Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Resumo

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Resumo

Microscopia intravital é um método que pode ser usado para investigar processos diferentes em regiões diferentes e vasos em animais vivos. Neste protocolo, descrevemos microscopia intravital das veias mesentério. Esta pode ser realizada num curto período de tempo com resultados reprodutíveis mostrando interacções leucócito-endotélio in vivo. Nós descrevemos um ambiente inflamatório após LPS desafio do endotélio. Mas neste modelo pode-se aplicar muitos tipos diferentes de condições inflamatórias, como bactérias, química ou biológica e investigar a administração de drogas e seus efeitos diretos sobre o animal vivo e seu impacto sobre o recrutamento de leucócitos. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de diferentes tratamentos dos ratos e dos seus efeitos sobre a resposta inflamatória nos vasos. Descrevemos a visualização de leucócitos e plaquetas por fluorescência rotulando-os com rodamina 6G. Além disso, qualquer imagem específica pode ser PErformed usando moléculas fluorescente etiquetado alvejados.

Introdução

O objectivo deste protocolo é descrever uma técnica simplificada de microscopia intravital das veias mesentério em ratos vivos para observação direta da interação leucócito-endotélio e leucócitos-plaquetas em condições inflamatórias.

Microscopia intravital foi desenvolvido para estudar as interacções leucócito-endotélio in vivo sob condições inflamatórias ^1,2, o que não é trivial, mas importante para compreender o recrutamento de leucócitos inflamatórios e função. O método que nós descrevemos nesse protocolo foi desenvolvido com base em publicações anteriormente publicados. Semelhante a visualização de incorporação de plaquetas num trombo crescente ³ e em paralelo com o que foi anteriormente publicado ^4, uma veia mesentério exteriorizada é examinada por microscopia de luz transmitida. Existem vários outros modelos de microscopia intra-vital, como o músculo cremaster de ratos ⁵ ou fígado de rato e ratos ^6.

Microscopia intravital da veia mesentério foi desenvolvido e aplicado em estudos anteriores por vários grupos. Temos usado essa técnica para observar diferenças no recrutamento de leucócitos entre camundongos selvagens e hydroxylase1 triptofano (TPH1) - / - ratos, que são deficientes de serotonina não-neuronal e compararam os resultados aos camundongos cujos serotonina de plaquetas foi farmacologicamente esgotados por longo prazo aplicação a um inibidor seletivo da recaptação da serotonina fluoxetina ^7. Examinamos, também, interações leucócito-endotélio após o tratamento com fluoxetina aguda ^8.

Neste protocolo nos concentramos em microscopia intravital das veias mesentério, porque este modelo pode ser realizada rapidamente, e permite medições válidas de interação leucócito-endotélio e plaquetas-leucócitos. Isto é muito mais difícil e em microscopia intravital de outros órgãos, tais como o osso, fígado, pele, músculo cremaster ou demorada. O modo del descrito aqui é ideal para a avaliação reprodutível de interacção célula-célula inflamatória após challengeing-o com um estímulo inflamatório, tal como a injecção intraperitoneal de lipopolissacarídeos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com a lei de proteção animal Alemão (TierSchG). Os ratos foram alojados e tratados de acordo com as boas práticas animal, definidos no FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) eo corpo bem-estar animal nacional GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). O animal comitê de bem-estar, da Universidade de Freiburg, bem como as autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg) aprovou todas as experiências com animais.

1. Handling Animal, Preparação e indução da inflamação

1. Use 4-6 semanas de idade ratos macho com uma faixa de peso de 16-20 g. Nota: Se eles os ratinhos mais velhos são mais pesados ​​ou apresentam excesso de gordura que envolve o recipiente, o que limita a observação microscópica.
2. Esterilizar todas as ferramentas e mesa microscópio antes da cirurgia.
3. Injectar 20 mg / kg de LPS (lipopolissacárido) intraperitonealmente quatro horas antes da microscopia no rato vivo para induzir uma Inflamm bacterianação.
4. Pré-aquecer uma solução salina a 0,9% num banho-maria a 37 ° C para humidificar a câmara de plástico e o tecido mesentério.
5. Anestesiar o rato com injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) imediatamente antes do procedimento de microscopia. Anestesia alternativos podem ser utilizados, por exemplo, 2% a inalação de isoflurano. Confirme anestesia adequada pela perda de resposta à estimulação reflexa (dedo do pé ou cauda pitada com pressão firme).
6. Depilar o abdome utilizando uma máquina de barbear e remover cabelo solto com gaze saturada com etanol 70%.
7. Aplicar veterinário pomada sobre os olhos do mouse para evitar a secura, sob anestesia.

