Artigo de método

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

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DOI:

10.3791/53085

⸱

7 de outubro de 2015

 ,  ,  , 
1Orthopaedic Surgery Department, Stanford University, 2Mechanical Engineering Department, Stanford University, 3Bioengineering Department, Stanford University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

Resumo

A cartilagem articular humana é altamente suscetível a danos e tem potencial limitado de auto-reparo e regeneração. Estratégias baseadas em células para projetar o tecido cartilaginoso oferecem uma solução promissora para reparar a cartilagem articular. Para selecionar a fonte celular ideal para o reparo tecidual, é importante desenvolver uma plataforma de cultura apropriada para examinar sistematicamente as diferenças biológicas e biomecânicas na cartilagem de engenharia de tecidos por diferentes fontes celulares. Aqui, aplicamos uma plataforma de cultura de hidrogel biomimético tridimensional (3D) para examinar sistematicamente o potencial de regeneração da cartilagem de condrócitos juvenis, adultos e osteoartríticos (OA). O hidrogel biomimético 3D consistiu no componente sintético poli(etilenoglicol) e no componente bioativo sulfato de condroitina, que fornece um microambiente fisiologicamente relevante para o cultivo in vitro de condrócitos. Além disso, o andaime pode ser potencialmente usado para entrega de células para reparo de cartilagem in vivo. O tecido cartilaginoso projetado no andaime pode ser avaliado usando expressão gênica quantitativa, coloração por imunofluorescência, ensaios bioquímicos e testes mecânicos. Utilizando esses resultados, fomos capazes de caracterizar o potencial regenerativo diferencial de condrócitos de idades variadas, tanto no nível de expressão gênica quanto nas propriedades bioquímicas e biomecânicas do tecido cartilaginoso projetado. O modelo de cultura 3D pode ser aplicado para investigar as diferenças moleculares e funcionais entre condrócitos e células progenitoras de diferentes estágios de desenvolvimento normal ou aberrante.

Introdução

Com seu potencial limitado de auto-reparo, a cartilagem articular humana sofre danos irreversíveis frequentes. Atualmente, esforços extensivos estão focados no desenvolvimento de abordagens eficientes baseadas em células para o tratamento de lesões da cartilagem articular. O sucesso dessas terapias baseadas em células é altamente dependente da seleção de uma fonte celular ideal e da manutenção de seu potencial regenerativo. Os condrócitos são uma fonte celular comum para o reparo da cartilagem, mas são limitados em oferta e podem se desdiferenciar durante a expansão in vitro em cultura de monocamada 2D, limitando assim sua geração de cartilagem hialina 1.

O objetivo deste protocolo é estabelecer uma plataforma de hidrogel tridimensional para um estudo comparativo in vitro de condrócitos humanos de diferentes idades e estados de doença. Ao contrário da cultura bidimensional convencional (2D), os hidrogéis tridimensionais (3D) permitem que os condrócitos mantenham sua morfologia e fenótipo e fornecem um ambiente fisiologicamente relevante que permite que os condrócitos produzam tecido cartilaginoso 2,3. Além de fornecer uma estrutura física 3D para a cultura de condrócitos, os hidrogéis imitam a função da matriz extracelular (MEC) da cartilagem nativa. Especificamente, a inclusão de metacrilato de sulfato de condroitina fornece um reservatório potencial para fatores parácrinos secretados 4 e permite a degradação mediada por células e a renovação da matriz 5. Embora muitos sistemas de cultura de hidrogel 3D tenham sido amplamente utilizados em vários estudos, incluindo géis de agarose e alginato, usamos um sistema de cultura 3D biomimético que tem algumas vantagens distintas para a cultura de condrócitos. O sulfato de condroitina (CS) é um componente abundante na cartilagem articular e os hidrogéis PEG-CS demonstraram manter e até aumentar o fenótipo condrogênico e facilitar a degradação e renovação da matriz mediada por células 2,5. Além disso, as propriedades mecânicas do andaime de hidrogel podem ser facilmente moduladas pela mudança da concentração de PEG e, portanto, podem ser utilizadas para aumentar ainda mais o potencial de regeneração dos condrócitos ou de um tipo de célula relacionado 6,7. O PEG/CSMA também é biocompatível e, portanto, tem potencial para uma aplicação clínica direta em defeitos de cartilagem, por exemplo. A limitação para este sistema é sua complexidade e o uso de fotopolimerização que pode potencialmente afetar a viabilidade celular em comparação com sistemas mais simples como a agarose, no entanto, as vantagens para a cultura de condrócitos superam as limitações potenciais.

