Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

Resumo

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Resumo

Avanços recentes na reprogramação nos permitem transformar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A modelagem da doença usando hiPSCs específicas do paciente permite o estudo do mecanismo subjacente à patogênese, fornecendo também uma plataforma para o desenvolvimento de triagem de medicamentos in vitro e terapia gênica para melhorar as opções de tratamento. O potencial promissor dos hiPSCs para a medicina regenerativa também é evidente no número crescente de publicações (>7000) sobre iPSCs nos últimos anos. Vários tipos de células de linhagens distintas têm sido usados com sucesso para a geração de hiPSC, incluindo fibroblastos da pele, células hematopoiéticas e queratinócitos epidérmicos. Embora biópsias de pele e coleta de sangue sejam rotineiramente realizadas em muitos laboratórios como fonte de células somáticas para a geração de hiPSCs, a coleta e subsequente derivação de queratinócitos capilares são menos comumente usadas. Os queratinócitos derivados do cabelo representam uma abordagem não invasiva para obter amostras de células dos pacientes. Aqui descrevemos um método simples e não invasivo para a derivação de queratinócitos de cabelos arrancados. Também fornecemos instruções para manutenção de queratinócitos e subsequente reprogramação para gerar hiPSC livre de integração usando vetores epissómicos.

Introdução

A descoberta de humanos induzida por células estaminais pluripotentes (hiPSCs) revolucionou o campo da medicina regenerativa, proporcionando um método viável para a produção de células estaminais específicos do paciente ^1-3. hiPSCs ter sido gerado com êxito a partir de vários tipos de células somáticas, incluindo fibroblastos, células hematopoiéticas ^{4,5 6,7,} células epiteliais renais de urina ⁸ e queratinócitos ^9,10. Até à data, os fibroblastos da pele e células hematopoiéticas representam as fontes de células mais comumente utilizados para gerar iPSCs específicos do paciente. Indiscutivelmente, isso se deve ao fato de que as biópsias de pele e coleta de sangue são procedimentos médicos de rotina e grandes biobancos de sangue ou de pele amostras de pacientes foram estabelecidos em muitos países.

Em contraste com as células sanguíneas e de fibroblastos da pele que requerem métodos de extracção invasiva, queratinócitos representam um tipo de células facilmente acessíveis para a geração hiPSC. Keratinocytes são células epiteliais rico em queratina que formam a barreira epidérmica exterior da pele e são também encontrados em unhas e cabelo ^11. Em particular, os queratinócitos podem ser encontrados na bainha externa da raiz (ORS) dos folículos pilosos, uma camada celular externa que cobria o eixo do cabelo, juntamente com a bainha radicular interna (IRS), células ^(12, Figura 1). Como coleta de cabelo é um procedimento simples, que não requer a assistência de pessoal médico, ele fornece uma oportunidade para os pacientes de recolher e enviar suas próprias amostras de cabelo para laboratórios, o que facilitaria muito a recolha de amostras de doentes para a geração de hiPSC. Queratinócitos epidérmicos também têm uma maior eficiência de reprogramação e cinética de reprogramação mais rápidas em comparação com fibroblastos, a adição às vantagens da utilização de queratinócitos como as células de partida para a geração de hiPSC ^9,13. Além disso, hiPSCs também pode ser gerado usando outras populações de células dentro do folículo piloso,incluindo as células de papila dérmicas localizadas na base do folículo piloso ^14,15.

Relatórios anteriores de geração iPSC usando células derivadas de cabelo muitas vezes utilizam métodos de reprogramação retrovirais ou à base de lentivírus ^9,14,15. No entanto, estes métodos virais introduzir integração genómica indesejável de transgenes estranhos durante a reprogramação. Em comparação, a utilização de vectores epissomais representa um método viável reprogramação, não-viral para gerar iPSCs livre de integração ^4. Nós já desenvolveu um método simples, eficaz e não-viral para reprogramar eficiente queratinócitos em hiPSCs usando vetores epissomais ^13. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a geração de hiPSCs derivado de queratinócitos, incluindo a derivação de queratinócitos a partir de cabelo arrancado, de expansão e de manutenção dos queratinócitos e reprogramação subsequente para gerar hiPSCs.

Protocolo

A coleta de amostra de cabelo humano de indivíduos requer aprovação ética pelo comitê de ética em pesquisa em humanos nas instituições de acolhimento e deve ser feito em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Isolamento de queratinócitos a partir de cabelo arrancado

