Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

Resumo

Descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal.

Resumo

O processo de morfogênese epitelial mamária é influenciado por hormônios. O estudo da ação hormonal no epitélio mamário usando culturas 2D é limitado à proliferação celular e aos desfechos de expressão gênica. No entanto, no organismo, a morfogênese mamária ocorre em um ambiente 3D. Os sistemas de cultura 3D ajudam a preencher a lacuna entre a cultura de células monocamada (2D) e a complexidade do organismo. Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio da mama humana que é adequado para estudar a ação hormonal. Ele usa a linha de células epiteliais de mama humana responsiva a hormônios comercialmente disponível, T47D, e colágeno de cauda de rato tipo 1 como matriz. Este modelo de cultura 3D responde aos principais hormônios mamotrópicos: estradiol, progestinas e prolactina. A influência desses hormônios na morfogênese epitelial pode ser observada após 1 ou 2 semanas de tratamento, de acordo com o endpoint. As culturas 3D podem ser colhidas para análise da morfogênese epitelial, proliferação celular e expressão gênica.

Introdução

Ao contrário das culturas 2D padrão, modelos de cultura de células de substituição 3D permitem o estudo do comportamento das células epiteliais num contexto fisiologicamente relevante, um tecido semelhante a um. culturas 3D da glândula mamária ajudaram a explicar muitos aspectos do desenvolvimento da glândula mamaria e neoplasia. No entanto, a maioria dos modelos de cultura 3D actualmente disponíveis não são adequados para estudar a acção hormonal, porque as linhas de células epiteliais humanos utilizados para a tarefa não possuem a expressão do receptor da hormona ^6,7,9.

Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D do epitélio ma....

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Dissolve-se o progestagénio sintético promegestona (R5020) e 17-β-estradiol (E2) em etanol para fazer soluções de reserva 10 ^-3 m. Dissolver prolactina em água desionizada destilada para produzir uma solução stock de 1 mg / ml. Dissolve-se o antiestrogénio ICI 182,780 em DMSO para fazer uma solução estoque de 10 ^-2 M. Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C durante até 6 meses.
2. dextrano carvão (CD) despojado de soro e médio CDFBS:
   1. Calor-inactivar soro fetal de bovino (FBS) em um banho de água a 57 ° C durante 30 min.
      Nota: Use apenas material de vidro lavado com ácido para o....

Resultados

A Figura 1 resume o procedimento para a preparação das culturas em 3D sensível ao hormônio. estruturas epiteliais são observados em peças inteiras de géis cultivadas durante 2 semanas, na presença de E2 sozinho e em combinação com outras hormonas. Apenas as células individuais ou grupos de 2-3 células estão presentes quando não há hormonas são adicionados ao meio de cultura (meio de CDFBS) (Figura 2). Esta condição serve como um controlo negativo.

As células.......

Discussão

Aqui, descrevemos um modelo de cultura 3D sensível a hormônios para testar a ação dos hormônios no epitélio mamário. A resposta aos hormônios pode ser avaliada nos níveis de morfologia tecidual, proliferação celular e expressão gênica ¹². Uma limitação dessa técnica é que a visualização durante o período de cultura é restrita à microscopia de luz, uma vez que as culturas são cultivadas em uma placa de fundo de plástico. O sistema de cultura 3D pode ser adaptado a placas de fundo de vidro para permitir imagens .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Cultura de Tecidos de 12 poços (Falcon)	Fisher Scientific	08-772-29
Tubos cônicos de poliestireno de 15 ml	Carvão Ativado Fisher Scientific	14-959-49D
	Sigma	C-5510
Carmine Alum	Sigma	C1022-100G
Colagenase, Tipo 3	Worthington	S0C11784
Microscópio Confocal	Zeiss	LSM510	Equipado com laser HeNe 633nm
Dextran T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, sem vermelho de fenol	Life Technologies	11339-021	Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal
DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem vermelho de fenol	Technologies	11054-020	Meio sem vermelho de fenol para uso hormonal
17-β-Estradiol	EMD Millipore	3301	Dissolvido em etanol
Etanol	Koptec	V1001
Soro bovino fetal	Hyclone	SH30070.03	Para uso com hormônios, deve ser despojado de carvão Dextrano
Filtros (115 ml)	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	0.88, 0.45, 0.20 micron, respectivamente
Formalina, 10%	Fisher Scientific	SF93-20
L-Glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780 (fulvestrant)	Sigma Aldrich	I4409-25MG	Dissolvido em DMSO
Microtome	Leica	RM2155
Mídia de incorporação de tecidos	McCormick Scientific	39502004
Penicilina	Sigma	7794-10MU	Dissolvido em 10 ml de água destilada deionizada
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Fosfato tamponado solução salina pH 7,4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
Prolactina	Sigma Aldrich	L4021-50UG	Dissolvido em água destilada e deionizada
Promegestone	Perkin Elmer	NLP004005MG	Dissolvido em Etanol
Colágeno de Cauda de Rato	Corning	354236	Lotes podem conter concentrações variadas, note de acordo
Bisturi	Miltex	4311
Processador de Tecidos de Bancada Semi-fechado	Leica	TP1020
Hidróxido de Sódio	Sigma Aldrich	S5881	Prepare 1N NaOH estoque
StaticMaster Escova antiestática	Pipetas	C3500
Stripette	Corning	4101
frascos T-25 Corning
de Tecido	Fisher Scientific	15-200-403E
Frascos Wheaton, Vidro, 20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
Xileno	VWR	95057-822

Life Sorológicas Amstat 430168