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Artigo de método

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

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DOI:

10.3791/53079

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19 de agosto de 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Neste artigo

Resumo

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Resumo

Vários andaimes usados na engenharia de tecidos requerem um ambiente bioquímico controlado para imitar o nicho fisiológico da célula. As fibras de complexação polieletrolítica interfacial (IPC) podem ser usadas para entrega controlada de vários agentes biológicos, como medicamentos de moléculas pequenas, células, proteínas e fatores de crescimento. A simplicidade da metodologia na fabricação de fibras IPC dá flexibilidade em sua aplicação para entrega controlada de biomoléculas. Aqui, descrevemos um método de incorporação de fibras IPC em dois andaimes poliméricos diferentes, polissacarídeo hidrofílico e policaprolactona hidrofóbica, para criar um andaime composto multicomponente. Mostramos que as fibras de IPC podem ser facilmente incorporadas a essas estruturas poliméricas, aumentando a capacidade de liberação sustentada e melhor preservação de biomoléculas. Também criamos um andaime polimérico composto com pistas topográficas e liberação bioquímica sustentada que pode ter efeitos sinérgicos no comportamento celular. Scaffolds poliméricos compostos com fibras IPC representam um método novo e simples de recriar o nicho celular.

Introdução

A matriz extracelular tem pistas bioquímicas e biofísicas inerentes que direcionam o comportamento celular. Imitar esse microambiente fisiológico tridimensional (3D) é uma estratégia amplamente explorada para aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Por exemplo, substratos de origem natural e sintéticos foram modificados com pistas topográficas como um meio de imitar o ambiente celular biofísico. 1 Por exemplo, andaimes de policaprolactona (PCL) podem ser facilmente padronizados por fundição em substratos PDMS padronizados. 2 No entanto, a maioria dos andaimes sintéticos recapitula inadequadamente o ambiente bioquímico controlado in vivo. A modificação em massa ou na superfície de materiais sintéticos apresenta apenas pistas bioquímicas para a fixação celular, mas ainda carece de regulação temporal da entrega bioquímica. 3 Assim, há necessidade de andaimes ideais que possam imitar o sistema de entrega bioquímica regulado temporalmente da matriz extracelular.

Os sistemas de entrega bioquímica, como as microesferas, são atormentados por problemas de perda de bioatividade e baixa eficiência de incorporação devido à gravidade e complexidade do processo de síntese em várias etapas. 4-6 Métodos alternativos que usam um método de fabricação e incorporação em uma etapa provaram ter excelente potencial para criar um microambiente bioquímico favorável sem a ineficiência na incorporação e perda de bioatividade. Uma solução viável é o uso de fibras de complexação polieletrolítica interfacial (IPC) para fornecer e proteger agentes biológicos. Quando duas soluções aquosas de polieletrólitos de carga oposta são reunidas, as fibras IPC podem ser retiradas da interface. Praticamente qualquer tipo de biomolécula hidrofílica em solução aquosa pode ser adicionada à solução de polieletrólito carregada negativa ou positivamente, facilitando assim a incorporação de biomoléculas úteis na fibra IPC durante o processo de complexação. Além disso, este processo requer apenas condições aquosas e ambientais, diminuindo assim o risco de perda de bioatividade. Usando este método, fatores de crescimento ativos2,7 até células8,9 foram entregues com sucesso. Além disso, o método simples de formação de fibras IPC permite a moldagem em qualquer forma ou orientação. A estabilidade de tais fibras tem sido vantajosa em sua incorporação em polímeros hidrofóbicos2 e hidrofílicos7 para criar scaffolds compostos. Esses andaimes compostos com fibras IPC são benéficos para criar um ambiente bioquímico fisiologicamente relevante, ao mesmo tempo em que fornecem ancoragem física para as células.

Neste estudo, mostramos um método para incorporar fibras IPC em um scaffold hidrofílico e hidrofóbico com topografia para liberação controlada de biomoléculas ativas. Como prova de conceito, incorporamos fibras IPC feitas de quitosana e alginato no hidrogel hidrofílico pululano-dextrano biocompatível, não imunogênico e não antigênico ou no andaime hidrofóbico de policaprolactona biocompatível.

