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Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

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DOI:

10.3791/53100

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18 de setembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Nossos objetivos foram para projetar, fabricar e testar stents ferromagnéticos para a captura de células endoteliais. Dez stents foram testados quanto à fractura e mais 10 stents foram testados para o magnetismo retida. Finalmente, 10 stents foram testados in vitro e 8 mais stents foram implantados em 4 porcos para mostrar a captura e retenção celular.

Resumo

Endotelização rápida de stents cardiovasculares é necessária para reduzir a trombose de stent e para evitar a terapia anti-plaquetas que podem reduzir o risco de sangramento. A viabilidade do uso de forças magnéticas para capturar e reter as células endoteliais excrescência (EdC) marcadas com nanopartículas de óxido de ferro super-paramagnéticas (spion) foi mostrado anteriormente. Mas esta técnica requer o desenvolvimento de um stent funcional mecanicamente a partir de um material magnético e biocompatível seguido de in-vitro e in-vivo de ensaio para comprovar rápida endotelização. Nós desenvolvemos um stent fracamente ferromagnéticos de aço inoxidável 2205 duplex utilizando desenho assistido por computador (CAD) e seu design foi aperfeiçoada por meio de análise de elementos finitos (FEA). O desenho final do stent exibiu a principal pressão abaixo do limite de fratura do material durante cravamento mecânica e expansão. Cem stents foram fabricados e um subconjunto deles foi usado para ensaios mecânicos, tempo de retained medições do campo magnético, em estudos in vitro de captura de células, in vivo e estudos de implantação. Dez stents foram testados para implantação para verificar se eles sustentado friso e expansão ciclo sem falhas. Outros 10 stents foram magnetizadas usando um ímã de neodímio forte e seu campo magnético retido foi medido. Os stents mostrou que o magnetismo retido foi suficiente para capturar spion marcado EOC nos nossos estudos in vitro. Foi verificada marcado com spion captura e retenção de EOC em grandes modelos animais através da implantação de um stent magnetizado e um stent controle não-magnetizado em cada um dos 4 porcos. As artérias stented foram explantadas após 7 dias e analisados ​​histologicamente. Os stents fracamente magnéticos desenvolvidas neste estudo foram capazes de atrair e reter as células endoteliais marcado com spion que podem promover a cura rápida.

Introdução

Pacientes implantados com stents vasculares fabricados a partir de materiais trombogênicos como aço inoxidável, cromo-cobalto e cromo-platina – tanto stents metálicos (BMS) quanto stents farmacológicos (DES) – precisam de terapia antiplaquetária para prevenir a formação de trombos. Os BMS cicatrizam rapidamente, mas estão sujeitos a reestenose em estágio avançado devido à cicatrização incompleta. Os stents farmacológicos requerem terapia antiplaquetária de longo prazo devido ao atraso na cicatrização. A terapia antiplaquetária administrada para evitar trombose como resultado de cicatrização incompleta ou tardia leva ao aumento do risco de sangramento e pode não ser adequada para certos pacientes1,2. Um stent ideal cicatrizará completa e rapidamente, evitando assim a terapia antiplaquetária a longo prazo e a reestenose em estágio avançado. Essa cicatrização completa só pode ser alcançada se o stent for rapidamente revestido com uma monocamada de células endoteliais após o implante. O revestimento dos stents com materiais biocompatíveis, como ouro ou outros biopolímeros, demonstrou melhorar a resistência à tromboresistência, mas nenhuma dessas técnicas alcançou a compatibilidade sanguínea ideal como pode ser possível com o revestimento com células endoteliais3,4.

Um stent pode ser revestido com células endoteliais após a implantação, atraindo células progenitoras circulantes. Essa técnica de auto-semeadura pode ser alcançada utilizando ligantes e anticorpos. Mas essa técnica é limitada pelo baixo número de células progenitoras endoteliais circulantes. Uma estratégia promissora é entregar células diretamente ao stent imediatamente após o implante durante um curto período de oclusão do fluxo sanguíneo3,5. Essa estratégia requer uma técnica para capturar rapidamente as células e retê-las no stent, mesmo após restaurar o fluxo sanguíneo. Desenvolvemos uma técnica na qual um stent magnético é usado para atrair e reter células endoteliais marcadas magneticamente entregues após o implante. Para conseguir isso, é necessário um BMS funcional com propriedades magnéticas suficientes para capturar e reter células endoteliais marcadas magneticamente6.

Neste artigo, discutimos os métodos para projetar, fabricar e testar um stent de aço inoxidável 2205. Os stents foram projetados usando CAD e FEA. Os stents fabricados foram magnetizados usando um ímã de neodímio e o campo magnético retido foi medido usando uma sonda microssensor de magneto-resistência. Em seguida, testamos os stents para captura de células marcadas magneticamente em uma placa de cultura durante nossos experimentos in vitro. Finalmente, os stents foram testados in vivo implantando stents magnéticos e não magnéticos em 4 porcos e analisando histologicamente as artérias com stent.