2. Cirurgia

1. Esterilizar os abdome utilizando etanol a 70%. Este método não é um método de estéril e pode ser letal no final da experiência.
2. Executar uma laparotomia mediana: Abra a pele abdominal usando uma pinça pequenos, curvos e uma tesoura pequena. Identificar o epivasos gastrical e abrir o peritoneu na região da linea alba, para proteger os vasos.
3. Aplicar algumas gotas de solução salina pré-aquecido para dentro da cavidade abdominal para manter o tecido húmido.
4. Etiqueta de leucócitos e plaquetas fluorescência por injecção de 50 ul de rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitalmente, tal como descrito antes ^9,10.
5. Exteriorizar um laço de lugar ileumand-lo em uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm e certifique-se de manter o tecido úmido, aplicando a 37 ° C pré-aquecido solução salina (0,9%) a cada dois minutos.

3. Microscopia intravital

1. Colocar o rato sob o microscópio e trazer a veia mesentério com um diâmetro de 200-300 uM no centro de visão. Escolha uma embarcação sem arredores gordura visível.
2. Não toque nos vasos mesentério evitando assim a estimulação do endotélio. Pega o loop íleo cautela.
3. Visualize interações celulares do endotélio sanguecom um microscópio invertido ou vertical e uma câmera usando um software de microscópio. Grave sangue interações celulares do endotélio para 1 min em 4 veias diferentes por mouse.
4. Eutanásia o rato por luxação cervical após a conclusão de experiências de imagiologia.

4. Análise

1. Realizar a análise off-line e cego para todos os parâmetros. Realizar análise usando qualquer programa de software adequado.
2. Confirme condições estáveis ​​e interindividually comparáveis ​​fluxo sanguíneo em alta resolução tempo cine-clips (taxa de quadros máxima) com foco no fluxo de glóbulos intraluminal.
3. Quantificar o número de leucócitos de rolamento. Therefor desenhar uma linha vertical através da veia e contar todos os leucócitos atravessam esta linha em 1 min.
4. Determinar a velocidade de rolamento através da medição do tempo de um único leucócitos tem de passar por uma distância de 50 mm, enquanto estavelmente rolando sobre o endotélio. Para fazer isso, desenhe duas linhas verticais em uma distância de 50 mm ttravés da veia.
   1. Medir o tempo de um representante de leucócitos deve começar a partir de uma linha para a other.Calculate a velocidade dos leucócitos dividindo-se 50 mm através do tempo necessário (mm / s).
5. Medir a adesão de leucócitos em um campo de 0,04 ^mm2. Para fazer isso, desenhar um quadrado com o comprimento de 200 um lado para dentro da veia.
   1. Conte os leucócitos aderentes firmes, definidos como nenhum movimento visível durante 30 segundos, dentro deste quadrado.
6. Contar o número de plaquetas ligadas a um dos leucócitos para quantificar interacções plaquetas-leucócitos.

Resultados

Uma visão geral da configuração experimental descrito neste protocolo é demonstrado na Figura 1. Ela mostra um rato com um íleo-ciclo exteriorizado e seus navios, o que pode ser observado em microscopia intravital. A Figura 2 mostra certo grau de activação em animais não tratados devido a o procedimento em si. Mas não há quase nenhum rolamento lenta ou adesão firme dos leucócitos em comparação com os ratinhos tratados com LPS. A Figura 2 também mostra os diferentes resu...

Discussão

Aqui, descrevemos a preparação e realização de microscopia intravital das veias mesentério de ratos in vivo. Este método nos dá a oportunidade de observar as interações leucócito-endotélio e plaquetas-endotélio ¹¹ diretamente no organismo vivo.

Como uma resposta rápida a inflamação do endotélio é ativado e interage com leucócitos e plaquetas, resultando em rolamento, adesão e transmigração ^12. Mas também os leucócitos interagem com plaquetas formando os chamado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
Lipopolissacarídeos de Escherichia coli 055:B5	Sigma-Aldrich	L2637