Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

Resumo

Descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal.

Resumo

O processo de morfogênese epitelial mamária é influenciado por hormônios. O estudo da ação hormonal no epitélio mamário usando culturas 2D é limitado à proliferação celular e aos desfechos de expressão gênica. No entanto, no organismo, a morfogênese mamária ocorre em um ambiente 3D. Os sistemas de cultura 3D ajudam a preencher a lacuna entre a cultura de células monocamada (2D) e a complexidade do organismo. Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal. Ele usa a linha de células epiteliais de mama humana responsiva a hormônios comercialmente disponível, T47D, e colágeno de cauda de rato tipo 1 como matriz. Este modelo de cultura 3D responde aos principais hormônios mamotrópicos: estradiol, progestinas e prolactina. A influência desses hormônios na morfogênese epitelial pode ser observada após 1 ou 2 semanas de tratamento, de acordo com o endpoint. As culturas 3D podem ser colhidas para análise da morfogênese epitelial, proliferação celular e expressão gênica.

Introdução

Ao contrário das culturas 2D padrão, modelos de cultura de células de substituição 3D permitem o estudo do comportamento das células epiteliais num contexto fisiologicamente relevante, um tecido semelhante a um. culturas 3D da glândula mamária ajudaram a explicar muitos aspectos do desenvolvimento da glândula mamaria e neoplasia. No entanto, a maioria dos modelos de cultura 3D actualmente disponíveis não são adequados para estudar a acção hormonal, porque as linhas de células epiteliais humanos utilizados para a tarefa não possuem a expressão do receptor da hormona ^6,7,9.

Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio mamário humano que é adequado para estudar a ação hormonal ^12. Este modelo utiliza a linha disponível comercialmente hormona de resposta epitelial humano da mama celular, T47D ^3,11,13, que foram originalmente derivados de um derrame pleural obtido a partir de um paciente do sexo feminino de 54 anos com um carcinoma ductal infiltrante da mama. Nós usamos ratos colagénio de cauda de tipo 1 como uma matriz. Este culto 3Dure modelo é apropriado para o estudo da acção dos três principais hormonas mammotropic (estradiol, promegestona (um análogo da progesterona), e prolactina) em células epiteliais da mama humanas. Morfologia epitelial induzida por hormona pode ser avaliado quantitativamente ao longo do tempo através de análises morfométricas ^12.