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Protocolo

1. Preparação de Soluções de polielectrólito

  1. Purifica-se o quitosano, conforme detalhado na Liao et ai. Resumidamente, criar uma solução a 1% de quitosano em 2% (w / v) (v / v) de ácido acético e de vácuo filtro usando papel de filtro de grau 93. Neutraliza-se o filtrado utilizando NaOH 5M até que o pH estabilizou a 7. Centrifugar o quitosano precipitado a 1.200 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante e adicionar água desionizada para lavar o quitosano. Repetir o passo de lavagem e centrifugação mais duas vezes. Congelar a quitosana precipitado a -80 ° C e liofilizar O / N para se obter a forma purificada. Armazenar quitosana purificada num armário desumidificado.
  2. Pesar 1 g de quitosana purificada em um estéril de cultura de tecidos prato. Coloque a quitosana no prato de cultura de tecidos tão perto quanto possível a luz UV na câmara de segurança biológica e expor à luz UV durante 15 min. Utilizando uma pinça estéril, colocar a quitosana esterilizado em um recipiente de vidro. Dissolver quitosana usando filtrada 0.15M de ácido acético até uma concentração final entre 0,5% e 1% (w / v).
  3. Pesar 0,1 g de sal de sódio do ácido algínico e dissolver em 10 mL de água desionizada (DDI) de água destilada para se obter um 1% (w / v) de solução. Misturar o sal de sódio do ácido algínico, durante pelo menos 2 horas no misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Filtra-se a solução de alginato através de filtro de seringa de 0,2 um. Guardar a solução de alginato a 4 ° C.
  4. Reconstituir factores de crescimento recombinantes humanas tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou beta - fator de crescimento neural (NGF), como recomendado pelo fabricante.

2. Desenho de Fibras IPC

  1. Misturar proteínas, factores de crescimento ou outras biomoléculas em 10-20 ul alíquota da solução de polielectrólito que tem uma carga global semelhante. Moléculas biológicas com carga negativa (por exemplo, soro albumina bovina [BSA]) líquido deve ser misturado com solução de alginato. As moléculas biológicas com carga positiva (por exemplo, VEGF) deve ser misturado comsolução de quitosano.
  2. Coloque pequenas aliquotas (10-20 ul) de quitosana e alginato sobre uma superfície plana e estável que é coberta com parafilme. As gotas de alginato de chitosano e deve ser colocado em estreita proximidade, mas não estão em contacto uns com os outros.
  3. Levemente mergulhe cada ponta em um par de fórceps nas gotículas de quitosana e alginato. Traga as gotas de polieletrólitos em conjunto por beliscar a pinça. Quando as gotículas entram em contacto uns com os outros, lentamente puxar a pinça na vertical para cima, para chamar a fibra IPC a partir da interface das duas gotas (Figura 1A).
  4. Com cuidado, coloque a extremidade da fibra desenhada IPC sobre a pinça sobre um coletor, como um andaime polimérico plano aposta em um mandril rotativo (consulte a secção 3 e 4). Rodar o mandril a uma velocidade constante de 10 mm / s para permitir a formação de fibras uniforme e beadless IPC. Aumentando a velocidade de desenho das fibras IPC irá formar grânulos, que irá causar uma libertação brusca de incorporadaterminação de fibra bioquímica e prematura. 10
  5. Para determinar a eficiência de incorporação, recolher todos os líquidos remanescentes deixado no parafilme por diluição com 500 mL de 1X tampão fosfato salino (PBS). Medir o teor de proteína com factor de crescimento ou no resíduo através de ensaio BCA (para BSA), ELISA (para o VEGF e o NGF) ou um ensaio adequado para detectar biomolécula incorporada.

