Artigo de método

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca 2+ E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

DOI:

10.3791/53166

⸱

10 de setembro de 2015

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

Resumo

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O manuseio do retículo sarcoplasmático (SR) de Ca2+ desempenha um papel fundamental no acoplamento normal de excitação-contração e o manuseio aberrante de SR Ca2+ é conhecido por desempenhar um papel significativo em certos tipos de arritmia. Como as arritmias são fenômenos emergentes espacialmente distintos, elas devem ser investigadas no nível do tecido. No entanto, os métodos para sondar diretamente o SR Ca2+ no coração intacto permanecem limitados. Este artigo descreve o protocolo para mapeamento óptico duplo do potencial transmembrana (Vm) e intra-SR livre [Ca2+] ([Ca2+]SR) no coração de coelho perfundido por Langendorff. Essa abordagem aproveita o indicador de baixa afinidade Ca2+ Fluo-5N, que tem fluorescência mínima no citosol, onde o [Ca2+] intracelular ([Ca2+]i) é relativamente baixo, mas exibe fluorescência significativa no lúmen SR, onde [Ca2+]SR está na faixa milimolar. Além de revelar características SR Ca2+ espacialmente em toda a superfície epicárdica do coração, essa abordagem tem a vantagem distinta de monitorar simultaneamente Vm, permitindo investigações sobre a relação bidirecional entre Vm e SR Ca2+ e o papel de SR Ca2+ em fenômenos arritmogênicos.

Introdução

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O mapeamento óptico duplo de Ca2+ intracelular e potencial transmembrana (Vm) no coração perfundido por Langendorff intacto tornou-se um dos pilares das investigações em eletrofisiologia cardíaca, incluindo mecanismos de arritmia e acoplamento excitação-contração1-4. Essa abordagem forneceu conhecimento sem precedentes sobre eletrofisiologia normal e anormal e, mais importante, sobre a relação bidirecional entre Vm e Ca2+ intracelular. No entanto, o mapeamento óptico de Ca2+ intracelular com indicadores fluorescentes de alta afinidade (como Rhod-2 e Fluo-4) relata apenas alterações em massa no Ca2+ intracelular e é incapaz de distinguir se essas alterações são devidas ao fluxo transmembrana de Ca2+, liberação e recaptação em estoques intracelulares ou, na maioria dos casos, alguma combinação de ambos. Além disso, os indicadores de Ca2+ de alta afinidade têm cinética liga-desliga lenta e podem não relatar com precisão mudanças rápidas na concentração de Ca2+ 5.

Cada potencial de ação desencadeia um aumento no Ca2+ intracelular, conhecido como Ca2+ intracelular transitório (CaT). No coração de mamíferos, aproximadamente 70 a 90% do CaT total é devido à liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (SR) por meio da abertura de receptores de rianodina (RyRs)6. Dentro do SR, aproximadamente metade do total de Ca2+ está ligado à calsequestrina (CSQ) e outros tampões intra-SR7, que desempenham um papel importante na homeostase do SR Ca2+ 8,9. A quantidade de SR Ca2+ livre determina a força motriz para a liberação de SR Ca2+, bem como o bloqueio de RyR e, portanto, tem um impacto significativo no CaT intracelular. Além disso, alterações na liberação ou recaptação de SR Ca2+ podem, por sua vez, impactar Vm por meio da troca eletrogênica Na+-Ca2+, o que pode ter consequências arritmogênicas. Portanto, além da CaT, o monitoramento do SR livre Ca2+ pode fornecer informações importantes sobre a disfunção contrátil e eletrofisiológica.

Nos últimos anos, os investigadores fizeram avanços significativos no monitoramento de SR Ca2+ em miócitos cardíacos isolados e de um único local no coração intacto. Um desses métodos requer pulsos rápidos de cafeína para abrir RyRs e o conteúdo de SR Ca2+ é então inferido ou calculado a partir do aumento imediato do Ca2+10 intracelular. Outra abordagem intrigante usa indicadores de Ca2+ de baixa afinidade, como Fluo-5N11 ou Mag-Fluo412, que se ligam ao SR Ca2+ livre. Esses indicadores têm constantes de dissociação (Kd) na faixa de 10 a 400 μM e, portanto, exibem fluorescência mínima no citosol em comparação com o lúmen SR, onde a concentração de Ca2+ ([Ca2+]SR) está na faixa milimolar. Usando indicadores de Ca2+ de baixa afinidade, vários aspectos da ciclagem de SR Ca2+ foram investigados no nível do miócito isolado, incluindo a liberação fracionada de SR Ca2+ e os mecanismos de Ca2+ alternans13,14. No entanto, para entender completamente a natureza heterogênea do ciclo SR Ca2+ no coração intacto e o papel do SR Ca2+ em fenômenos arrítmicos espacialmente distintos, são necessários métodos para obter imagens de SR Ca2+ na superfície epicárdica do coração intacto15.