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Protocolo

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Utilização (IACUC) da Clínica Mayo.

1. Análise e Desenho de um 2205 de aço inoxidável Stent

  1. Projetando um nu metal stent usando CAD
    1. Faça um cilindro oco extrudido, selecionando em função 'de ressalto extrudado / base' com a espessura da parede igual à espessura haste do stent.
    2. Projetar um padrão de stent em um avião diferente esboço tangente ao cilindro extrudido. Adicione a largura do padrão plana para coincidir com a circunferência do cilindro oco extrudido.
    3. Transferir o projeto padrão plano para o cilindro oco usando o recurso de envoltório.
    4. Salve a peça em seu formato nativo e também em formato ACIS a ser exportado para FEA.
  2. Análise de elementos finitos para os modelos de stents
    1. Importe a geometria sólida salvo no formato ACIS no módulo de parte do software FEA para mais analysé.
    2. Modelo 2 cilindros analíticos de forma coaxial com o stent no modelador parte do software FEA. O cilindro tem um diâmetro exterior inicial maior do que o diâmetro da prótese endovascular para simular o punção e o cilindro interior tem um diâmetro inicial de 1 mm para simular um balão de inflação.
    3. Clique duas vezes no item da árvore 'casos' do modelador de montagem para montar o dito acima partes em posições relativas.
    4. Use o módulo de malha do software FEA, especifique o tipo de elemento como 20-nó de elemento de hexaedro com integração reduzida, especifique o tamanho do elemento, e malha do stent.
    5. Especificar pares de contato rígidas sem atrito entre o stent e os dois cilindros, respectivamente, no 'propriedades' de interação da árvore modelo.
    6. Atribuir comportamento tensão-deformação elasto-plástica de 2205 de aço inoxidável para o modelo de stent.
    7. Definir condições de contorno para cravar em primeiro lugar o cilindro exterior para 1 mm, o que simula o CRimping do stent. Remover o cilindro exterior para simular o relaxamento da prótese endovascular de cravamento. Expandir o cilindro interior a 3 mm para simular expansão e, finalmente, remover o cilindro interior para simular recuo da prótese endovascular.
    8. Defina os parâmetros de simulação, incluindo o número de processadores e quantidade de RAM alocados no 'Análise' item da árvore modelo e executar a simulação.
    9. Uma vez que a simulação é completa, abra o ficheiro de resultado (filename.odb) e pós-processar os resultados para estudar os principais estirpes e iterativamente melhorar a concepção do stent para alcançar um principal deformação de 20%, o que é menos do que o limite de falha do material .

2. Stent Fabricação e Teste de engaste e Expansão

  1. Fabricação Stent
    1. Obter os tubos de aço inoxidável 2205 por perfuração arma e precisão bar moagem material de estoque em uma empresa de usinagem de precisão, tais como produtos de precisão em Ação Pioneer,OH.
    2. Transferir os tubos terra de precisão e design plano padrão de stent para uma empresa stent corte como LaserAge Technology Corporation em Waukegan, IL para corte a laser e eletropolimento.
    3. Passivar a superfície dos stents eletropolidas submergindo-os em um ácido forte (50% de HCl) durante 10 min, seguido por uma base (10% de NaHCO3) durante mais 10 min. CUIDADO: lidar com produtos químicos com equipamento de proteção adequado e sob uma coifa. Finalmente, lavar os stents com álcool etílico e água desionizada. Este processo é chamado de decapagem ácida.
  2. Ensaios de stent fabricado para frisar e expansão
    1. Crimp o stent em um balão com três dobras usando uma mão ferramenta de friso. Segurar o stent eo balão com três dobras na ferramenta de compressão. Pressionar a alavanca para deformar radialmente o stent a ser cravado no balão.
    2. Inspecione o stent frisado usando um microscópio para uniforme de cravamento e quaisquer sinais de falha na estrutura devidoà deformação plástica.
    3. Expandi-lo para o diâmetro de 3 mm concebido pressurizando o balão com três dobras com água. Examine os stents expandidas para fraturas microscópicas e expansão uniforme.

3. Caracterização de Stent para Retenção de Campo Magnético

NOTA: ímã cilíndrico de 2 polegadas de diâmetro e 1 polegada de altura foi utilizado neste estudo. Os pólos do ímã estão alinhados ao longo do eixo. A densidade superficial do fluxo magnético do íman é de aproximadamente 1 T.