Uma densidade de semeadura adequada permite que essas culturas em 3D para ser mantido por 2 semanas. Por esta altura, o desenvolvimento de estruturas é suficiente para uma avaliação quantitativa da acção da hormona robusta na morfologia epitelial. Os géis podem também ser colhidas a pontos de tempo anteriores para a proliferação celular e analisa a expressão do gene. Além disso, este modelo é apropriado para testar os efeitos de um tratamento hormonal sequencial; por exemplo, após o tratamento com estradiol durante a primeira semana e substituição com outra hormona / combinação de hormonas durante a semana seguinte. O efeito dos compostos estrogénicos e anti-estrogénios, tais como a ICI 182,780, também pode ser stumorreu usando este modelo de cultura 3D ^12.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Dissolve-se o progestagénio sintético promegestona (R5020) e 17-β-estradiol (E2) em etanol para fazer soluções de reserva 10 ^-3 m. Dissolver prolactina em água desionizada destilada para produzir uma solução stock de 1 mg / ml. Dissolve-se o antiestrogénio ICI 182,780 em DMSO para fazer uma solução estoque de 10 ^-2 M. Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C durante até 6 meses.
2. dextrano carvão (CD) despojado de soro e médio CDFBS:
   1. Calor-inactivar soro fetal de bovino (FBS) em um banho de água a 57 ° C durante 30 min.
      Nota: Use apenas material de vidro lavado com ácido para o restante deste protocolo.
   2. Calcula-se a quantidade de carvão necessária. Usando 10% mais volume do que a quantidade de soro para compensar o deslocamento provocado pelo carvão, pesar 5% p / v de carvão activado em pó.
   3. Lavar duas vezes com carvão vegetal água destilada desionizada fria usando o mesmo volume que a quantidade de soro. Para cada lavagem centrifuge a 50 xg durante 2 min para sedimentar o carvão vegetal. Retire a água entre as lavagens. Adicionar 0,5% p / v de Dextrano T-70 para o último sedimento carvão. Re-suspender com água destilada, água desionizada e centrifugar a 100 xg durante 5 min. Aspirar a água.
   4. Adicionar o volume apropriado de soro para o sedimento e re-suspender o sedimento carvão dextrano no soro. Incubar, enquanto rola (6 RPM), a 37 ºC durante 60 min. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min. Se sobrenadante turvo, repita a centrifugação; no entanto, o soro pode não ser completamente claro neste momento, mas serão apagados durante a filtração.
   5. Filtrar através de um filtro de 0,80 micron e, em seguida, novamente através de um filtro de 0,45 mícron para remover matéria em partículas maiores. Por último, esterilizar-filtro com um filtro de 0,20 micron. Loja filtrada CDFBS em tubos de vidro ou T-25 frascos de cultura a -20 ºC.
   6. Charcoal Dextran Stripped fetal bovino contendo media (mídia CDFBS): misturar 375 ml de fenol DMEM isento de vermelho e 125 ml de DMEM/ F-12. Remover 37,5 ml e substituí-lo com o mesmo volume de soro fetal bovino carvão dextrano Stripped. Adiciona-se 10 ^{6 U} / ml de penicilina e L-glutamina numa concentração final de 2 mM. Os meios de comunicação resultante é de 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, 7,5% de dextrano a carvão despojado-FBS, 2 mM de L-glutamina, e 10 ^{6 U} / ml de penicilina.
3. Prepare PBS 10X, NaOH 1 N e água desionizada destilada. Prepare um volume suficiente de cada um de acordo com o volume de solução de colágeno necessário. Esterilizar todas as soluções de filtragem. Armazenar a 10x PBS e água desionizada destilada estéril a 4 ° C durante até 1 mês. Não guarde a solução de NaOH 1N.
4. Preparar a solução de colagénio a uma concentração final de 1 mg / ml de acordo com o protocolo para "Processo de gelificação alternativo para o colagénio I da cauda de rato" fornecida pelo fabricante. Cada gel é feito de 1,5 ml de solução de colagénio. Por exemplo, preparar a 18,5 ml (0,5 ml para ter em conta perdas durante a pipetagem) de solução de colagénio para preparar12 géis. Utilizar a solução de colagénio imediatamente ou manter em gelo durante até 2-3 horas.
5. Carmine Alum corante:
   1. Combinar 1 g Carmine e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 ml de água destilada. Ferver enquanto se agitava durante 20 min. Observe com cuidado para evitar a ferver sobre. Ajustar o volume final de volta para 500 ml com água destilada adicional.
   2. Adicionar um cristal de timol para a atividade antimicrobiana e cobrir garrafa com folha de alumínio para proteger da luz. Filtrar através de um filtro de papel de grau de laboratório antes de cada utilização. Reutilizar a solução de carmim por até três meses. Armazenar à temperatura ambiente, protegida da luz.
6. solução de colagenase: dissolver a colagenase em meio DMEM / F12 a uma concentração de 0,125% w / v. Não guarde esta solução.

2. Cultura 3D de T47D As células em Rat cauda colágeno tipo 1 Géis e tratamento hormonal

Nota: manter pipetas serológicos estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C.