Este artigo descreve a metodologia para mapeamento óptico duplo de SR livre Ca2+ e Vm no coração de coelho perfundido por Langendorff intacto com o indicador de baixa afinidade Ca2+ Fluo-5N. Além de revelar características de SR Ca2+ espacialmente em toda a superfície epicárdica do coração, essa abordagem tem a vantagem de monitorar simultaneamente Vm, permitindo investigações sobre a relação bidirecional entre Vm e SR Ca2+.

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Protocolo

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Todos os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade da Califórnia, Davis Animal, e aderiu ao Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo National Institutes of Health.

1. Preparação

  1. Prepare dois concentrados (25X) As provisões de solução modificada de Tyrode com antecedência e armazenar a 4 ° C: (1) Stock I (em mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) e (2) Stock II (em mM: NaHCO 3 500).
    1. Recentemente preparar a solução de 2 L de Tyrode com a seguinte composição (em mM): NaCl 128,2, CaCl2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 e glucose 11,1 por combinação de 1840 ml de água desionizada (DI) água, 80 ml da I, 80 ml de da II e 4 g de glicose. Não misture diretamente da I e da II; Adicione om 1.840 ml DI para evitar a precipitação.
  2. Preparar a solução estoque do desacoplador excitação-contracção blebbistatin a 10 mg / ml em di-metilsulfóxido anidro (DMSO) com antecedência e armazenar a solução estoque a 4 ° C.
  3. Preparar soluções de estoque de corantes fluorescentes: (1) RH237 tensão-sensível corante (1 mg / ml em DMSO) e (2) indicador de baixa afinidade cálcio Fluo-5N AM (2 mg / ml em DMSO) de acordo com as recomendações do fabricante. Use os preparativos imediatamente para evitar a decomposição com a subsequente perda de capacidade de carga.
  4. Primeiro o sistema de perfusão de Langendorff com recirculação oxigenada (95% de O 2, CO 2 5%) de solução de Tyrode. Ajustar o fluxo de O2 / CO2 para manter o pH da solução de Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilizar um filtro de rede em linha de nylon tecida (tamanho de poro: 11 | iM) para filtrar continuamente o perfusado.
    1. Primeiro o sistema de perfusão à temperatura ambiente, como loadi subsequenteng de Fluo-5N AM é realizada à temperatura ambiente. Para Fluo-5N AM carregamento, utilize um pequeno volume de recirculação perfusato (~ 150 mL). Depois de corante de carregamento, utilizar um volume maior de perfusato (1 - 2 G, ver Figura 1C).
  5. Ligue sistema de aquisição de dados e se preparar para a monitoração contínua de ECG e pressão de perfusão. Prepare o sistema de monitoramento de pressão-: Conecte um transdutor de pressão à linha de perfusão e monitorar a pressão de perfusão com um amplificador transbridge. Ajuste da pressão de perfusão de base a 0 mmHg, quando o coração não está ligado ao sistema de perfusão.
  6. Alinhe as câmeras mapeamento óptico para garantir o alinhamento espacial entre o V m e SR Ca 2 + sinais.
    1. Primeiro, o foco das câmeras, colocando uma régua ou um objeto com texto no prato de perfusão. Vire as câmeras de mapeamento em um modo de visualização ao vivo e ajustar o foco até que o texto é nítido e claro. Adquirir um fotograma único de cada câmera.
    2. Overlayestas imagens e ajustar a transparência da imagem de topo para que ambas as imagens são visíveis. O texto nas imagens devem se sobrepor exatamente. Se não perfeitamente alinhados, ajustar o ângulo do espelho dicróico ou a posição de cada câmara até que as duas imagens são alinhados.

