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Artigo de método

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

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DOI:

10.3791/53113

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11 de dezembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

Resumo

Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide 1-40 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.

Introdução

Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase 1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos 4,5.

Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o resultado clínico de intervenções terapêuticas. Por conseguinte, os astrócitos têm recebido atenção de neuroscientist durante as últimas décadas, como alvos potenciais para intervenção terapêutica para uma variedade de doenças que afectam o SNC.

Os astrócitos têm normalmente uma forma estrelada com o bem-defined ramos que se espalham ao redor da soma 6. Em uma condição de doença no cérebro, ramos de astrócitos tornar complicado e mostram extremidades inchadas 7, por exemplo na presença de beta-amilóide (Ap).

Este artigo apresenta um protocolo para a análise de imagens em 3D de astrócitos adquiridos por meio de microscopia confocal. Doze parâmetros quantitativos diferentes para cada astrócitos foram medidas: as áreas de superfície e volumes do território astrócitos (o tecido coberto por uma astrócitos), célula inteira (incluindo filiais), corpo celular e núcleo; o comprimento total e número de agências; a intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos; e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este fim, utilizou-se secções do cérebro de ratos expostos a injecção intra-hipocampal de Ap 1-40, com ou sem tratamento genisteína como uma substância anti-inflamatória. O protocolo descrito pode ser usado para uma morfométricaANÁLISE de diferentes tipos de células, in vitro ou in vivo em diferentes condições.

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Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH), aprovado pelo Comitê de Ética do Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

1. Os animais, cirurgia e Specimen Preparações

NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal 3D.

  1. Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection tratamento com genisteína (n = 8); administrar a genisteína (10 mg / kg, diluída em um veículo tal como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora antes da cirurgia.
  2. Anestesiar os animais com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme anestesia adequada por falta de reflexo de retirada depois de beliscar o dedo do pé. Use pomada nos olhos durante a cirurgia para prevenir o ressecamento.
  3. Coloque animais no aparelho estereotáxico e cabeça de barbear. Aplicar iodINE solução para limpar o couro cabeludo antes da incisão e manter o local da operação estéril durante a cirurgia para reduzir o risco de infecção. Injectar Ap 1-40 estereotaxicamente (4 ul) no hipocampo a -3,5 mm posterior ao bregma, ± 2 mm lateral à linha média, e -2.8 mm abaixo da dura-máter, de acordo com o atlas de cérebro de rato 8. Para o método estereotáxico por favor veja a publicação anterior 9.
  4. Fornecer pós-operatório de observação / cuidado até que os animais são totalmente consciente para garantir o conforto dos animais. Mantenha os animais quente durante a recuperação, e não devolvê-los para uma gaiola com outros animais até a recuperação completa. Preste atenção a qualquer sinal de infecção nos animais após a cirurgia.
  5. Anestesiar os animais profundamente por cetamina (150 mg / kg) três semanas após a cirurgia. Realizar transcardial fixação por perfusão dos animais com solução salina a 0,9%, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (pH = 7,4), em seguida, remover e corrigir cérebro, tal como descrito em 10 </ sup>.
  6. Pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% durante 2-3 dias a 4 ° C.
  7. Incorporar o tecido em blocos de parafina pelo uso de equipamentos de tecido de incorporação, e evitar sub-enchimento ou sobre-enchimento a cassete, pois pode interferir com o alinhamento ou de corte correta. Prestar atenção à orientação do tecido no bloco de parafina.
    NOTA: O hipocampo de ratos, por exemplo, está perto de parte posterior do hemisfério cerebral. Assim, o tecido deve ser incorporado em uma forma de seccionamento que começa na parte posterior do cérebro. Utilizar o atlas Paxinos 8 como um guia para alcançar a desejada estrutura anatómica.
  8. Coloque o micrótomo longe de correntes de ar ou portas desde movimentos aéreos fazer a manipulação de partes mais difíceis.
  9. Use seções com um de espessura ≥20 como com esta profundidade seja necessário para produzir imagens Z-pilha de astrócitos completos. Não use as primeiras seções casal, como eles podem ter espessura indesejada devido a e térmicaXpansion.
  10. Coloque as seções sobre a superfície da água quente (5 ± 2 C, abaixo da temperatura de fusão para parafina) apenas o tempo suficiente para achatar as seções.
    NOTA: Ao longo da secção de expansão pode perturbar a morfologia da estrutura. Use pincel pequeno para transferir cuidadosamente seções. Recolha de dois a três seções em cada slide.
  11. Armazenar as lâminas em um rack na posição vertical e deixe-os secar a 37 C durante várias horas ou O / N.