A cultura de hidrogel 3D é compatível com o ensaio convencional para avaliação do fenótipo celular (expressão gênica, imunocoloração de proteínas) e resultado funcional (quantificação da produção de matriz de cartilagem, testes mecânicos). Este ambiente 3D favorável foi testado para comparar o potencial de regeneração tecidual de condrócitos humanos de três populações de idades diferentes em culturas 3D de longo prazo.

Os resultados foram avaliados por meio de ensaios fenotípicos e funcionais. Condrócitos juvenis, adultos e OA apresentaram respostas diferenciais na cultura de hidrogel biomimético 3D. Após 3 e 6 semanas, a expressão gênica condrogênica foi regulada positivamente em condrócitos juvenis e adultos, mas foi regulada negativamente em condrócitos OA. A deposição de componentes do tecido cartilaginoso, incluindo agrecan, colágeno tipo II e glicosaminoglicano (GAG), foi alta para condrócitos juvenis e adultos, mas não para condrócitos OA. Os módulos compressivos das construções de cartilagem resultantes também exibiram tendências semelhantes. Em conclusão, tanto os condrócitos juvenis quanto os adultos exibiram disposição condrogênica e da matriz cartilaginosa até 6 semanas de cultura 3D em hidrogéis. Em contraste, os condrócitos osteoartríticos revelaram uma perda do fenótipo da cartilagem e capacidade mínima de gerar cartilagem robusta.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações dos sujeitos Stanford University Humanos e aprovado protocolo Institutional Review Board.

1. Articular condrócitos Isolamento

  1. Obter cartilagem a partir de tecido descartado durante artroplastia total do joelho e dissecar como descrito anteriormente 8.
  2. Visualmente seleccionar os côndilos femorais mediais ou laterais de amostras de cartilagem de superfícies lisas e fazer incisão na superfície da cartilagem por meio de um bisturi de forma a remover as biópsias 4-5 mm de cartilagem sem afectar o osso subcondral.
  3. Isolar condrócitos a partir da matriz extracelular por dissociação enzimática do tecido com tratamento / N O com colagenase purificados. Use proporção 1: 1 de colagenase II (125 U / ml) e a colagenase IV (160 U / mL) em meio de crescimento de condrócitos a 37 ° C.
  4. No dia seguinte, filtra-se o tecido digerido contendo as células dissociadas através de uma 70mm tamanho dos poros da malha de nylon. Lavar duas vezes com 20 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
  5. Placa os condrócitos isoladas a uma densidade de 1 x 10 6 células / 60 mm prato de cultura a seguir re-suspensão em meio DMEM / F12 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 25 ug / ascorbato mL, 2 mM de L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,25 ug / ml de fungizona). Manter as placas a 37 ° C e manter as culturas de condrócitos primários como uma monocamada de alta densidade antes da encapsulação em hidrogéis biomiméticos.

2. Biomimético Hidrogel Fabrication

NOTA: Este método permite a síntese de um hidrogel biomimética contendo poli (etileno-glicol diacrilato) (PEGDA, PM 5000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) em DPBS. A adição de foto-iniciador de reticulação permite fotoactivado. A composição de hidrogel final contém 7% pesart / volume (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, e 0,05% w / v do foto-iniciador.

  1. Sintetizar CS-MA por funcionalização polímero CS com grupos de metacrilato.
    1. Preparar uma solução tamponada de 50 mM de ácido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) 0,5 M e cloreto de sódio (NaCl) por dissolução de 1,952 g de MES e 5,84 g de NaCl em 200 ml de água desionizada (DIH 2 O). Dissolve-se 5 g de sal de sulfato de condroitina de sódio na solução tamponada.
    2. Adicionar 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxissuccinimida (NHS) e 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) (proporção molar de NHS: EDC = 1: 2) para a solução e agita-se durante 5 min.
    3. Adicionar 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (proporção molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) à solução e manter a reacção à temperatura ambiente durante 24 h.
    4. Purifica-se a mistura através de diálise contra água desionizada (DIH 2 O) durante 4 dias, utilizando tubagem de diálise (MWCO de 12-14 kDa).
    5. Filtra-se a purified solução através de um filtro de 0,22 um e coloque os tubos abertos contendo a solução no exsicador de vácuo e S / N. Assegurar que todos os tubos são protegidas da luz. Armazenar o polímero dissolvido à temperatura de -20 ° C ao abrigo da luz e humidade.