2. A colheita, Perfusão, e Dye-carregamento de coelho coração

  1. Prenda o coelho em um limitador de coelho aprovado. Profundamente anestesiar através de uma injecção intravenosa (veia marginal da orelha) de pentobarbital de sódio (50 mg / kg) e heparina (1000 UI).
    1. Quando o Coelho exibe falta de reflexos nociceptivos, fazer uma incisão na pele da linha média para expor o esterno e costelas. Cortar o esterno com uma tesoura cirúrgica de ponta romba do xifóide ao manubrium. Tome cuidado para não danificar o coração, enquanto a abertura do esterno. Espalhar a nervuras para expor o coração.
    2. Excisar rapidamente todo o bloco coração-pulmão por um rápido corte de todos os navios e do tecido conjuntivo. Immediately colocar o bloco coração-pulmão em solução gelada de Tyrode.
  2. Localize a aorta para a perfusão retrógrada. Corte a aorta ascendente proximal apenas para os três ramos do arco aórtico. Canular a aorta para uma cânula 8 L ligado ao sistema de perfusão. Utilizar um pedaço de fio de sutura USP 0 seda para fixar a aorta para a cânula.
  3. Dissecar cuidadosamente a traqueia, pulmões e gordura epicárdica do coração. Com uma pinça e tesouras afiadas de dissecação, localize a válvula mitral e cuidadosamente danificar ou remover um folheto para evitar o congestionamento solução no ventrículo esquerdo.
  4. Submerge o coração na câmara de perfusão encamisado de vidro horizontalmente, com a superfície anterior do coração virado para cima para a imagiologia. Segurar a cânula a um pedaço de Sylgard com pinos em forma de U para o fundo do prato de silicone para impedir o movimento do coração durante o mapeamento (Figura 1D). Se desejado, inserir um pequeno pino de insectos no vértice do coração para STAbilização.
  5. Posição electrocardiograma (ECG) eléctrodos no banho no lado direito e esquerdo do coração. Totalmente submergir os eléctrodos no banho e garantir que eles não estão em contacto com a superfície do coração para proporcionar uma ECG conduzida volume análogo a uma configuração de eléctrodos eu. Verifique a ligação morfologia I ECG normal. Ajustar o fluxo (25 - 35 ml / min) para assegurar que a pressão aórtica é mantida a 60 - 70 mmHg.
  6. Desligue as luzes da sala e adicionar 0,3 - 0,6 ml da solução de blebbistatin (passo 1.2) ao perfusato (concentração final de 10 - 20 m).
    1. Desligue as luzes de quarto para evitar fotoinativação de blebbistatin. Se necessário, uma pequena holofote farol ou pode ser usado para fornecer a iluminação da tarefa.
      Nota: blebbistatin é um inibidor da ATPase da miosina e um desacoplador excitação-contração. Porque Fluo-5N carregamento exige (60 min) RT (hipotermia) condições prolongados (ver passos 2.8 - 2.10), a produção de energia cardíaca podem ser comprometidos. ºerefore, além de blebbistatin no perfusato antes de tingir o carregamento pode reduzir a demanda de energia 16 e eliminar os artefatos de movimento durante as gravações ópticas posteriores 17.
  7. Quando contração do coração cessou (10-15 min, verificado na gravação da pressão aórtica), mude para o pequeno volume sistema de recirculação de perfusão (ver passo 1.4.1).
  8. Preparar e colocar solução de carga Fluo-5N AM: Adicionar 0,25 ml da solução de Fluo-5N AM (passo 1.3) para 0,25 ml quente 20% Pluronic F127. Adicionar 0,5 ml de solução de Tyrode quente para a mistura, misturar bem e adicionar ao pequeno volume do sistema de recirculação-perfusão.
  9. Monitorar continuamente a pressão de perfusão e ECG e ajustar o fluxo, se necessário. Corante demora cerca de 1 hora à temperatura ambiente. 45 minutos após a carga ter começado, ligar o banho de água circulante para iniciar o aquecimento do sistema de perfusão e perfusado a 37 ° C.
  10. Após 60 min de Fluo-5N AM carregamento, switch a perfusão do maior volume sistema de recirculação de perfusão (ver passo 1.4).
  11. Dilui-se 50 ul da solução de corante sensível RH237 tensão (passo 1.3) em 1 ml de solução de Tyrode quente e adiciona-se lentamente (ao longo de 5 min ~) num proximal porta de injecção para a cânula.

