominantes que apareceu como pano de fundo são regiões enriquecidas com colesterol. A formação de domínios brilhantes micronizadas em um fundo escuro a oifracção de colesterol GH (> 50% em mol) é consistente com o β região no diagrama de fase monocamada de fosfolípidos de colesterol / misturas 34,35. Além disso, a formação de domínios de banda, que surgem a partir de uma linha de tensão fraca, sugere que a mistura é perto de um ponto crítico a miscibilidade.

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Figura 1. Microfluidic câmara para formação de SALB numa configuração adequada para a microscopia de epifluorescência. (A) da câmara de microfluidos comercial, (B) ligado lamela de vidro para o lado adesivo da câmara, (C) A configuração completa num suporte de microscópio com tubagem ligada em as portas de entrada e de saída da câmara, e (D) da bomba peristáltica usada para controlar a taxa de troca de solvente. Os lípidos dissolvidos em isopropanol são injectados na medição chamber com o auxílio da bomba peristáltica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Análise de QCM-D de fusão das vesículas e SALB experiências sobre substratos de dióxido de silício e ouro. Frequência QCM-D (Af, azul) e dissipação (ΔD, vermelho) respostas para o terceiro harmônico (n = 3) foram registrados como função do tempo durante a adsorção de lípidos em (A e C) Dióxido de silício, (B e D) de ouro. Os painéis a e b apresentam o método de fusão das vesículas. DOPC vesículas lipídicas foram injectados em t = 10 min (seta 1). Os painéis c e d correspondem ao método de formação de SALB. As setas indicam a injecção de tampão (1), isopropanol (2), mistura de lípidos [0,5 mg / ml de lípido DOPC em isopropanol; (3)] ​​e lustretroca er (4). A curva a tracejado no painel B corresponde a uma experiência de controlo em que não foi injectada de lípido. Os valores finais de Af e ΔD para cada superfície são especificados. Os esquemas mostram as estruturas lipídicas montados propostas como inferido a partir dos deslocamentos de frequência e de dissipação finais. Adaptado da referência 24 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Influência da taxa de troca de solvente no processo de formação de SALB. QCM-D deslocamentos de frequência (Af) correspondente para o passo final (ver seta 4 na Figura 2C) no método SALB foram medidos em dióxido de silício em duas taxas de câmbio diferentes, 100 e 600 ul / min, u cante (A) 0,5 mg / ml e (B) 0,125 mg / ml de lípido DOPC em isopropanol. Os valores finais Af também são especificadas, em comparação com a linha de base de medição, em solução tampão aquosa. Adaptado da referência 24 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Limiar de Concentração Lipídica para a Formação SALB completa microscopia de epifluorescência de camadas lipídicas em dióxido de silício preparado por SALB usando (a) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; e (C) de 0,25 mg / ml de concentração de lípidos. Adaptado da referência 26 e usadas com permissão da American Chemical Society."target =" _ blank /files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. Influência da concentração de lípido e solvente orgânico na formação de bicamada lipídica suportado pelo método SALB. As alterações finais na QCM-D (A) e de frequência (B) de dissipação de energia para experiências SALB usando vários solventes orgânicos, como uma função de lípido concentração. As linhas tracejadas verdes correspondem às frequências e dissipação de mudanças esperadas para uma bicamada completo (-30 Hz -6). Adaptado da referência 26 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. A fluorescência de recuperação após a fotodegradação análise de bicamadas lipídicas suportados com diferentes fracções de colesterol preparadas pelo método SALB sobre um substrato de vidro. Micrografias (AE) Fluorescência de bicamadas preparados usando várias fracções de colesterol na mistura precursora. As imagens foram gravadas imediatamente (em cima) e 1 minuto (meio) depois de fotobranqueamento. A mancha escura no centro da imagem corresponde à região Foto-descoloração. As barras de escala são 20 uM. Também são apresentados os histogramas de domínios excluídos de corante individuais dentro de cada amostra da área de superfície (em baixo). Adaptado da referência 36 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. Análise de FRAP bicamadas suportados contendo colesterol preparadas pelo método de fusão das vesículas. Micrografias (AD) Fluorescência de bicamadas preparados usando várias fracções de colesterol (10 a 40 mol%), nas vesículas precursoras. As imagens foram gravadas imediatamente (em cima) e 1 minuto (de fundo) após a fotodegradação. A mancha escura no centro da imagem corresponde à região Foto-descoloração. As barras de escala são 20 uM. Adaptado da referência 36 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8. Quantification fracção de colesterol em bicamadas lipídicas suportados. (A) O deslocamento positivo QCM-D frequência após injecção de MβCD 1 mM em bicamadas lipídicas suportados com diferentes fracções molares de colesterol na mistura precursora (entre 0 e 50 mol%). (B) moles por cento de colesterol empobrecido do bicamadas preparados pelo SALB e métodos de fusão de vesículas como uma função da fracção de colesterol nas misturas precursoras ou vesículas. Adaptado da referência 36 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9. Tempo evolução dependente de fluorescência microestrutura em uma bicamada apoiado de DOPC / Chol (4: 6 na razão molar de Containing 0,5% de Rodamina-PE), preparado pelo método de SALB. Uma fase uniforme fase gradualmente separa-se em uma região coexistência líquido-líquido em cima de permuta de solvente completo. Adaptado da referência 37 e usadas com permissão da American Chemical Society. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste trabalho, um protocolo de solvente de permuta é apresentado na qual lípidos em álcool (isopropanol, etanol, ou n-propanol) são incubadas com um suporte sólido e, em seguida, o álcool é gradualmente substituído com uma solução tampão aquosa, a fim de conduzir uma série de transições de fase, eventualmente, produzir-fase lamelar bicamadas lipídicas 24. Mostra-se que o método permite a fabricação de bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies tais como o ouro, que é insolúvel ao método de fusão de vesículas.

