Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Resumo

A criação de microtecidos funcionais dentro de dispositivos microfluídicos requer a estabilização dos fenótipos celulares, adaptando as técnicas tradicionais de cultura celular às dimensões espaciais limitadas em microdispositivos. A modificação do colágeno permite a deposição camada por camada de conjuntos de colágeno ultrafinos que podem estabilizar células primárias, como hepatócitos, como modelos de tecido microfluídico.

Resumo

Embora a microfluídica forneça um controle requintado do microambiente celular, a cultura de células em dispositivos microfluídicos pode ser challenging. 3D cultura de células em géis de colágeno tipo I ajuda a estabilizar a morfologia e a função celular, o que é necessário para a criação de modelos de tecido microfluídico em microdispositivos. Traduzir técnicas tradicionais de cultura 3D para placas de cultura de tecidos para dispositivos microfluídicos é muitas vezes difícil devido às dimensões limitadas do canal. Neste método, descrevemos uma técnica para modificar o colágeno tipo I nativo para gerar soluções de colágeno policatiônico e polianiônico que podem ser usadas com deposição camada por camada para criar conjuntos de colágeno ultrafinos em cima de células cultivadas em dispositivos microfluídicos. Essas finas camadas de colágeno estabilizam a morfologia e a função celular, como mostrado usando hepatócitos primários como célula de exemplo, permitindo a cultura de microtecidos a longo prazo em dispositivos microfluídicos.

Introdução

Embora a microfluídica permita o controle requintado do microambiente celular, a cultura de células, especialmente células primárias, dentro de dispositivos microfluídicos pode ser um desafio. Muitas técnicas tradicionais de cultura de células foram desenvolvidas para sustentar e estabilizar a função celular quando cultivadas em placas de cultura de tecidos, mas traduzir essas técnicas para dispositivos microfluídicos é muitas vezes difícil.

Uma dessas técnicas é a cultura de células em géis de colágeno ou entre eles como um modelo do ambiente fisiológico das células 3D. ¹ O colágeno tipo I é uma das proteínas mais usadas para a....

Protocolo

1. Preparação da solução de colagénio nativo solúvel

1. Prepare comprar ou 200 mg de acidificada, solúvel, de colagénio tipo I da cauda de ratos a 1-3 mg / ^{15 ml,} utilizando protocolos de isolamento convencionais, tais como relatado por Piez et ai.
2. Escala a quantidade de material de partida com base no volume final desejado de soluções de colagénio modificados. Aproximadamente 25-30 ml de fazer metilado e 25-30 ml de soluções de colagénio succiniladas, cada um em 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colagénio nativo solúvel.

2. O colágeno metilação

1. Dilui-se 100 mg da solução nativa, acidi....

Resultados

Colagénio nativo pode ser modificado usando metilação e succinylation para criar soluções de colagénio policatiónicos e polianiónicos para uso na deposição de camada por camada. Succinylation modifica os grupos e-amino de colagénio nativo com grupos succinilo, metilação e modifica os grupos carboxilo de colagénio nativo com um grupo metilo (Figura 1A). Estas modificações às cadeias laterais de aminoácidos da proteína de colagénio alterar as curvas de titulação para pH das soluções. Succinylation reduz o.......

Discussão

Ultrafinos assembleias de colágeno puro pode ser depositado em células carregadas ou superfícies de material usando deposição de camada por camada de colágenos modificados. Os resultados deste estudo demonstram que a metilação e succinylation de colagénio nativo criar soluções policatiónicos e polianiónicos de colagénio (Figura 1) que pode ser utilizado com a técnica de camada-a-camada para depositar conjuntos de matriz de colagénio ultrafinos em células (Figura 2) ou outro carregadas s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
colágeno tipo I, cauda de rato	Life Technologies	A1048301	opção para colágeno concentrado de cauda de rato
tipo I, cauda de rato	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	opção para colágeno concentrado de cauda de rato
tipo I, cauda de rato	EMD Millipore	08-115	opção para colágeno concentrado de cauda de rato
tipo I, cauda de rato	R%D Systems	3440-100-01	de colágeno concentrado de cauda de rato
	Sigma-Aldrich	239690-50G	reagente de succinilação
metanol anidro	Sigma-Aldrich	322415-100ML	reagente de metilação
hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S5881-500G	reagente de precipitação de pH
ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	320331-500ML	Tipo
I ELISA	Chondrex	6013	para detectar o índice do colagênio
jogo do ensaio da hidroxiprolina	Opção de Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	para detectar o índice do colagênio
jogo do ensaio da hidroxiprolina	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	opção para detectar o índice do colagênio

opção para anidrido succínico do colagênio do reagente da precipitação do pH