Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative In Vitro Modelo Experimental

Resumo

Neste trabalho, um novo modelo experimental no qual culturas neuronais 3D são acopladas a matrizes planares de microeletrodos (MEAs) é presented. 3D redes são construídas semeando neurônios em um andaime composto de microesferas de vidro nas quais os neurônios crescem e formam estruturas 3D interconectadas.

Resumo

Atualmente, redes de grande escala derivadas de neurônios dissociados crescendo e se desenvolvendo in vitro em dispositivos microtransdutores extracelulares são o modelo experimental padrão-ouro para estudar mecanismos neurofisiológicos básicos envolvidos na formação e manutenção de conjuntos de células neuronais. No entanto, os estudos in vitro têm se limitado ao registro da atividade eletrofisiológica gerada por redes neurais bidimensionais (2D). No entanto, dada a intrincada relação entre estrutura e dinâmica, uma melhoria significativa é necessária para investigar a formação e a dinâmica de desenvolvimento de redes tridimensionais (3D). Neste trabalho, é apresentada uma nova plataforma experimental na qual redes hipocampais ou corticais 3D são acopladas a Micro-Electrode Arrays (MEAs) planares. As redes 3D são realizadas semeando neurônios em um andaime constituído de microesferas de vidro (30-40 μm de diâmetro) nas quais os neurônios são capazes de crescer e formar conjuntos 3D complexos interconectados. Desta forma, é possível projetar redes 3D projetadas compostas por 5-8 camadas com uma densidade celular final esperada. A crescente complexidade na organização morfológica da montagem 3D induz um aumento dos padrões eletrofisiológicos exibidos por este tipo de redes. Em comparação com as redes 2D padrão, onde surge uma atividade de bursting altamente estereotipada, a estrutura 3D altera a atividade de bursting em termos de duração e frequência, além de permitir a observação de atividades de pico mais aleatórias. Nesse sentido, o modelo 3D desenvolvido se assemelha mais às redes neurais in vivo.

Introdução

Em bidimensionais redes neurais (2D) vitro acoplados a Micro-Arrays eletrodo (AMA) arethe modelo experimental padrão-ouro adotada para estudar a interação entre a dinâmica neuronal e a conectividade subjacente. Durante o desenvolvimento, os neurônios recriar redes complexas que mostrar bem actividade definedspatio-temporalpatternsof ^1,2 (ou seja, explosões, rajadas de rede, atividade spiking aleatório). AAM registrar a atividade eletrofisiológica de muitos sites (de dezenas a milhares de microeletrodos), permitindo uma investigação detalhada da dinâmica expressos no nível da rede. Além disso, a utilização de culturas dissociadas faz possibile para conceber-redes modificadas. É mais fácil de entender, desta forma as relações funcionais entre a atividade eletrofisiológica registradas e os parâmetros da organização em rede como densidade de células ^3, grau de modularidade ^4,5, presença de pop neuronal heterogêneoulations ^{6, etc.} No entanto, todos os estudos in vitro em células cultivadas dissociados são baseados em redes neuronais 2D. Esta abordagem conduz a simplificações em relação à (, intrinsecamente 3-dimensional 3D) Sistema in vivo: (I) num modelo em 2D, somata e cones de crescimento se encontram achatados e a excrescência axónios-dendrites não pode propagar em todas as direcções ^7. (ii) 2D in vitro redes exposição estereotipada dinâmica eletrofisiológicos dominadas por atividade envolvendo a maior parte dos neurônios da rede ⁸ estourando.