  1. Magnetizar os stents diametralmente ou axial utilizando um ímã de neodímio forte. Segurar o stent perto do forte ímã para cerca de 1 min para magnetização.
  2. Segurar o stent em uma das faces planas com o seu diâmetro ao longo das linhas de campo magnético para ser magnetizadas ou diametralmente Segurar o stent próximo à superfície cilíndrica com o seu eixo ao longo das linhas de campo magnético para magnetizar-lo axialmente. Fiel magnético retidod do stent foi encontrado para ser estável durante pelo menos 24 horas, mas o stent usar o mais rapidamente possível depois da magnetização.
  3. Monte os stents individualmente para mandris de vidro e, em seguida, montar os mandris de vidro no mandril de precisão do dispositivo de sondagem magnético. Sonda de micro-sensor magnético pode ser precisamente posicionada perto da prótese endovascular sem tocar na superfície utilizando o XYZ fases de montagem do dispositivo de sondagem magnética (Figura 4).
  4. Medir a leitura da linha de base do microssensor magnética longe da prótese endovascular e, em seguida, medir o campo magnético retida na superfície da prótese endovascular através do posicionamento da sonda utilizando as fases de XYZ a fixação magnética de sondagem.

4. Estudos de captura celular magnéticos

  1. Obtenção de células, a rotulagem com spion e coloração com corante fluorescente
    1. Derivar as células endoteliais excrescência (EdC) do sangue periférico de porco como descrito em 5,7. A cultura num frasco T-75 until aproximadamente 80% confluentes (5x10 6 a 8x10 6 células).
    2. Sintetizar SPIONs como a magnetita diâmetro de 10 nm (Fe 3 O 4) núcleo rodeado por 50 nm de espessura poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) shell como descrito em 8,9.
    3. Incubar a EOC derivado com spion a uma concentração de 200 ug / ml de meio de cultura celular durante 16 horas a 37 o C.
    4. Aspirar suavemente o meio de cultura celular. Lavar suavemente as células por adição de 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o balão, de balanço, e aspirando o PBS.
    5. Corar as células com corante fluorescente (CM-DII) para a visualização durante as experiências. Isto é feito por as instruções do fabricante, adicionando o corante para 10 ml de meio de cultura celular numa concentração de 5 ul / ml e incubou-se com as células durante 30 min a 37 ° C.
    6. Lavam-se as células com PBS como no passo 4.1.4 e incubar com 3 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% durante 5 min a 37 ° C alevantar as células do frasco.
    7. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml, superior fora com PBS, e centrifugar a 500 xg durante 5 minutos para formar um sedimento celular.
    8. Re-suspender o sedimento celular em PBS a uma concentração de 1-2x10 6 células / ml e misturar bem por pipetagem dentro e para fora do tubo cónico várias vezes.
  2. Em estudos in vitro de células-
    1. Concepção e fabricar (por exemplo, impressão em 3D) um acessório simples para manter o stent apenas acima da superfície de uma lamela de vidro.
    2. Desmagnetizar um stent utilizando um desmagnetizador eletromagnética ou magnetizar um stent diametralmente ou axial utilizando um ímã de neodímio forte.
    3. Pipeta da EOC marcado com spion suspensas em PBS no prato contendo os stents controle axialmente magnetizados ou diametralmente magnetizados ou não-magnetizados. Imagem dos stents com EOC suspensas em PBS imediatamente para a fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência invertido.
5. Em estudos in vivo em animais

  1. Implante de stent
    1. Extrair sangue periférico a partir de 4 porcos Yorkshire saudáveis ​​- pesando aproximadamente 50 kg - 3 semanas antes da implantação do stent, respectivamente, e a cultura EOC como descrito em 5,7.
    2. Administrar a medicação anti-plaquetária começando 3 dias antes da cirurgia (325 mg de aspirina e clopidogrel 75 mg por dia).
    3. No dia em que o implante de stent, anestesiar os porcos com intramuscular Telazol, xilazina e atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivamente), conforme estabelecido nos cuidados de animais e utilização diretrizes institucionais aplicáveis.
    4. Entubar e colocar o porco em inalação de 1-2,5% anestesia isoflurano.
    5. Raspar a região do pescoço ventral do porco e realizar o procedimento em condições estéreis gerais.
    6. Implant 1 magnetizado e um stent não-magnetizado na artéria coronária direita (RCA) utilizando a técnica de cateterismo cardíaco normal.
      1. Cathetezação de animais deve ser realizado por um cardiologista intervencionista treinada. Acesse a artéria carótida direita com uma bainha 9 French.
      2. Canular a artéria coronária alvo e injetar corante de contraste iodado para obter imagens da fluoroscopia.
      3. Coloque um fio guia 0,014 polegadas padrão coronária na artéria. Avance o balão e stent usar este fio-guia e implantar o stent em um navio de diâmetro 3-3,5 mm.
    7. Ocluir o fluxo de sangue dentro do proximal RCA para os stents implantados utilizando um balão ao longo do fio e a entregar cerca de 2x10 6 EOC autólogas marcadas com spion suspenso em 4 ml de PBS através da central de cateter ao longo de um período de 2 min.
    8. Restaurar o fluxo sanguíneo para o RCA após 2 min de oclusão adicional.
    9. Transferir o animal para a sala de recuperação e acompanhar de perto o animal até que ele recuperou a consciência.
    10. Continue a administrar a medicação anti-plaquetas (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg) pós operatório até o sacrifício.
  2. Explante Stent e histologia
    1. Eutanásia dos animais 7 dias após a cirurgia por anestesia primeiro animal, tal como explicado anteriormente, e em seguida administrar por via intravenosa uma dose letal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg) de acordo com cuidado e uso de animais com as orientações institucionais aplicáveis.
    2. Cirurgicamente colher os segmentos arteriais com stent. Fixar as artérias explantados em tampão de formalina a 10% durante um período mínimo de 30 min. Deixe as amostras em tampão de formalina para análise histológica.
    3. Terceirizar a amostra fixa às instalações capazes de realizar histologia com stents de metal. Durante este processamento, as amostras são incorporadas em metilo, em corte transversal, e analisados ​​histologicamente usando técnica de coloração de Mallory com mancha azul da Prússia para partículas de ferro.