Encapsulation 3. celular

  1. Autoclave o filme e cilíndricas hastes de PCR (para perfurar os hidrogéis 3D de células-laden) e esterilizar o molde gel cilíndrico feito por encomenda por submersão em 0,2 m filtrada 70% de etanol em cultura de tecidos capô sob luz UV.
  2. Fecha-se o fundo do molde de gel com película de PCR autoclavado sem bolhas de ar ou aberturas para evitar a fuga. Mantê-lo em um estéril placa de 150 mm.
  3. O dia antes da encapsulação de células em hidrogel biomimética, dissociar a condrócitos de monocamada de alta densidade com tratamento / N O em colagenase II e solução de colagenase IV. Use 125 U / ml para a colagenase II e 160 U / ml de colagenase para cada VI em meios de crescimento de condrócitosa 37 ° C.
  4. Tomar um tubo de 50 ml e adicionam-se 5% em peso / volume (w / v) (diacrilato de etileno-glicol) poli (PEGDA, PM = 5.000 g / mol), 3% w / v de sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), e 0,05% w / v fotoiniciador em DPBS. Vortex do tubo para misturar a solução e mantê-lo de lado. Proteger o tubo de luz.
  5. Recolher as células dissociadas num tubo Falcon de 50 ml, contar e centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todo o material da tubo de células e adicionar o material de gel misturado acima para re-suspender as células a uma densidade de 15 x 10 6 células / ml. Misturá-lo 30 vezes completamente, evitando a formação de bolhas de ar.
  6. Pipetar 72 ul da suspensão de células de hidrogel ou hidrogel sozinho para dentro do molde de gel cilíndrico feito por encomenda e induzir a gelificação por exposição à luz UV (365 nm de comprimento de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepare alguma solução de hidrogel sem conteúdo celular. Use essas construções como controlos negativos para o futuro de testes bioquímicos e mecânica. Measure a intensidade da luz UV com um medidor de intensidade da radiação UV. Para ajustar a intensidade, alterar a distância entre a fonte de luz UV e o andaime hidrogel durante a gelificação.
    Observação: Uma vez que o hidrogel contém CS, a contribuição acelular é subtraído do conteúdo de GAG ​​bioquímica dos hidrogéis de células carregadas para representar apenas o GAG celular.
  7. Use um bisturi para cortar o filme para fácil peel off e com cuidado remova-o. Com a ajuda das hastes cilíndricas, empurrar para fora do gel para uma placa de 6 poços com 5 ml de DPBS estéril para lavar gel não polimerizado e células soltas.
  8. Cultura os hidrogéis de células carregadas em placas de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento de condrócitos em cada poço. Usar uma espátula descartável para transferir os hidrogéis lavou no bem.
  9. Avaliar a viabilidade celular por mortos vivem coloração 24 horas pós-encapsulamento usando um kit de viabilidade / citotoxicidade. Cultura os hidrogéis de células-laden e os hidrogéis vazios para 3-6 semanas mudando para gro de condrócitos frescoswth mídia a cada 2 dias antes da colheita para as análises.

4. RNA Extração e Análise de Expressão Gênica

  1. Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios.
  2. Com a ajuda de uma espátula estéril, transferir cada um hidrogel a um tubo eppendorf de 1,5 ml limpo e adicionar 250 ul de Tri-reagente a cada tubo. Siga as instruções do fabricante para isolar RNA.
  3. Após o isolamento de RNA e quantificação utilização de 1 ug de cada amostra que e efectuar uma transcrição invertida em ADNc utilizando o High Capacity cDNA Kit de Transcrição Reversa.
  4. Para PCR quantitativo usar TaqMan Gene Expression Arrays para exame da expressão de seus genes de interesse. Normalizar os níveis de expressão do gene de GAPDH internamente.
  5. Para as condições de PCR incluem a 2 min de incubação a 50 ° C para inactivar amplicões anteriores com glicosilase de uracilo de ADN, seguido por um 1060; min de incubação a 95 ° C para activar a polimerase de Taq. Em seguida, executar ciclos de PCR quarenta, que consistem de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C.