Recentemente, soluções diferentes têm sido desenvolvidos para permitir que a construção in vitro de 3D ​​redes neuronais dissociadas. A idéia comum consiste na criação de um andaime onde os neurônios pode crescer de uma forma 3D. Um tal andaime pode ser realizada com géis de polímeros e matrizes sólidas porosas ^9-13. Ao explorar as propriedades mecânicas dos polímeros, é possível incorporar no interior das células Tse estruturas através da definição de um bloco uniforme de culturas 3D de neurospheres ^11. A principal característica dessa abordagem é a propriedade mecânica rígida das neuroesferas ^9,12. No entanto, estes materiais têm porosidade limitada, e eles não garantem a migração de células no interior da matriz. Para superar esta desvantagem, uma possível solução consiste em cortar a matriz em módulos «unidade». Infelizmente, o tamanho e forma das partículas de diversidade pode dificultar a embalagem em estruturas em camadas regulares. Em ^{7 de} Cullen e colaboradores projetou uma construção neuronal 3D feito de neurônios e / ou astrócitos dentro de um extracelular andaime bioativo à base de matriz. Um tecido neural, tais engenharia permitida em investigações in vitro para estudar e manipular as respostas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistiu em neurónios e glia distribuídas por toda a matriz extracelular (ECM) e / ou andaimes de hidrogel (500-600 mm de espessura). Neste condition, uma viabilidade celular óptima (maior do que 90%) foi encontrado por plaqueamento de células, a uma densidade de cerca de 3,750 definitiva - 5000 células / ^mm3. Deve-se notar que um tal valor de densidade é muito menor do que a da condição in vivo, onde a densidade das células do córtex cerebral do rato é de cerca de 90.000 células / mm ^{3 14.} Para superar esta limitação Pautot e colaboradores ¹⁵ realizado um sistema 3D in vitro em que a densidade celular e a conectividade de rede são controladas para se assemelhar a condições in vivo, permitindo simultaneamente imagens em tempo real da rede. Na prática, este método baseia-se no conceito de que os neurónios dissociados em cultura são capazes de crescer em microesferas de sílica. Estas contas fornecem uma superfície de crescimento grande o suficiente para os corpos celulares neuronais para aderir e para as suas arborizações para crescer, amadurecer, se estendem, e definem contatos sinápticos para outros neurônios. Este método explora as propriedades espontâneas de montagem de contas monodispersas para form 3D em camadas matrizes hexagonais contendo subconjuntos distintos de neurônios em diferentes camadas com conectividade restrita entre os neurônios em diferentes esferas. A densidade celular obtida com este método foi de cerca de 75.000 células / ^mm3.

Recentemente, nós adaptamos o método de Pautot aos MEA ^16: os resultados obtidos mostram que a atividade eletrofisiológica 3D apresenta um repertório mais vasto de actividades do que aquela expressa por redes 2D. Culturas maduras 3D exibem uma dinâmica reforçada em que ambos estouro de rede e aleatória coexistem pico de atividade. Da mesma forma, Tang-Schomer e colaboradores ¹⁷ realizado um andaime poroso à base de proteína de seda que mantém uma cultura primária cortical in vitro para alguns meses, e registada a actividade electrofisiológica por meio de um eléctrodo de tungsténio.

Neste trabalho, os procedimentos experimentais para construir redes neuronais 3D acoplados aos MEA será descrito.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Animal Care Legislação Europeia (2010/63 / UE), pelo Ministério da Saúde italiano, de acordo com o DL 116/1992 e pelas diretrizes da Universidade de Genova (Prot. N. 13.130, de maio 2011). Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais para o projeto e para minimizar o seu sofrimento.

1. Preparação de Materiais e Suportes

1. Construir o molde para construir as PDMS (Poly-dimetil-siloxano) de restrição por meio de um CNC (Controle Numérico Computadorizado) fresadora. Tal molde realiza-se em policarbonato com o cilindro central de politetrafluoroetileno (PTFE). Este material permite uma extracção fácil da máscara uma vez que o PDMS tem endurecido.
   NOTA: O projeto do molde foi realizada por Computer-Aided-Design (CAD) e, em seguida, entregue ao fresadora CNC.
2. Prepara-se o elastómero PDMS. PDMS é um polímero orgânico. Ele é constituído por dois elementos, Um agente de cura e um polímero. Misture-os por uma relação de volume de 1:10, uma parte do agente de cura e nove partes de polímero. Colocar os dois componentes em uma placa de Petri, e inserir agitar a mistura na câmara de vácuo durante 10 minutos para eliminar as bolhas de ar. 3 g de PDMS são suficientes para uma restrição.
3. Construa a restrição PDMS. Inserir o material PDMS no moldador e colocá-la no forno durante 30 minutos a 120 ° C. A restrição de PDMS tem a forma de um cilindro ideal, com um diâmetro interior e exterior de 22,0 e 3,0 mm, respectivamente, e uma altura de 650 microns.
4. Um dia antes do chapeamento, casal a máscara para a área ativa das matrizes Micro-Eletrodo (AMA) por meio de uma pinça sob microscópio estereoscópico e esterilizar a máscara PDMS no forno a 120 ° C.
5. Esterilizar a microesferas de vidro (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio certificado de 42,3 ± 1,1 uM) em etanol a 70% durante 2 horas num frasco cónico e girar every 30 min para expor todas as micropérolas.
6. Remover a solução de etanol a partir do frasco e lavar as micro-esferas duas vezes com água esterilizada.
7. Condiciona-se a parte central da área de MEA delimitada pela máscara de PDMS (diâmetro igual a 3,0 mm) com 24 ul de solução de mistura de poli-D-lisina e laminina em 0,05 ug / ml.
8. Revestir as micropérolas com proteínas de adesão, a laminina e poli-D-lisina na 0,05 ug / ml e deixá-los durante a noite na incubadora a 37 ° C, para se obter uma rede neuronal estável e de longa duração.
9. Remover os factores de adesão, tanto a partir da superfície de vidro da MEA e para as microesferas de vidro. Aspirar aproximadamente 95% da solução de revestimento com uma pipeta e aplicar uma pequena volume- 24μl- de água estéril sobre a superfície do MEA. Aspirar novamente mais do que 95% da água e deixar secar o MEA sob o capô laminar durante 1 h antes do plaqueamento das células.
   NOTA: No caso de micro-esferas em vez disso, o revestimento aspirarsolução e fazer uma primeira lavagem com água esterilizada e um segundo com o meio basal e seu complemento, tais como B27, a fim de condicionar a superfície do vidro, onde os neurónios vai ser revestida. Não deixe que as microesferas de seca. Deixar-los em suspensão no meio de cultura no interior do frasco.
10. Distribuir, por meio de uma pipeta -200 μl-, a suspensão de micro-esferas tratadas (cerca de 32.000) numa placa com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (diâmetro de poro de 0,4 um), onde eles se auto-montam formando uma camada uniforme.
11. Encher cada poço da membrana com 0,5 ml de meio e colocá-lo na incubadora (T = 37,0 ^{° C,} _CO2 = 5%) até que os neurónios estão prontos a ser revestida (3,2).