2. A imuno-histoquímica

  1. Desparafinar secções em xileno, 2 x 10 min, e re-hidratados através de gradiente de álcool (99,8%, 95%, e 70%, 10 min cada) e PBS.
  2. Incubar com anticorpos contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) diluído 1: 1500 em PBS contendo 0,25% de albumina de soro bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 e 3,5% de soro normal (O / N a 4 ° C).
  3. Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min.
  4. Incubar com fosfato alcalino antibodie secundário conjugados durante 1 h (1: 100, 21 C, diluiu-se em PBS).
  5. Lavam-se as secções em PBS durante 3 x 5 min.
    NOTA: É importante lavar as seções corretamente após anticorpos secundários para minimizar a coloração de fundo.
  6. Incubar seções na escuridão com líquido Cromógena Red Permanente (15-20 min). Nota: Preparar a solução não mais do que 30 minutos antes do uso.
  7. Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min.
  8. Finalmente, os núcleos coram com 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 500, diluído em PBS) antes da cobertura deslizante. Armazenar os slides na geladeira 24-48 h antes de microscopia.

3. Microscopia Confocal

NOTA: Para a avaliação quantitativa (ver abaixo), seleccionar um dos astrócitos com um núcleo com manchas de DAPI claramente visível com um mínimo de sobreposição ramos para reduzir o risco de erros. Produzindo imagens Z-Stack é demorado. Seja paciente e não parar durante o processamento. Confocal na vertical a laser microscópio de varredura é used para criar imagens 3D a partir de astrócitos.

  1. Coloque o slide no palco microscópio, e selecione o objetivo 63X.
  2. Abra o software de imagem e clique em sistema Start. Clique na aba Localize. Ir para Atribuir e selecione GFP para ajustar a luz adequada.
  3. Abra o obturador para refletir a luz. Encontre o refletor Revolver no lado direito do Obturador e escolher a cor que deve ser reflectido pelos astrócitos (verde, vermelho ou violeta); cor vermelha (FSet20 WF) foi utilizado aqui.
    NOTA: Não se esqueça de focar a imagem diretamente na ocular do microscópio.
  4. Para encontrar o melhor foco, clique em todas fechadas, colocar o pino microscópio no modo de tela, e clique na guia Acquisition.
  5. Clique na configuração inteligente sob a guia de Aquisição; uma janela se abre. Selecione o fluoróforo adequado (ou seja, DAPI e Alexa Fluor 555, no projeto atual) da lista. A cor é selecionado automaticamente.
  6. Clique na melhor sinal, e aplicar, em seguida, clique em Definir Exposição; o computador irá então automaticamente os parâmetros de exposição.
  7. Para otimizar a imagem, vá para a janela Channels. Desmar Track2, realce Track1 e clique em Live. Foque a imagem, se necessário.
  8. Na janela Canais ajustar as seguintes chaves; clique no 1AU para otimizar automaticamente o pinhole. É muito importante fazer esta etapa caso contrário, as imagens confocal será não-ideal. Ajuste de Ganho de ter a melhor intensidade (manter essa configuração abaixo de 800 para reduzir o ruído adicional). Finalmente, defina o Ganho Digital entre 2 e 3.
  9. Desmar Track1, clique em Track2 e repita o Passo 3.8 para Track2. Então pare Live.
  10. Vá para a janela no modo de aquisição. Melhorar a imagem, otimizando Frame Size e Média. Para mudar tamanho do quadro ir para X * Y e selecione 1024 x 1024. Escolha uma velocidade lenta para criar uma imagem melhor.
  11. Ir para a Média e selecione um número ≥4. Este valor indica o número de média de exames que serão em média de producè A imagem adquirida. Agora clique no botão Snap, e salvar a imagem em 2D capturado.
  12. Para geração de imagens 3D, marcar o item Z-Stack em Configuração inteligente fazendo com que a janela Z-Stack para abrir.
  13. Definir as primeiras e últimas posições para o Z-pilha, isto é, a profundidade da célula. Primeiro, clique em Live. Em seguida, use a unidade de foco do microscópio para se concentrar em sua posição mais elevada de astrócitos no tecido, onde o Z-Stack é começar. Clique em Set First. Em seguida, concentrar até a posição mais baixa do astrócito no tecido, onde Z-Pilha de varrimento deve ser interrompido. Clique em Set Último. Então pare Live.
  14. Escolha o intervalo; 1,01 uM é utilizado no presente estudo; intervalo de escolha pode ser feito clicando no Optimal para definir o número de fatias.
  15. Clique em Iniciar Experiment. Salve as imagens uma vez que a verificação for concluída. Esta imagem será utilizada para a medição dos parâmetros seguintes: área superficial e volume de território dos astrócitos, o astrócitos inteiro, incluindo branches, corpo da célula, e núcleo.
  16. Adquirir uma imagem 2D usando uma objetiva de 10X ou 20X conforme descrito nos Passos 3.6-3.11. Esta imagem pode ser utilizada para a medição da intensidade de fluorescência a imunorreactividade de anticorpos, e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2).