3. Mapeamento óptica

  1. Durante os momentos finais de corante de carga, posicione o coração e concentrar as câmeras ópticas de mapeamento para garantir o campo apropriado de vista para o experimento.
  2. Se desejado, colocar um eléctrodo bipolar de estimulação sobre a superfície do epicárdio do coração para a estimulação.
  3. Colocar uma tampa de plástico ou de vidro de deslizamento sobre a superfície da câmara de perfusão para reduzir o movimento artefacto na superfície do líquido, que pode estar presente devido à recirculação da solução de perfusão.
    Nota: Como uma alternativa para uma lamela, use um 50 milímetros tampa de plástico limpo placa de Petri.
  4. Concentre-se as guias de luz para iluminar uniformemente a superfície do coração e comluz xcitation. Use azul diodo emissor de luz (LED) fontes de luz e filtrar a luz com um 475-495 nm filtro passa-banda (Figura 1A).
  5. Recolhe fluorescência emitida com um macroscópio e dois de metal-óxido-semicondutor (CMOS) complementares câmaras mapeamento óptico. Dividir a luz emitida com um espelho dicróico a 545 nm.
    1. -Passe longo filtrar a porção de comprimento de onda mais longo, contendo o sinal de V m, a 700 nm. Passa-banda do filtro de comprimento de onda mais curto porção, contendo o sinal de SR de Ca2 +, a partir de 502 - 534 nm (Figura 1A). Defina a frequência de aquisição de dados ópticos para 0,5-1 kHz.
  6. Para cada gravação óptica, primeiro iniciar o protocolo de estimulação desejado, ligar a luz de excitação, e recolher 1-4 sec de dados. Se desejar, sincronizar a protocolos de estimulação e aquisição de dados.
    Nota: Não é possível voltar a carregar o Fluo-5N AM, por conseguinte, a relação sinal-para-ruído (SNR) será reduse durante todo o experimento devido a tingir fuga do SR. Limitar protocolo experimental para 1-2 horas para assegurar altos valores de SNR.
  7. Após a experiência, lavar o sistema de perfusão na sequência de água desionizada, 70% de álcool reagente, e novamente com água DI.
  8. Filtrar cada conjunto de dados com um filtro gaussiano espacial (raio de 3 pixels) utilizando os pacotes de software comercialmente disponíveis de acordo com o protocolo do fabricante.
  9. Se necessário, espacialmente alinhar o V m e SR de Ca2 + conjuntos de dados. Tal como no passo 1.6, sobrepor imagens de cada câmera e verifique se as estruturas anatômicas do coração (ie., Vasculatura coronária, arestas dos átrios ou ventrículos) ou outros itens no campo de visão (ou seja, de uma cânula, a estimulação do eletrodo) exatamente sobreposição. Se não, o alinhamento espacial dos conjuntos de dados é necessária.
  10. Deslocar a imagem transparente no topo do xe y-direção até sobreposição exata é conseguido, fazendo notar o número de pixelsa imagem deve ser deslocado em cada direcção. O conjunto de dados de toda a imagem que corresponde ao topo (ou V m ou SR Ca 2+) deve então ser deslocado por o número de pixels determinados em cada direcção para assegurar o alinhamento preciso entre o V m e SR de Ca2 + conjuntos de dados.

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Resultados

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A Figura 1A mostra um diagrama esquemático da configuração óptica para dual V m e SR Ca2 + mapeamento. Com esta configuração, não há separação espectral completa do V m e SR sinais de Ca2 + (Figura 1B). Um diagrama do sistema de perfusão de circuito duplo usado para Fluo-5N corante de carga está ilustrado na Figura 1C. A Figura 1D mostra a orientação horizontal do coração no prato de perfusão. Representante V ...

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Discussão

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As chaves para o sucesso de Fluo-5N corante de carga são o pequeno volume de configuração de recirculação de perfusão, que permite uma elevada concentração de Fluo-5N sem a necessidade de grandes quantidades de corante, o período de tempo de carregamento (1 hr), e executar o carregamento à TA. Se o carregamento é realizado a temperaturas fisiológicas, actividade enzimática celular cliva rapidamente o tag -AM quando o corante atravessa a membrana da célula, prendendo as moléculas de corante no citosol e não permitindo-lh...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01 HL 111600) e pela American Heart Association (12SDG9010015).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NaClFisher ScientificS271-1Componente da solução de Tyrode
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500Componente da solução de Tyrode
KClFisher ScientificS217-500Componente da solução de Tyrode
MgCl2 (6H2O)Fisher ScientificM33-500Componente da solução de Tyrode
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500Componente da solução de Tyrode
NaHCO3Fisher ScientificS233-3Componente da solução de Tyrode
D-GlucoseFisher ScientificD16-1Componente da solução de Tyrode
95% O2 5% CO2AirGascarbogenPara oxigenação e pH da solução de Tyrode
BlebbitatinaTocris Bioscience1760Desacoplador de excitação-contração
RH237Biotium61018Corante sensível à voltagem
Fluo-5N AMInvitrogenF-26915Indicador Ca2+ de baixa afinidade; Alternativa: Invitrogen F-14204; O carregamento deve ser realizado à temperatura ambiente
Pluronic F127Biotium59004Para carregamento do indicador Ca2+; Aquecer até que a solução esteja límpida antes de utilizar
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)Sigma-AldrichD2650Para dissolver a blebistatina e os corantes
FiltrarEMD MilliporeNY110470011 μ m filtro em linha
Transdutor de PressãoWPIBLPR2Para medir a pressão de perfusão
Transbridge Transdutor AmplificadorWPISYS-TBM4MPara transdução/amplificação de sinal de pressão; O PowerLab também pode ser usado com instrumentos apropriados do BioAmp
PowerLab 26TADInstrumentsPara gravação contínua de sinais de pressão e ECG
THT MacrscopeSciMediaConfiguração óptica macroscópica. Detalhes: objetiva de 0,63X (NA = 0,31), objetiva de condensação de 2X, campo de visão resultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profundidade de foco = ~ 1,5 mm
MiCam Ultima-L CMOSSciMediaCâmeras de mapeamento óptico
de foco LED de precisãoMightexPLS-0470-030-15-SFonte de luz LED
Luz

Referências

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