2. Dissecção de Embriões e dissociação de Tissue

1. Ratas adultas Casa (200-250 g) a uma temperatura constante (22 ± 1 ° C) e humidade relativa (50%), sob um horário de luz-escuro normal (em 7 de luz-AM-7 PM) nabiotério. Certifique-se de que os alimentos e água estão disponíveis gratuitamente.
2. Anestesiar um rato fêmea grávida após 18 dias de desenvolvimento (E18), utilizando 3% de isoflurano. Então, sacrificar o animal por deslocamento cervical.
3. Remover hipocampos de cada embrião de rato e colocá-los em solução salina equilibrada de Hank gelada sem ^Ca2 + e ^Mg2 +. No dia 18 de desenvolvimento do hipocampo e do córtex tecidos são muito suaves e não precisa de ser cortado em pequenos pedaços. Mais detalhes podem ser encontrados ^18,19.
4. Dissociar o tecido em solução de 0,125% de tripsina / de Hank contendo 0,05% de DNAse, durante 18-20 min a 37 ° C.
5. Remover a solução de sobrenadante com uma pipeta Pasteur e parar a digestão enzimática pela adição de meio com 10% de soro fetal de bovino (FBS) durante 5 min.
6. Remover o meio com FBS e lavar uma vez com o meio com suplemento a, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Retirar novamente o meio com um pip Pasteurette e encher de novo com uma pequena quantidade (500 uL) de meio de crescimento com o seu complemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml.
7. Dissociar o sedimento tecido mecanicamente com uma pipeta Pasteur estreita até uma suspensão leitosa de células é aparente. Não é necessário centrifugar a suspensão de células.
8. Dilui-se a pequeno volume de suspensão de células com o meio de crescimento para se obter um volume final de 2,0 ml. Contagem celular a concentração obtida com uma câmara de hemocitómetro. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração desejada de células de 600-700 células / mL.

3. celular Galvanização

1. As células em placas a uma densidade de cerca de 2.000 células / mm ² sobre a área activa do MEA, definidos pela restrição PDMS para criar uma rede neuronal 2D.
   Nota: Cada hipocampo contém cerca de 5 x 10 ⁵ células, (1 x 10 ^{6 para} um único embrião). Dissecar 6 embriões para obter um montante total de 6 x 10⁶ células em 2 ml e uma concentração estimada de 3.000 células / mL. Dilui-se esta concentração de 1: 5 a fim de se obter a concentração de células desejada e placa cerca de 600-700 células / mL. Se a área de MEA delimitado pela restrição PDMS é de cerca de 7.065 mm ^2, e o número total de células plaqueadas 600 células / mL x 24 mL = 14.400 células, a densidade final de 2.038 células / mm ^2.
2. Colocar os dispositivos de MEA na incubadora humidificada com CO ₂ ambiente (5%) a 37 ° C.
3. Distribuir 160 ul da suspensão com uma concentração de células de 600-700 células / ul (cerca de 100.000 células) sobre a superfície da monocamada micropérolas posicionado no interior das placas com múltiplas cavidades para completar o passo preliminar para a construção de cultura tri-dimensional. Colocar as placas com múltiplas cavidades na incubadora humidificada com CO ₂ ambiente (5%) a 37 ° C.