1. Prepare uma suspensão de uma única célula e executar uma contagem de células. culturas de células de divisão T47D antes que eles atinjam 70% de confluência. Centrifuga-se o volume que contém a quantidade de células necessárias. Considere-se que um gel deve conter cerca de 75.000 células T47D.
2. Usando uma pipeta a frio, de re-suspender o sedimento de células no volume apropriado de colagénio. Considere-se que cada gel é composta de 1,5 ml de colagénio. Misturar as células e colagénio o cuidado para evitar a introdução de bolhas.
3. Para impedir o efeito de electricidade estática na distribuição das células, o escovar fronteiras, superior e inferior da placa de 12 poços com uma escova estática de redução depois de retirar a placa. Para evitar o acúmulo de carga estática durante o contato com a superfície de trabalho da capa, colocar esta placa em cima da outra placa de 12 poços (placa em branco), que também foi escovado com o brush.Gently estática de redução, despeje 1,5 ml da mistura em cada poço da placa de 12 poços.
4. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. Remover the placa da incubadora e coloque-o novamente na capa.
5. Usando uma ponta estéril p200, retire cuidadosamente o gel em um suave movimento circular a partir da fronteira do poço. O gel também deve destacar a partir do fundo do poço.
6. Diluir hormonas em meio CDFBS a ser adicionado aos poços. Use E2 e R5020 a uma concentração final de 10 ^-10 M e prolactina num a 10 ^-7 M concentração final. Como controle, usar a mídia CDFBS sem hormônios adicionados, mas ainda contendo o maior volume de DMSO igual às existências hormonais utilizados. Certifique-se de que cada poço contém 1,5 ml de meio. Coloque as culturas 3D dentro de uma temperatura de 37 ° C, _5% de _CO2, 100% tecido humidade cultura incubadora. Manter as culturas por 1 ou 2 semanas, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias.

3. Gel de processamento para toda Mounts

1. Remover o meio de cultura e adicionar 1,5 ml de PBS a cada poço.
2. Transferir o gel para um slide. Cortar o gel em meio usando uma curvad lâmina cirúrgica. Continuar o processamento com uma metade e guardar a outra metade para análise histológica.
3. Transfira a metade gel para toda montar a um slide. Vamos gel seco durante 5 minutos e, em seguida, transferir o slide para um frasco Coplin contendo formol a 10%.
   Nota: todas as incubações deve ser feito à temperatura ambiente.
4. Fix géis em um frasco coplin num agitador O / N.
5. Lave as lâminas com PBS duas vezes durante 10 minutos cada em agitador. Transferir as lâminas para 70% de EtOH; incubar durante 1 hora no agitador. lâminas de transferência para Carmine Alum O / N.
6. No dia seguinte, desidratar lâminas num agitador em EtOH a 70%, EtOH a 95% e 100% de EtOH, durante 1 h cada. Transferir as lâminas ao xileno duas vezes para 1 hora cada e manter em shaker. Use meio de montagem à base de tolueno para montar os géis e 1,5 mm de espessura Lamelas.
7. Examine as peças inteiras sob luz normal (microscópio ou estereoscópio). Para uma análise mais detalhada da forma e lumen usar microscopia confocal e visualizar corante carmim com HeNe 633 a laser nm.

4. Processamento de Gel de Processamento de Análise de Histologia

1. Transferir a metade restante do gel para um frasco de vidro de 20 ml contendo 10% de formalina e fixar num agitador de O / N.
2. Lavar géis duas vezes com PBS durante 10 min cada, num agitador. géis coloque em cassetes de processamento para inclusão em parafina.
3. geles de transferência para 70% de EtOH, incubar durante 1 h e seguir com 95% de EtOH, durante 1 h, para alterar fresco EtOH a 95% durante 1 hora, 100% de EtOH, durante 1 h, e para alterar fresco EtOH a 100% durante 1 hora. Neste ponto, os géis podem ser armazenados em EtOH a 100% O / N à TA ou incubaram-se com xileno, durante 1 h e, em seguida, novamente em xileno fresco durante 1 hr.
4. cassetes de transferência de parafina durante 1 hora a 60 ° C na incubadora de vácuo, repetir com parafina fresco mais duas vezes.
5. Preencha moldes de plástico com parafina limpo. Abrir a cassete, retirar o gel e colocá-la no molde de plástico contendo parafina. Encha-se com parafina e adicione topo da cassete contendo a etiqueta para cima e deixe bloco legal.
6. Remover o Plastic molde e seção do bloco usando um micrótomo. Obter 5 um de espessura para a coloração HE e imunohistoquímica.