3. Fabricação de Composite Hidrogel Andaime de pululano-dextrano (PD) polissacarídeo e Fibras IPC

  1. Fabricando quadro pululano sacrificial para a coleta de fibra IPC
    1. Pesar pululano polissacárido e misturar com água desionizada destilada (DDI) de água para criar uma 20% (w / v) de solução aquosa. Misturar a solução de pululano O / N para assegurar a homogeneidade.
    2. De molde 15 g de uma solução de pululano em de 10 cm de diâmetro de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS) prato. Seca-se a solução de pululano O / N a 37 ° C. Corte os filmes de pululano em 7mm x 7 milímetros quadros quadrados.
  2. Preparar solução de polissacárido pululano-dextrano
    1. Criar uma solução a 30% dos polissacáridos de pululano e dextrano (w / v) (3: 1) em água DDI. Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução de polissacárido. Adiciona-se lentamente em bicarbonato de sódio à solução de polissacárido para atingir uma concentração final de 20% (w / v). Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução. Guardar a solução de polissacárido, a 4 ° C.
  3. Coletando fibras IPC no quadro pululano
    1. Apor a moldura pululano sacrificial (ponto 3.1) usando um jacaré. Furar o jacaré e estrutura pululano no final do mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Rodar o mandril com o quadro afixada a uma velocidade constante de 10 mm / seg. O quadro de pululano pode ser afixada sobre o mandril em rotação em orientações desejadas.
  4. Desenhe as fibras IPC usando um par de fórceps (seção 1) e attach, a fim de as fibras desenhada IPC sobre a armação rotativa pululano. Desenhe as fibras IPC a uma velocidade constante. Ao alcançar a extremidade terminal da fibra IPC, secar o construto fibras ó-em-quadro / N à temperatura ambiente.
  5. Incorporação fibras IPC em PD hidrogel andaime
  6. Para reticular cada grama de solução de pululano-dextrano, adicionar 100 ul de 11% (w / v), trimetafosfato de sódio e solução aquosa de hidróxido de sódio 10M 100 ul. 7 Misture a solução a 60 rpm usando um stirplate para 1 a 2 min. Após a adição de trimetafosfato de sódio e hidróxido de sódio, a solução de polissacárido vai reticular quase imediatamente. Despeje a solução de polissacarídeo viscoso para a construção de fibras-on-frame para incorporar totalmente as fibras do IPC. Incubar as fibras de pululano-dextrano combinado IPC (IPC-PD), a 60 ° C durante 30 minutos para formar um andaimes compostos quimicamente reticulados (Figura 1B).
  7. CUIDADO: Execute o passo 3.3.2 no exaustor e utilizar equi proteção adequadovolvimento como o ácido acético é um corrosivo e inflamável.
  8. Para induzir a formação de poros no andaime PD-CIP, submergir todo o andaime em 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min.
  9. Remover os reagentes que não reagiram por lavagem andaimes PD-CIP em 1X PBS durante 5 min, agitando a 100 rpm. Repita esta etapa duas vezes.
  10. Retire o excesso de PBS e congelar imediatamente os andaimes PD-IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar os andaimes, pelo menos, 24 horas antes da utilização em quaisquer ensaios de libertação ou de bioatividade controladas.

4. Fabricação de Composite Andaime de PCL e Fibras IPC

CUIDADO: Diclorometano é um material perigoso. Use a coifa e equipamentos de proteção individual ao manusear diclorometano.

  1. Criação de substratos PDMS puras e padronizadas
    1. Criar um polidimetilsiloxano intocada (PDMS) substrato elastomérico usando um pedaço de TCPS de dimensão desejada usando o processo de litografia macia. Criar pattePDMS rned substratos, usando métodos padrão suaves litográficas de poli (metacrilato de metilo) moldes com a topografia desejada. 12
  2. Confecção de sacrifício PCL quadro para a recolha de fibra IPC
    1. Pesar PCL e dissolver em diclorometano, para se criar um 0,9% (w / v) de solução. Para cada 1 cm2 de área do substrato PDMS, gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte. Repetir o processo de fundição 0,9% de PCL para engrossar a película com a espessura desejada. Remover a película de PCL seca a partir do substrato de PDMS. Criar um buraco no PCL quadro usando um perfurador de dimensões adequadas. 2
  3. Coletando fibras IPC na armação PCL
    1. Apor a moldura PCL sacrificial com furo (de 4.2.1) em um jacaré. Furar o jacaré para o mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Fixe a extremidade da fibra desenhada IPC para o fram PCLe antes de iniciar a rotação a uma velocidade constante de 10 mm / sec (seção 2). Após o final do estiramento de fibra IPC, secar a fibra-a-quadro constructo O / N a 4 ° C.
  4. Incorporação de fibra-on-frame construção em substrato PCL modelado
    1. Gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL sobre o substrato PDMS para criar uma base de PCL ou modelado como novo, como necessário. Fundido múltiplas camadas de uma solução de PCL 0,9% para se obter um andaime com a espessura desejada. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte.
    2. Coloque a construção de fibra-a-quadro (secção 4.3.1) na parte superior da base de PCL. Adicionar solução de 0,9% de PCL sobre os vários tempos de fibra-a-quadro construir para obter a espessura desejada e incorporar totalmente as fibras IPC, fabricando um andaime composta IPC-PCL (Figura 1C).