4. Construção 3D Rede Neuronal

1. 6-8 horas após o plaqueamento, transferir a suspensão (micropérolas com neurónios) a partir das placas com múltiplas cavidades com muito cuidado dentro da área delimitada pela restrição PDMS usando uma pipeta para definir um volume de cerca de 30-40 ul. Depois de cada transferência, espere por cerca de meio minuto, para permitir que as microesferas para se juntam em uma estrutura compacta hexagonal.
2. Uma vez que todas as camadas são depositadas e espontaneamente montado, encher com uma grande gota de cerca de 300 ul de meio do topo da área delimitada pela restrição de PDMS.
3. Coloque a estrutura 3D acoplado a MEA na incubadora (T = 37,0 ^{° C,} _CO2 = 5%) durante 48 horas antes da adição de um volume final (cerca de 1 ml) de meio de cultura de crescimento com o seu complemento.
   NOTA: Considere o número total de grânulos sobre as placas com múltiplas cavidades com pastilha de membrana (30,000) e o número de pérolas numa única camada sobre o dispositivo MEA (6000). A estrutura 3D resultante é composto por 5 camadas de microbeads e células. Levando-se em conta que a rede neuronal 3D não é geometricamente perfeita, a estrutura em 3D resultante pode ser composta de 5-8 camadas.
4. No dia após o plaqueamento, adicionar cuidadosamente o volume final do meio (cerca de 900 uL) no interior do anel de MEA. Manter as culturas 3D em uma atmosfera humidificada de CO ₂ (5%) a 37 ° C durante 4-5 semanas. Substituir metade do meio de uma vez por semana.

5. Microscopia Confocal Aquisição

1. Fixar as amostras biológicas para a fase de microscópio de um suporte. Defina a laser (argônio, 496-555 nm), a velocidade de verificação (400 Hz) em que adquirir a imagem, o ganho e offset (-0,3%), da PMT para cada imagem para capturar o filtro de emissão de banda correta e em ordem para evitar a saturação e para aumentar a relação sinal-ruído. A seção de resultados informa os valores utilizados para adquirir as imagens da Figura 4.
2. Para a aquisição da sequência Z -stack, abetost selecionar, o valor da posição z da parte superior e a camada inferior da amostra, e em seguida, selecione o tamanho do passo para fazer a aquisição.

Resultados

. Neste procedimento experimental, um papel relevante é reproduzida pelas microesferas que definem o andaime mecânica para o crescimento da rede neuronal 3D Figuras visor 1A e B, o arranjo das microesferas (diâmetro nominal de 40 ± 2 uM; diâmetro médio autenticada 42,3 ± 1,1 uM) no plano. A particularidade deste tipo de estruturas é que micropérolas espontaneamente auto-montar definindo uma geometria hexagonal compacto (Figura 1B e C). O andaime assim gerado garante uma...

Discussão

Neste trabalho, um romance experimental em plataforma vitro composta de 3D ​​engenharia culturas neuronais acoplados a AAM para eletrofisiologia rede foi apresentada. A utilização de micropérolas como andaime para permitir que o crescimento neurítico ao longo da -axis Z foi adaptado para ser integrado com o MEA planar. Desta forma, os resultados obtidos micro-sistema em um modelo in vitro 3D válido e confiável para estudar a dinâmica eletrofisiológicos emergentes ^16.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µ g/ml
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µ g/ml
de tripsina	Gibco	25050-014	0,125% diluído 1:2 em HBSS sem CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0,05% diluído  em solução de Hanks
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049 meio de	cultura
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% de meio supleente
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	gentamicina 0,5 mM
	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poli-Dimetil-Siloxano (PDMS)	Corning Sigma	481939	agente de cura e o polímero
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA com: Grelha de eléctrodos 8x8; Espaçamento e diâmetro dos eletrodos 200 e 30 µ m, respectivamente; anel de plástico sem rosca
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Peça de Vidro. Tamanho Stds 40 µ m
Placas	Transwell Costar Sigma	CLS 3413	com inserção de membrana (6,5 mm de diâmetro poroso 0,4 µ m)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Solução Tampão	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	politetrafluoretileno
Rato	Sprague Dawley	Wistar Rato
Microscopia Confocal Vertical	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 Objetivo de ÁGUA	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 Objetiva de ÁGUA	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 Objetiva ÁGUA	Leica	HCX IRAPO L