4. Astrocyte Densidade e GFAP + Intensidade de Fluorescência

  1. Abra a imagem 20X 2D. Clique na Histo (Hisogram) no lado esquerdo da janela da imagem.
  2. Para calcular a densidade de astrócitos, selecione três campos visuais consecutivos no âmbito do objectivo 20X. Contar o número de astrócitos que exibem uma soma claro com mínima, a sobreposição de ramos nos campos.
  3. Para quantificar a intensidade de fluorescência, selecione uma ferramenta adequada (retângulo ou círculo) no rodapé da janela de imagem e escolher uma área para a medição. Observe o valor médio eo desvio padrão aparecer automaticamente sob a imagem. No estudo atual, 0,7 mm2 área retangular entre strfoi utilizado iatum e lâmina medial do giro denteado.

5. Ramos astrócitos

  1. Para quantificar o comprimento eo número total de sucursais, usar imagens 3D (adquiridos com 20X) no software analisando a imagem. Desenhar uma linha manualmente ao longo do comprimento de cada ramo da astrocyte selecionado. Em seguida, selecione a ferramenta de medição que é especializada para medir a linha de comprimento. Para quantificar o número de agências, selecione a ferramenta de contagem para contar o número de itens selecionados.

6. Volume e Área de Superfície

NOTA: A marcação de uma estrutura manualmente em 3D software de análise de imagem requer foco e treinamento. Pratique várias vezes antes de iniciar um experimento.

  1. Para quantificar o volume ea área de superfície do núcleo astrócitos, soma, corpo celular e território, transfira as imagens 3D (adquiridos nos Passos 3.1-3.16) para um software de análise de imagens 3D, como Volocity 6.1.
  2. Abra o software e criar um novobiblioteca. Arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda na nova biblioteca. Em seguida, selecione uma imagem 3D. À direita, há diferentes canais com cores diferentes. Ligue um canal de interesses; por exemplo, o canal de azul para DAPI quando se mede o núcleo. Alterar o brilho manualmente para obter um contraste ideal.
  3. Selecione o menu Ferramentas, GO para fazer volume e produzir uma única imagem 3D a partir de imagens Z-stack. Clique em Propriedades no menu Editar e ter certeza de que X, Y e Z propriedades são apresentados; caso contrário, é impossível realizar uma análise 3D.
  4. Clique no ícone da ferramenta Freehand RIO na barra de ferramentas. Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos núcleo a desenhar uma linha ao redor do núcleo marcado com DAPI.
  5. Para medir o volume ea área de superfície do corpo celular astrocyte a desenhar uma linha ao redor da soma excluindo ramos.
  6. Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos inteiro (corpo celular, incluindo filiais) a desenhar uma linha ao redor da soma após asuperfície de todos os ramos.
  7. Para avaliar o volume ea área de superfície do território astrocyte a desenhar uma linha entre pontas dos ramos.
    NOTA: Pressione a tecla Delete no teclado para apagar desenhos indesejados.
  8. Clique no menu Medições na parte superior da janela de imagem para criar um protocolo de medição; uma janela contendo diferentes ferramentas abre.
  9. Arraste Encontre objetos para parte superior da janela (painel). Dê um nome descritivo à População 1, selecione a cor associada, e clique em Medida. Outra janela se abre.
  10. Escolha um parâmetro ou seja, o volume ou a superfície. Clique em OK. Os dados serão exibidos em uma tabela.
  11. Para salvar os dados clica no menu de medição e selecione Criar item de medição.
  12. Selecionar um novo item de medida chamada a partir da janela aberta. Em seguida, dê um nome para os dados e clique em OK.
  13. Finalmente, exportar os dados para software estatísticas, como Graph pad ou excel programa. Use t-teste para analisar os dados, em seguida, traçar 2D grAPHS.

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Resultados

Esta secção apresenta alguns exemplos das observações qualitativas e quantitativas produzidos por análise morfométrica 3D. Para os resultados completos de todos os 12 parâmetros mencionados anteriormente, consulte nossa publicação anterior 10.

Observações qualitativos

Os astrócitos exibiram ramos finos ou grossos que eram geralmente muito tempo em Aâ 1-40 ratos injectados (Figura 1). Algumas pequenas astrócitos em forma de e...

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Discussão

No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap 1-40 - foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos.

As alterações ...

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Divulgações

Este trabalho foi financiado por subvenções do Conselho do Condado de Östergötland, (Suécia) e da Celular e Molecular Research Center no Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

Agradecimentos

Os autores não têm nada a divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Beta amilóide 1-40Sigma Aldrich79793Mantenha em -70 ° C
GenisteínaSigma Aldrich446-72-0manter em -20 °
Anticorpos policolonais de coelho C contra a proteína ácida fibrilar glialDAKOZ0334
anticorpos anti-coelho IgG suínos conjugados com fosfato alcalinoDAKO
Liquid Permanent ChromogenDAKOK0640
Liquid permanent Red Substrate BufferDAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Óleo de rícino polietoxilado - Etapa 1.1
LSM 700 Microscopia confocal de varredura a laserCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Análise de imagem 2000Aparelho de estimulação óptica
Tekno Stoelting
Graph pad Prism 5Graph pad software Inc.

Referências

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  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
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