5. Medição da disseminação de agentes biológicos a partir Composite IPC Andaimes

  1. Coloque compósito PD-IPC ouAndaimes PCL-IPC e stand-alone fibras IPC separadamente em uma placa de 24 poços.
  2. Mergulhe o andaime e stand-alone fibras IPC com 500 mL de 1X PBS. Incubar as amostras a 37 ° C. Recolhe PBS a vários pontos de tempo (libertação media) e substituir com 500 ul de PBS 1X.
  3. Medir a quantidade de proteína ou de factor de crescimento nos meios de libertação utilizando um ensaio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) ou outro teste adequado para calcular o perfil de libertação cumulativa para a biomolécula incorporada.

6. Sementeira de Células no Composite IPC Andaimes para testar Bioatividade de Agentes Biológicos Lançado

  1. Esterilizar os scaffolds compostos PD-IPC ou PCL-IPC liofilizados utilizando luz UV na cabine de segurança biológica por pelo menos 20 min.
  2. Utilizar técnicas padrão de cultura de células para se obter uma suspensão de células de 2 x 10 5 células em 200 ul de meio de crescimento. Semente da suspensão de células concentradas sobre os scaffolds compostos. After 20 min, top-up o volume de meio de crescimento para submergir completamente os andaimes.
  3. Medir a atividade das células através de técnicas convencionais, tais como ensaio de actividade Alamar azul metabólica, ensaio excrescência de neurites PC12 ou imunofluorescência.

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Resultados

Neste artigo, buscou-se criar scaffolds compósitos com fibras de IPC para a libertação controlada de várias biomoléculas. Características das biomoléculas utilizadas neste estudo encontram-se na Tabela 1. Fibras de IPC foram incorporados primeiramente em um hidrogel hidrofílico PD para criar um andaime composta PD-CIP (Figura 1B). Molécula modelo BSA foi testado pela primeira vez para determinar a viabilidade da utilização de um andaime composto para liberação controlada de biomoléculas...

