Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Resumo

A produção bacteriana de piomelanina resulta em aumento da resistência ao estresse oxidativo e virulência. Relatamos técnicas que podem ser usadas para determinar a inibição da produção de piomelanina e testar o aumento resultante na sensibilidade ao estresse oxidativo em bactérias, bem como determinar a concentração inibitória mínima de antibióticos (CIM).

Resumo

A piomelanina é um pigmento extracelular marrom-avermelhado produzido por várias espécies bacterianas e fúngicas. Este pigmento é derivado da via do catabolismo da tirosina e contribui para o aumento da resistência ao estresse oxidativo. A produção de piomelanina em Pseudomonas aeruginosa é reduzida de maneira dependente da dose através do tratamento com 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC). Descrevemos um método de titulação usando múltiplas concentrações de NTBC para determinar a concentração do medicamento que reduzirá ou abolirá a produção de piomelanina em bactérias. O método de titulação tem um resultado facilmente quantificável, uma redução visível na produção de pigmento com o aumento das concentrações de drogas. Também descrevemos um método de placa de microtitulação para testar a concentração inibitória mínima (CIM) de antibióticos em bactérias. Este método usa um mínimo de recursos e pode ser facilmente ampliado para testar vários antibióticos em uma placa de microtitulação para uma cepa de bactéria. O ensaio MIC pode ser adaptado para testar os efeitos de compostos não antibióticos no crescimento bacteriano em concentrações específicas. Finalmente, descrevemos um método para testar a sensibilidade bacteriana ao estresse oxidativo, incorporando H₂O₂ em placas de ágar e identificando múltiplas diluições de bactérias nas placas. A sensibilidade ao estresse oxidativo é indicada por reduções no número e tamanho da colônia para as diferentes diluições em placas contendo H₂O₂ em comparação com um controle sem H₂O₂. O ensaio de placa pontual de estresse oxidativo usa um mínimo de recursos e baixas concentrações de H₂O₂. É importante ressaltar que também tem boa reprodutibilidade. Este ensaio de placa pontual pode ser adaptado para testar a sensibilidade bacteriana a vários compostos, incorporando os compostos em placas de ágar e caracterizando o crescimento bacteriano resultante.

Introdução

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram negativa que produz uma variedade de pigmentos, incluindo piomelanina, um pigmento marrom-avermelhado que ajuda a fornecer proteção contra o estresse oxidativo^1-4 e se liga a uma variedade de compostos, incluindo antibióticos aminoglicosídeos^5-7. A produção de piomelanina é causada por um defeito na via do catabolismo da tirosina^4,8, seja por deleções ou mutações do gene que codifica a homogentisato 1,2-dioxigenase (HmgA)^1,9 ou por desequilíbrios nas várias enzimas da via¹⁰. O homogentisato se acumula devido à inativação de HmgA e é secretado e oxidado para forma....

Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura, antibióticos e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclo-hexanodiona (NTBC)

1. Adicione caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl _em H 2 O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Guarde-o em temperatura ambiente.
2. Adicione 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar _em H2O) em 250 ml de frascos. Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o agar é derretido antes de verter em placas.
   NOTA: Os frascos contendo 100 ml de LB agar irá originar 4 p....

Resultados

Titulações NTBC

As titulações NTBC foram utilizados para determinar se NTBC foi capaz de reduzir a produção em P. pyomelanin aeruginosa, e também identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção pyomelanin para utilização em ensaios adicionais. Pode haver variações nos níveis de pyomelanin produzida em diferentes repetições, mas as tendências gerais permanecer constante. O ensaio de titulação NTBC também poderia ser modificado para testar outros compostos .......

Discussão

O método de titulação NTBC descrito neste protocolo permitirá ao usuário determinar se o NTBC pode reduzir ou eliminar a produção de piomelanina em bactérias e determinar a concentração de NTBC necessária. A etapa mais crítica no ensaio de titulação NTBC é determinar a faixa de concentrações de NTBC a serem usadas no ensaio. Diferentes cepas de P. aeruginosa têm diferentes sensibilidades ao NTBC, e as cepas de laboratório podem ser mais sensíveis ao NTBC do que os isolados clínicos¹² (Figura 2.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Também chamado de nitisinona.  Solúvel em DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30% em peso em H2O.  Estabilizado.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Solúvel em H2O.  Esterilize por filtro.
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906-5	Solúvel em H2O.  Esterilize por filtro.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Solúvel em H2O.  Esterilize por filtro.