5. A extracção de células a partir de células a partir de géis usando colagenase tratamento

1. Remover o gel a partir do poço e transferi-lo para uma placa de Petri contendo PBS. brevemente gel de lavagem.
2. Transferir o gel para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de colagenase a 0,125%. Pipetar cima e para baixo 4-5 vezes de modo a quebrar o gel em pedaços pequenos.
3. Incubar a 37 ° C durante 25 minutos (até que se dissolveu em gel e as células estão em suspensão)
4. Adicionar 2 ml de meio de cultura soro suplementado. Coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min), sobrenadante de descarte, as células re-suspender e contar.

Resultados

A Figura 1 resume o procedimento para a preparação das culturas em 3D sensível ao hormônio. estruturas epiteliais são observados em peças inteiras de géis cultivadas durante 2 semanas, na presença de E2 sozinho e em combinação com outras hormonas. Apenas as células individuais ou grupos de 2-3 células estão presentes quando não há hormonas são adicionados ao meio de cultura (meio de CDFBS) (Figura 2). Esta condição serve como um controlo negativo.

As células...

Discussão

Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D sensível a hormônios para testar a ação dos hormônios no epitélio mamário. A resposta aos hormônios pode ser avaliada nos níveis de morfologia tecidual, proliferação celular e expressão gênica ¹². Uma limitação dessa técnica é que a visualização durante o período de cultura é restrita à microscopia de luz, uma vez que as culturas são cultivadas em uma placa de fundo de plástico. O sistema de cultura 3D pode ser adaptado a placas de fundo de vidro para permitir imagens ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Cultura de Tecidos de 12 poços (Falcon)	Fisher Scientific	08-772-29
Tubos cônicos de poliestireno de 15 ml	Carvão Ativado Fisher Scientific	14-959-49D
	Sigma	C-5510
Carmine Alum	Sigma	C1022-100G
Colagenase, Tipo 3	Worthington	S0C11784
Microscópio Confocal	Zeiss	LSM510	Equipado com laser HeNe 633nm
Dextran T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, sem vermelho de fenol	Life Technologies	11339-021	Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal
DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Technologies	11054-020	Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal
17-β-Estradiol	EMD Millipore	3301	Dissolvido em etanol
Etanol	Koptec	V1001
Soro bovino fetal	Hyclone	SH30070.03	Para uso com hormônios, deve ser despojado de carvão Dextrano
Filtros (115 ml)	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	0.88, 0.45, 0.20 micron, respectivamente
Formalina, 10%	Fisher Scientific	SF93-20
L-Glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant)	Sigma Aldrich	I4409-25MG	Dissolvido em DMSO
Microtome	Leica	RM2155
Mídia de incorporação de tecidos	McCormick Scientific	39502004
Penicilina	Sigma	7794-10MU	Dissolvido em 10 ml de água destilada deionizada
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Fosfato tamponado solução salina pH 7,4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
Prolactina	Sigma Aldrich	L4021-50UG	Dissolvido em água destilada e deionizada
Promegestone	Perkin Elmer	NLP004005MG	Dissolvido em Etanol
Colágeno de Cauda de Rato	Corning	354236	Lotes podem conter concentrações variadas, note de acordo
Bisturi	Miltex	4311
Processador de Tecidos de Bancada Semi-fechado	Leica	TP1020
Hidróxido de Sódio	Sigma Aldrich	S5881	Prepare 1N NaOH estoque
StaticMaster Escova antiestática	Pipetas	C3500
Stripette	Corning	4101
frascos T-25 Corning
de Tecido	Fisher Scientific	15-200-403E
Frascos Wheaton, Vidro, 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
Xileno	VWR	95057-822

Life Sorológicas Amstat 430168