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Discussão

IPC fibras são formados pela interacção de dois polielectrólitos de cargas opostas. O processo utiliza a extracção do complexo a partir da interface de os polielectrólitos, facilitar um processo de auto-montagem para a formação da fibra estável. O mecanismo de formação da fibra IPC assegura que qualquer biomolécula adicionados a um polielectrólito de forma semelhante carregada pode ser incorporado durante o processo de complexação. 10,11 Inversamente, a adição de uma biomolécula para o polielectrólito de carg...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura administrado por um dos seus centros de investigação de excelência, o Instituto mechanobiology, Cingapura. MFAC é apoiada pela Agência da Ciência, Tecnologia e Pesquisa (Singapura) e Agência Nacional de Investigação (França) programa conjunto com o número 1122703037. BKKT projeto é apoiado pelo Instituto mechanobiology. Agradecemos ao Sr. Daniel HC Wong para o manuscrito e Ms. Amanhecer JH Neo para auxiliar na produção de vídeo de leitura de prova.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pululano Hayashibara Inc Okayama JapãoPeso molecular (MW) 200 kDa. Este material é pullulan de grau farmacêutico usado para fazer armações de pullulan e andaimes PD-IPC.
DextranSigma AldrichD1037MW 500 kDa. Este material não está mais sendo produzido pela Sigma Aldrich. A alternativa sugerida é o número de catálogo 31392 (Sigma Aldrich). Este material é usado para fazer andaimes PD-IPC.
Bicarbonato de Sódio Sigma AldrichS5761O bicarbonato de sódio deve ser adicionado lentamente à solução de polissacarídeo pululano-dextrano. A adição rápida de bicarbonato de sódio resultará em precipitação. 
Trimetafosfato de sódioSigma AldrichT5508Este produto químico é higroscópico e deve ser armazenado no gabinete de desumidificação. A solução aquosa de trimetafosfato de sódio deve ser sempre fresca.
Hidróxido de sódioSigma AldrichS5881Este material é perigoso e deve ser manuseado com equipamento de proteção adequado, como luvas de nitrilo.
QuitosanaSigma Aldrich448877MW 190-310 kDa. Grau de acetilação de 75% a 85%. A purificação da quitosana é necessária para criar fibras IPC estáveis.
Ácido acéticoMerckIsso pode ser substituído por outro tipo de marca. Este material é corrosivo e inflamável. Equipamentos de proteção como protetor facial, luvas de nitrilo, jaleco e capa de sapato devem ser usados ao manusear este produto químico na capela de exaustão.
Sal de sódio de ácido algínico de algas marrons, baixa viscosidadeSigma AldrichA2158Dissolver em água durante a noite. Filtre através de estéril 0.2  µ m antes de usar. Armazene a 4 ° C.
Sinopharmalbuminadissolve em PBS estéril e no filtro usando 0,2 µ m antes de usar. 
Kit de ensaio BCAPierce23225Este kit foi usado para medir a liberação de BSA de andaimes PD-IPC. 
Fator de crescimento endotelial vascular recombinante humanoR& D systems293-VEDissolver o fator de crescimento em solução de heparina a 0,2% até uma concentração final de 5  mg/ml.
Sal de heparina sódica deSigma AldrichH3393Isso pode ser substituído por outro tipo de marca. Dissolva o sal de heparina em água estéril na concentração final de 1% e filtre através de 0,2 µ m antes de usar. 
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)LonzaC2517AEste tipo de célula primária foi usado no ensaio para determinar a bioatividade do VEGF após a liberação dos scaffolds PD-IPC. 
Alamar blueLife TechnologiesDAL1025Isso é usado para medir a atividade metabólica celular. Incube o azul de Alamar com células e mantenha em condições padrão de cultura de células por 2 a 4 horas. Meça a absorbância a 570 nm para determinar a redução percentual do azul de Alamar, que está correlacionada com a atividade celular.
ScanVac Coolsafe LiofilizadorLabogene7.001.200.060Este é um liofilizador não programável que opera de -105 a -110  °C. Isso pode ser substituído por outros liofilizadores de laboratório padrão.
Policaprolactona (PCL)Sigma Aldrich181609MW 65 kDa. Isso não está mais sendo fabricado pela Sigma Aldrich. Isso pode ser substituído pelo número de catálogo Sigma Aldrich 704105.
DiclorometanoSigma AldrichV800151Isso pode ser substituído por outro tipo de marca. Este material é perigoso e deve ser manuseado na hotte. Equipamento de proteção deve ser usado o tempo todo ao manusear este produto químico.
Polidimetilsiloxano (PDMS; 184 Kit de Elastômero de Silicone)Dow Corning(240)4019862O kit de elastômero vem com base de polímero e reticulador. Misturar a base de polímero e o reticulador em diferentes proporções resultará em diferentes rigidezes do PDMS.
Fator de crescimento do nervo beta recombinante humano (NGF)R& D systems256-GFReconstituído em água DI estéril até uma concentração final de 100  µ g⁠/⁠ml. Alíquota e armazenar em -20 ° C até o uso.
Células-tronco mesenquimais humanas (hMSC)CambrexEste tipo de célula foi usado no ensaio para determinar o efeito sinérgico do NGF e da nanotopografia.
Células de Feocromocitoma PC12 de RatoATCCEste tipo de célula foi usado no ensaio de crescimento de neuritos para determinar a bioatividade do NGF. Após a exposição ao meio de liberação com NGF, meça o número de células com extensões de neurite e normalize para o número total de células.
Papel de filtro de grau 93WhatmanZ699675É usado para a purificação de quitosana após sua precipitação com hidróxido de sódio em pH 7.
Centrífuga de caçamba oscilanteEppendorf5810RPara ser usada durante a purificação da quitosana usando a velocidade de 1.200 x g.
Motor com mandril girando a velocidade constanteRhymebusRM5EO motor é utilizado para a fabricação de fibras IPC em pullulan ou estrutura PCL.
Solução salina tamponada com fosfatoFirstBaseEsterilizar através de filtração (0,2 µ m) e autoclave. 
Placa de Poliestireno para Cultura de Tecidos de 10 mm de diâmetro (TCPS)GreinerA placa TCPS é usada para fundição de estrutura de pululan. 
Kit ELISA VEGF humanoR& Sistemas DDVE00O kit ELISA é utilizado para a detecção de VEGF no meio de libertação.
Kit ELISA NGF humanoR& D sistemasDY256O kit ELISA é usado para detecção de NGF no meio de liberação.
Fita adesiva revestida de plásticoBel-Art9040336A fita adesiva é usada para colar com segurança o clipe jacaré no mandril rotativo
O reagente químico bovino de da do soro suínos

Referências

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