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Resultados

Desenho de stent iterativo com base em FEA (Figura 1) revelou um stent que pode friso e expandir-se com uma entidade de deformação de 20%, o que é menos do que a estirpe final de 30%. Engaste e ensaio de expansão (Figura 2) não mostrou sinais de fractura. Fotos do stent deformado mostrou boa concordância com deformações FEA calculados e também imagens de microscopia mostrou nenhuma fratura (Figura 3). Como esperado a partir das medições do campo magnético retidos ...

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Discussão

Desenvolvemos um stent magnético que pode funcionar como um stent convencional e pode atrair células endoteliais marcado com spion. Em estudos anteriores envolvendo stents magnéticas, os pesquisadores usaram níquel stents revestidos comerciais e bobinas ou malhas feitas de materiais magnéticos devido à indisponibilidade de um stent ferromagnético 5,10-14. Outros grupos também têm utilizado a natureza paramagnética de stents de aço inoxidável 304 de grau comercialmente disponíveis para o direcionamento de nano...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman e Dr. Peter J. Psaltis, MBBS, PhD por suas valiosas contribuições. Este estudo foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – FNUSA-CICV (No. CZ.1.05/1.100/02.0123), Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (AHA #06-35185N), Institutos Nacionais de Saúde (T32HL007111) e Fundo de Inovação Grainger – Fundação Grainger.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2205 Aço inoxidávelCarpenter Technology CorporationBarra redonda material de estoque
AbaqusDassault sistemasSoftware
AtropinaMedicamento prescrito.
ClopidogrelNome comercial: Plavix. Medicamento prescrito.
CM-DiILife TechnologiesV-22888Sondas Moleculares, Eugene, OU
Meio de crescimento endotelial-2LonzaCC-3162
Ferramenta de crimpagem portátilEngenharia em blocoM1-RMC
Ácido clorídrico (HCl)Sigma AldrichMFCD00011324CUIDADO: use equipamento proptective e manuseie sob a capela
Anestesiacom isofluranoPiramal Critical Care, Inc. 
Álcool etílicoSigma AldrichMFCD00003568
Ímã NdFeB 2" Dia x 1" espessuraÍmãs incríveisD1000PÍmã de disco magnetizado axialmente com pólos em faces planas
BalãoQualquer balão trifold OTW disponível comercialmente pode ser usado
Solução salina tamponada com fosfatoLife Technologies10010-023Comumente conhecido como
Bicarbonato de Sódio PBS (NaHCO3)Sigma AldrichMFCD00003528
Pentobarbital de SódioZoetisNome Comercial: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Substância controlada a ser encomendada apenas por sistemas licenciados SolidWorks
Dassault Software
Microssensor SpinTJ-020MicroMagneitcs Sensible SolutionsSonda longa STJ-020 microssensor
SPIONMayo ClinicNanopartículas sintetizadas internamente (Ref: Lee, S. J. et al. Nanopartículas de óxidos férricos magnéticos encapsulados com poli(D,L latide-co-glicolide) e suas aplicações ao agente de contraste de ressonância magnética. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))Telazol
ZoetisSubstância controlada a ser encomendada apenas por veternarian licenciado
Trypsin EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazineBayer Animal HealthNome comercial: Rompun. Sunstance controlado a ser encomendado apenas por um veterinário licenciado
trifold Over-The-Wire

Referências

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