Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

Summary

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

Abstract

Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM ^2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide _1-40 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.

Introduction

Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase ^1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos ^4,5.

Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o r....

Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH), aprovado pelo Comitê de Ética do Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

1. Os animais, cirurgia e Specimen Preparações

NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal 3D.

1. Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: Ap _1-40 -injection (n = 8), e Ap _1-40 -injection tratamento com genisteína (n = 8); administrar a genisteína (10 mg / kg, diluída em um veículo tal como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora ....

Results

Esta secção apresenta alguns exemplos das observações qualitativas e quantitativas produzidos por análise morfométrica 3D. Para os resultados completos de todos os 12 parâmetros mencionados anteriormente, consulte nossa publicação anterior ^10.

Observações qualitativos

Os astrócitos exibiram ramos finos ou grossos que eram geralmente muito tempo em Aâ _1-40 ratos injectados (Figura 1). Algumas pequenas astrócitos em forma de e.......

Discussion

No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap _{1-40 -} foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos.

As alterações .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beta amilóide 1-40	Sigma Aldrich	79793	Mantenha em -70 ° C
Genisteína	Sigma Aldrich	446-72-0	manter em -20 °
Anticorpos policolonais de coelho C contra a proteína ácida fibrilar glial	DAKO	Z0334
anticorpos anti-coelho IgG suínos conjugados com fosfato alcalino	DAKO
Liquid Permanent Chromogen	DAKO	K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Óleo de rícino polietoxilado - Etapa 1.1
LSM 700 Microscopia confocal de varredura a laser	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Análise de imagem 2000	Aparelho de estimulação óptica
	Tekno Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.