Um intervalo de concentração de lípidos optimizada (0,1 - 0,5 mg / ml) foi determinada para a completa formação de bicamada, em formatos padrão experimentais testadas até agora. Com concentrações de lípidos abaixo de 0,1 mg / ml, discretas, manchas microscópicas de bicamadas formado. Por outro lado, a concentrações superiores a 0,1 mg / ml e inferior a 0,5 mg / ml, uma bicamada completa e uniforme. Em concentrações de lipídios acima deste intervalo, uma bicamada fluido ainda foi formada como verified por análise de FRAP, no entanto, a microscopia de fluorescência revela a presença de estruturas de lípidos adicionais no topo da camada dupla. Surpreendentemente, a morfologia destas estruturas de lípidos adicionais, tal como determinado por análise QCM-D, dependia do álcool que foi usado durante o passo de incubação. No caso de etanol, os deslocamentos relativamente elevadas de f e Δ D ô assemelhar-se a assinatura QCM-D obtida por uma camada adsorvida vesícula. Quando o isopropanol ou n-propanol em vez foi usado, o Δ f era ligeiramente mais elevado do que o valor esperado para uma bicamada (f Δ final entre -30 a -40 Hz), enquanto a Δ D foi significativamente superior. Tais respostas QCM-D seria esperado para as estruturas lipidicas prolongados (por exemplo, micelas vermiformes) salientes para fora a partir da superfície da membrana (como visível por microscopia de fluorescência, em alguns casos).

A taxa de troca de solvente é um outro parâmetro importante que pode ser crítico, especially quando as concentrações de lípidos mais baixas (por exemplo, 0,1 mg / ml) são usadas. Rápida troca de solvente a baixa concentração de lípidos pode levar à formação de bicamadas incompletos. Na câmara de medição padrão usada para medições QCM-D neste papel (Q-Sense E4 câmara de medição), as taxas de fluxo de cerca de 100 mL / min, foram adequados para a formação de bicamada completa altamente reprodutível. Para as células de fluxo com outras geometrias e volume, a taxa de fluxo ideal pode variar e deve ser determinada empiricamente com base nos passos aqui sugeridas.

Além de formar bicamadas lipídicas apoiadas em superfícies que são intratáveis ​​a fusão de vesículas, o SALB pode ser utilizado para contornar a necessidade de vesículas lipídicas que podem romper, abrindo assim as portas para a fabricação de membranas suportadas com composições complexas. Como exemplo ilustrativo de uma composição, misturas de lípidos com uma fracção elevada de colesterol foram examinados. O colesterol é um componente importante de mammAliã membranas celulares, e a sua fracção pode aproximar-se de 45-50% em moles de a composição lipídica da membrana (por exemplo, em eritrócitos). Assim, mesmo um modelo simples de uma bicamada lipídica representando uma membrana celular humana deve incluir colesterol.

Embora a fusão da vesícula pode ser utilizado para fabricar bicamadas lipídicas fluídicos contendo apenas 10-15% de colesterol, o método permite a formação de SALB bicamadas lipídicas fluídicos fracções contendo altos de colesterol (até 57% em mol, tal como quantificado por medições QCM-D) 36. No entanto, quando o nível do colesterol foi ainda mais elevada (até 63% em mol), domínios em forma de faixa 37 foram observados. Os domínios de co-existentes eram líquidas, reminiscente do que as observadas na região de β no diagrama de fases da monocamada de fosfolípidos de colesterol / na interface ar-água.

Em geral, o método de SALB é mostrado ser um método simples e eficiente para formar bicamadas lipídicas suportados, especialmente in casos que ultrapassam o âmbito do método de fusão das vesículas convencionais. Até agora, as técnicas de microscopia de fluorescência e QCM-D foram utilizados principalmente para caracterizar as bicamadas lipídicas formadas suportados pelo método SALB. Olhando para a frente, uma ampla gama de técnicas de medições analíticas sensíveis de superfície, incluindo ressonância de plasma de superfície (SPR) 38, microscopia de força atômica (AFM) 39,40, com transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho 41, raio-X 42 e 43 nêutrons refletividade pode, ser utilizado para caracterizar adicionalmente e estudar configurações de bicamada simples e complexos Preparar pelo método SALB. Estas capacidades emergentes abrir a porta a um maior número de cientistas que podem explorar as membranas celulares artificiais, tirando partido de um protocolo experimental simples e robusto.

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), o Conselho Nacional de Pesquisa Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Universidade Tecnológica de Nanyang para NJC

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Substratos revestidos com dióxido de silício QCM-DQSense AB, 
QCM-D substratos revestidos a ouroQSense AB, 
Módulo Q-Sense E4QSense AB, 
, PDC-32GHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-001 (115V) 
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti Polar Lipids850375P
1,2-diooleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) (sal de amônio) (Rh-PE)Avanti Polar Lipids810150P
colesterolAvanti Polar Lipids700000P
Metil-β-ciclodextrinaSigma C4555
IsopropanolSigma 
EtanolSigma 
n-propanolSigma 
Sticky-Slide I 0.1 LuerIBIDI81128
Cotovelo macho 1/8"Cole-Parmer30505-70
Tubulação de Silicone 1.6  mm IDIBIDI10842
Lamínula de vidro nº 1.5H, 25 mm x 75 mmIBIDI10812
Bomba Peristáltica Reglo Digital M2-2/12Ismatec
Dodecil sulfato de sódioSigma Nº 71725
Suécia da Suécia Limpeza de Plasma Suécia673773459844279544

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