5. As análises bioquímicas

  1. Para cada estruturas celulares de hidrogel quantificar DNA e glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) produção como acompanhamento.
  2. Aspirar cuidadosamente a mídia e colocar estéril PBS 1X na célula-laden, bem como os hidrogéis de controle vazios. Pesar um tubo vazio e colocar o hidrogel dentro após a secagem-lo em papel de seda e registrar o peso ou peso úmido dos hidrogéis.
  3. Congelar cada hidrogel à temperatura de -20 ° C em um tubo Eppendorf de 1,5 ml separado para a digestão enzimática e depois usar-se uma alíquota do produto digerido a executar ensaio de Picogreen (para o DNA) e dimetil-metileno ensaio de azul (por GAG).
  4. Preparar a solução de papainase por digestão enzimática dos hidrogéis.
    1. Primeiro prepare o tampão PBE por pesando 7,1 g de sódio phosphate dibico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g do ácido etilenodiaminotetracético, sal dissódico (EDTA-Na2). Dissolver em 500 ml de dH 2 O, ajustar o pH para 6,5 e a solução purificada filtrar através de um filtro de 0,22 mm.
    2. Dissolve-se 0,035 g de L-cisteína em 20 ml de tampão de PBE. Filtra-se a solução e 100 ul de enzima papaína estéril.
  5. Quando estiver pronto para realizar os ensaios, levar os tubos de -20 ° C e adicionar 300 ul da solução de papaína pronto para os hidrogéis congelados. Esmagar o gel com um almofariz e pilão e misture bem com o pilão motor.
  6. Levar o volume para 500 ul com solução de papaína adicional. Realizar o mesmo procedimento para os geles de controlo. Incubar a 60 ° C durante 16 horas 3,9. A solução contendo o hidrogel pode digerido por conseguinte, utilizados para quantificação de ADN e de GAG. Medir o teor de ADN, utilizando o ensaio de Picogreen com fago lambda de ADN como padrão seguinte PR do fabricanteotocol.
  7. Quantificar o conteúdo sulfatada-GAG utilizando o azul 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensaio de ligação de corante com sulfato de condroitina tubarão como padrão 10. Determinar o teor de GAG ​​dividindo-se a quantidade de GAG ​​para o peso húmido correspondente.

6. Ensaios Mecânicos

  1. Realizar ensaios de compressão simples, utilizando um Instron 5944 sistema de testes equipada com uma célula de carga de 10 N.
    1. Depois dos dias desejados de cultura in vitro, execute o teste de compressão no cadafalso célula-hidrogel e os hidrogéis de controle acelular.
    2. Submergir as amostras em um banho de PBS à temperatura ambiente e comprimir a uma taxa de 1% de deformação / seg para uma tensão máxima de 15% 11,12 desde o esforço fisiológico experimentado por tecido de cartilagem sob condições de carga tem sido relatada como sendo de 10-20% 13,14.
  2. Criar estresse vs. curvas de tensão e ajuste de curva usando uma equação polinomial de terceira ordem. Determinar os comprmódulo tangente essive partir da curva de ajuste equação em valores de deformação de 15%.

Resultados

Hidrogéis bioactivos contendo PEG e porções CS (Figura 1) representam uma plataforma ideal para a cultura e maturação de condrócitos articulares humanos 2,3,5,7. Os condrócitos a partir de diferentes idades e estados de doença podem ser cultivadas com o método descrito e analisado para o seu fenótipo, a expressão do gene e propriedades bioquímicas e mecânicas do tecido de cartilagem gerado. Três amostras de condrócitos, juvenile- 6 meses, adulto-34 anos e 74 anos osteoarthritic-, foram colhidos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Análises de condrócitos normais, tanto adulto e juvenil expressão de genes, apresentaram um aumento na expressão dos genes de condrócitos COL2A1 e COL6A1. Pelo contrário, os condrócitos doentes apresentaram uma diminuição dramática no COL2A1 enquanto se mantinha a expressão de COL6A1 (Figura 2) mostra uma perda de fenótipo condrogénica apesar de ser cultivadas num ambiente biomimética favorável.

