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Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

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DOI:

10.3791/53105

31 de agosto de 2015

Neste artigo

Resumo

A produção bacteriana de piomelanina resulta em aumento da resistência ao estresse oxidativo e virulência. Relatamos técnicas que podem ser usadas para determinar a inibição da produção de piomelanina e testar o aumento resultante na sensibilidade ao estresse oxidativo em bactérias, bem como determinar a concentração inibitória mínima de antibióticos (CIM).

Resumo

A piomelanina é um pigmento extracelular marrom-avermelhado produzido por várias espécies bacterianas e fúngicas. Este pigmento é derivado da via do catabolismo da tirosina e contribui para o aumento da resistência ao estresse oxidativo. A produção de piomelanina em Pseudomonas aeruginosa é reduzida de maneira dependente da dose através do tratamento com 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC). Descrevemos um método de titulação usando múltiplas concentrações de NTBC para determinar a concentração do medicamento que reduzirá ou abolirá a produção de piomelanina em bactérias. O método de titulação tem um resultado facilmente quantificável, uma redução visível na produção de pigmento com o aumento das concentrações de drogas. Também descrevemos um método de placa de microtitulação para testar a concentração inibitória mínima (CIM) de antibióticos em bactérias. Este método usa um mínimo de recursos e pode ser facilmente ampliado para testar vários antibióticos em uma placa de microtitulação para uma cepa de bactéria. O ensaio MIC pode ser adaptado para testar os efeitos de compostos não antibióticos no crescimento bacteriano em concentrações específicas. Finalmente, descrevemos um método para testar a sensibilidade bacteriana ao estresse oxidativo, incorporando H2O2 em placas de ágar e identificando múltiplas diluições de bactérias nas placas. A sensibilidade ao estresse oxidativo é indicada por reduções no número e tamanho da colônia para as diferentes diluições em placas contendo H2O2 em comparação com um controle sem H2O2. O ensaio de placa pontual de estresse oxidativo usa um mínimo de recursos e baixas concentrações de H2O2. É importante ressaltar que também tem boa reprodutibilidade. Este ensaio de placa pontual pode ser adaptado para testar a sensibilidade bacteriana a vários compostos, incorporando os compostos em placas de ágar e caracterizando o crescimento bacteriano resultante.

Introdução

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram negativa que produz uma variedade de pigmentos, incluindo piomelanina, um pigmento marrom-avermelhado que ajuda a fornecer proteção contra o estresse oxidativo1-4 e se liga a uma variedade de compostos, incluindo antibióticos aminoglicosídeos5-7. A produção de piomelanina é causada por um defeito na via do catabolismo da tirosina4,8, seja por deleções ou mutações do gene que codifica a homogentisato 1,2-dioxigenase (HmgA)1,9 ou por desequilíbrios nas várias enzimas da via10. O homogentisato se acumula devido à inativação de HmgA e é secretado e oxidado para forma....

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Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura, antibióticos e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclo-hexanodiona (NTBC)

  1. Adicione caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl em H 2 O) e alíquota em volumes apropriados. Esterilizar em autoclave. Guarde-o em temperatura ambiente.
  2. Adicione 100 ml de agar LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar em H2O) em 250 ml de frascos. Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o agar é derretido antes de verter em placas.
    NOTA: Os frascos contendo 100 ml de LB agar irá originar 4 p....

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Resultados

Titulações NTBC

As titulações NTBC foram utilizados para determinar se NTBC foi capaz de reduzir a produção em P. pyomelanin aeruginosa, e também identificar a concentração de NTBC que elimina ou reduz a produção pyomelanin para utilização em ensaios adicionais. Pode haver variações nos níveis de pyomelanin produzida em diferentes repetições, mas as tendências gerais permanecer constante. O ensaio de titulação NTBC também poderia ser modificado para testar outros compostos .......

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Discussão

O método de titulação NTBC descrito neste protocolo permitirá ao usuário determinar se o NTBC pode reduzir ou eliminar a produção de piomelanina em bactérias e determinar a concentração de NTBC necessária. A etapa mais crítica no ensaio de titulação NTBC é determinar a faixa de concentrações de NTBC a serem usadas no ensaio. Diferentes cepas de P. aeruginosa têm diferentes sensibilidades ao NTBC, e as cepas de laboratório podem ser mais sensíveis ao NTBC do que os isolados clínicos12 (Figura 2.......

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Dara Frank e Carrie Harwood por sua generosa contribuição de cepas. A Fundação de Pesquisa Milwaukee da Universidade de Wisconsin detém a patente nº 8.354.451; com alegações amplamente direcionadas ao tratamento ou inibição da progressão da infecção de um microrganismo em um paciente pela administração de um composto inibidor da dioxigenase 4-hidroxifenilpiruvato, como 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC). Os inventores são Graham Moran e Pang He. Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (R00-GM083147). A biblioteca mutante de transposons P. aeruginosa da Universidade de Washington é supo....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)Sigma-AldrichSML0269-50mgTambém chamado de nitisinona.  Solúvel em DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30% em peso em H2O.  Estabilizado.
GentamicinGold BioG-400-100Solúvel em H2O.  Esterilize por filtro.
KanamicinaFisher ScientificBP906-5Solúvel em H2O.  Esterilize por filtro.
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGSolúvel em H2O.  Esterilize por filtro.

Referências

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A.

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