Os hidrogeles de PEG-CS também servir como um ambiente dinâmico para os condrócitos a proliferar, digerir a matriz pré-existente de PEG e CS e depositar sua matriz pericelular e extracelular, os principais componentes do tecido de cartilagem madura. Tendo em conta estas qualidades, a expansão de condrócitos após 3 semanas de cultura in vitro pode ser estimada pela quantificação de ADN com o corante Picogreen. A análise comparativa dos três grupos de células demonstram que a densidade de populações de células juvenis e adultas foi inalterada enquanto os condrócitos OA exibiram uma diminuição dramática em comparação com o dia 1 de cultura. A perda de teor de ADN foi também observado por OA mas não outros condrócitos sugerindo a possibilidade de a morte das células durante a cultura a longo prazo (Figura 3). A matriz segregada foi quantificada como teor de GAG ​​sulfatado-por ensaio de ligação de corante DMMB na fase de ponto final após 3 semanas de cultura. MORDAÇA conteúdo é normalizada pelo peso úmido do hidrogel como recorDED antes da digestão enzimática e da contribuição acelular é subtraído. Como mostrado na Figura 4, os condrócitos depositada uma quantidade significativa de GAG semelhante durante 3 semanas de cultura em hidrogéis 3D.

A presença de uma estrutura de suporte físico permite a avaliação de propriedades biomecânicas das amostras não confinada por meio de ensaios de compressão 2,3. Embora os hidrogéis acelulares submetido a um decréscimo na módulos de compressão, as construções de células-mantida em carga os módulos de compressão ao fim de 3 semanas em cultura (Figura 4). O fenotípica, análises bioquímicas e biomecânicas aqui descritas são, portanto, úteis para avaliar e compreender o potencial de diferentes populações de condrócitos para a cartilagem de engenharia.

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Figura 1. PEG-CS hidrogéis biomiméticos para condrócitos cul 3Dtura. Os condrócitos são ressuspensas numa mistura que contém o poli (etileno glicol diacrilato) (PEGDA) e sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) e fundido para dentro do molde de gel cilíndrico feito por encomenda. Após a exposição UV, solidificou géis são recolhidos a partir dos moldes e viabilidade celular é avaliada por coloração morto ao vivo 24 horas pós-encapsulamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Expressão de genes condrogênicos em condrócitos humanos cultivados em hidrogéis biomiméticos 3D. Quantitativa de expressão do gene COL2A1 marcadores da cartilagem e COL6A1 por juvenis, adultos e OA condrócitos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para o nível expressão gênica no dia 1. Erro bars representam a média ± SD. * p <0,05, conforme determinado por um teste t de Student bicaudal. Modificado de Smeriglio et al. 2 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. teor de ADN em condrócitos humanos cultivados em hidrogéis biomiméticos 3D. Quantificação por ensaio de ADN Picogreen em juvenis, adultos e OA condrócitos após 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para nível DNA no dia 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. GAG medição de conteúdo e teste de compressão simples de condrócitos humanos no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. (A) GAG quantificação por ensaio DMMB em condrócitos no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Os valores são normalizados para molhar peso (ww) e expressos como ug / g. (B) módulo de compressão (kPa) de acelular e celulares carregados de hidrogéis no dia 1 e depois de 3 semanas de cultura em hidrogéis biomiméticos 3D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Conforme relatado no presente protocolo, os hidrogéis 3D são capazes de manter condrócitos fenótipo na cultura, evitando o processo de desdiferenciação celular em células fibrocartilagem normalmente encontrados com culturas em monocamada 15. Além disso, as culturas a longo prazo do construto hidrogel chondrocytes- revelou um ambiente favorável que mantém as características intrínsecas de células associadas com a idade e a doença.

A utilização de um hidrogel biomimética 3D tem várias vantagens. Em primeiro lugar, a inclusão de sulfato de condroitina (CS), um componente principal encontrado na cartilagem articular, permitir que as células de degradar a matriz de hidrogel através da secreção de condroitinase e deitou-se cartilagem recém-sintetizado extra-celular da matriz 5, 16. Além disso, o CS foi mostrado que têm propriedades anti-inflamatórias nas articulações artríticas. O hidrogel biomimética também pode ser utilizado como um material de andaimes para entrega em células de reparação de cartilagem, e podem ser quimicamente modificadospara facilitar uma melhor integração 17,18 tecido-biomaterial.

A utilização de hidrogeles de PEG-CS permite culturas a longo prazo de condrócitos e a avaliação das propriedades bioquímicas e mecânicas. Aqui mostramos como esta plataforma pode ser útil para as análises comparativas de diferentes fontes de condrócitos diferenciados, a fim de definir o tipo celular ideal para a engenharia de cartilagem. Curiosamente, condrócitos encapsulados em hidrogéis permanecer viável e proliferam de acordo com as suas capacidades intrínsecas. Os suportes composição de hidrogel, na verdade, o crescimento de jovens e adultos condrócitos saudáveis, como mostrado na Figura 2. A composição e estrutura dos hidrogeles descritos também promove a formação de tecido de cartilagem, como indicado pela deposição de uma matriz extracelular funcional avaliada por glicosaminoglicano (GAG ) quantificação.

Uma vantagem adicional é que as construções de condrócitos-hidrogelpode ser avaliada para as propriedades mecânicas do tecido de cartilagem recém-formado. Note-se que o ensaio de compressão simples deve ser executada no hidrogel acelular para comparação. Os hidrogeles, de facto, tem uma rigidez intrínseca devido à rigidez das porções CS. Estirpe compressão simples de 5-20% (a uma velocidade de deformação de 1% / s) podem ser aplicados para o teste mecânico de tecido de cartilagem 11,12 desde o esforço fisiológico experimentado por tecido de cartilagem sob condições de carga tem sido relatada como sendo 10-20 % 13,14. A resposta de ambos célula de carga e acelulares hidrogéis ao teste mecânico foi avaliada no ponto final da cultura. No exemplo descrito acima, observou-se uma rigidez comparável das construções contendo adulto e juvenil condrócitos em contraste com a rigidez mais baixa das construções contendo condrócitos OA. Tais propriedades mecânicas da construção de células-hidrogel permitem a avaliação das propriedades funcionais dotecido formado dando uma análise aprofundada da capacidade maturação celular.

Em conclusão, a utilização dos hidrogeles biomiméticos 3D para estudar o potencial de diferente população de condrócitos para gerar tecido de cartilagem pode ser amplamente aplicada. Além dos estudos in vitro descrito aqui, o transplante in vivo das construções de células-carga pode ser concebido para estudar a maturação de células e o potencial regenerador no contexto fisiológico. Outras modificações da plataforma de hidrogel com factores adicionais biomiméticos também pode ser prevista para optimizar a proliferação de condrócitos e maturação.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Cirurgia Ortopédica de Stanford e ao Stanford Coulter Translational Seed Grant pelo financiamento. J.H.L. gostaria de agradecer à National Science Foundation Graduate Fellowship e à DARE Doctoral Fellowship pelo apoio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
condrócitos juvenis (sistema celular de condrócitos humanos normais clônicosCondrócitos adultos LonzaCC-2550
(sistema celular de condrócitos humanos normais clonéticos)
(diacrilato de etilenoglicol)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-1000-1g
ácido 2-morfolinoetanossulfônicoSigmaM5287
fotoiniciadorIrgacure 2959
cloreto de sódio SigmaS9888
sal de sulfato de condroitina sódica SigmaC9819
N-hidroxisuccinimida 
maE1769
2-aminoetil metacrilatoSigma516155
tubo de diáliseSpectrum Laboratories 132700
Colagenase 2Worthington Biochemical 
Colagenase 4Worthington Biochemical 
mídia DMEM/F12HyClone, Thermo Scientific SH3002301 
ensaio vivo/mortoLife TechnologiesL3224
Tri reagenteLife TechnologiesAM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de EnsaioInvitrogenP11496
Fosfato de sódio dibásico SigmaS3264
Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico SigmaE5134
L-CisteínaSigmaC1276
1,9-dimetiletileno azul Sigma341088
Instruments
- XX-15LW Lâmpada de Bancada, 365 nmUVP95-0042-07
Sistema de teste Instron 5944Corporação InstronE5940
) Poli Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida Sig 130672 LS004177LS004189Equipamento de luz UV

Referências

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