1. Descongelar solução Matriz Extracelular (ECM) (isto é, Matrigel) em gelo, O / N.
2. Usando pontas de pipetas pré-refrigerados, adicione 200 mL de solução de ECM 12 ml de meio DMEM / F12 refrigerados. Bata de uma placa de 12 poços com 1 ml de solução diluída de ECM para cada poço. Incubar a placa revestida O / N a 37 ° C. Lavar a placa revestida com o meio DMEM pré-aquecido / F12 antes da utilização.
3. Colete cabelo humano primário da cabeça do indivíduo, colocando os dedos perto da raiz do cabelo e arrancar o cabelo em um movimento rápido e suave. Verifique para confirmar que cada cabelo recolhido contém um folículo de cabelo intacto e determinar a fase de crescimento do cabelo under um microscópio de dissecação (Figura 1).
   1. Recolha 5-10 cabelos anágenos de cada indivíduo para extrair queratinócitos. Processo arrancado os cabelos tão rapidamente quanto possível para assegurar derivação bem sucedida de queratinócitos.
      Nota: A Figura 1 ilustra a morfologia de cabelos em diferentes fases do ciclo de crescimento. Os cabelos anágenos está em fase de crescimento, com uma camada exterior visível do epitélio em torno do comprimento do cabelo, conhecidas como as ORS. Por outro lado, o cabelo eflúvio representa cabelo na fase de repouso e não tem uma ORS visíveis, mas tem uma bola de clara de células que cobrem a raiz dos cabelos, conhecido como o bojo telógena.
4. Coloque as amostras de cabelo para uma placa de Petri contendo 10 ml de mistura de antibióticos para lavar durante 5 min à TA.
5. Usando tesouras e pinças esterilizadas, cortar para fora do eixo de cabelo excessiva, deixando um fragmento de cabelo com um folículo de cabelo intacto e em torno de 0,5-1 cm de haste capilar.
6. Cuidadosamente transfer fragmento de um cabelo em cada poço da placa revestida com ECM usando uma pinça.
7. Usando uma pipeta de 1 ml, adicionar cerca de 3 gotas de KO substituição Serum (KSR) meio (~ 100-200 uL) com as amostras de cabelo.
   Nota: Mantenha os fragmentos de cabelo em estreito contacto com a superfície da placa para permitir a fixação e posterior crescimento de queratinócitos. Adição excessiva da mídia nesta etapa pode faz com que os fragmentos de cabelo a flutuar e diminui a chance de fixação de cabelo bem sucedida.
8. Incubar as amostras de cabelo em um 37 ° C incubadora com 5% de CO ₂ e permitir que os folículos pilosos para anexar O / N. No dia seguinte, adicionar mais suavemente 3 gotas de meio KSR (~ 100-200 uL) para manter as amostras de cabelo húmido.
9. Observe as amostras de cabelo diariamente para confirmar que os folículos pilosos ter anexado com sucesso. Geralmente fixação dos folículos pilosos é evidente dentro de 1-3 dias. Pêlos grossos são geralmente mais fácil de anexar comparação com cabelos finos, como pêlos finos têm maiortendência a flutuar que retardam o processo de fixação.
   1. Uma vez que o cabelo se ligado à placa de revestimento, adicionar 500 uL de meio KSR para o poço. Tome cuidado extra ao adicionar a forma como amostras de cabelo pode não ter ligado com firmeza. A partir deste ponto, mudar de mídia a cada 2 dias.
      Nota: excrescências queratinócitos deve ser visível a partir da região do fragmento de SRO cabelo após 3-7 dias (Figura 2A-B). Permitir que os queratinócitos a crescer até 14 dias antes da passagem das células, como descrito na próxima seção.

2. Manutenção e Passaging de queratinócitos

1. Pré-revestimento de uma placa de 6 poços, utilizando o Kit de revestimento de matriz. Adicionar 680 ul de meio de diluição a partir do kit a cada poço, seguido de 6,8 ml de solução de revestimento de matriz. Agitar a placa para assegurar uma distribuição uniforme da solução de revestimento de matriz na placa.
2. Permitir que a placa revestida com a incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Removera solução de revestimento de matriz antes do plaqueamento de queratinócitos.
3. Dissociar queratinócitos numa suspensão de células individuais com 500 ul de tripsina a 0,25% por poço durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar a tripsina com 500 ul de meio contendo soro (por exemplo, de Soro Fetal Bovino (FBS) meio) e juntar-se em um tubo de 15 mL estéril. Remover o fragmento de cabelo usando fórceps esterilizados.
4. Determinar o número de células recolhidas utilizando um hemocitómetro.
5. Centrifugar as células durante 3 minutos a 200 x g. Lavam-se as células com PBS e centrifugação repetida. Aspirar o PBS e ressuspender o sedimento de células em meio fresco de queratinócitos.
6. Placa de deslocamento 4 × 10 ⁴ queratinócitos para um poço de placa revestida com ECM na presença de meio de queratinócitos. Manter os queratinócitos em uma temperatura de 37 ° C incubadora com 5% de CO ₂ (Figura 2C). Mudança de mídia a cada dia e células de passagem quando a cultura é de aproximadamente 80% confluentes, which pode demorar cerca de 2-7 dias dependendo do número de passagens e taxa de proliferação dos queratinócitos. Os queratinócitos derivados deve ser expandido para gerar stocks congelados suficientes usando métodos de criopreservação lento de congelamento padrão ^16.
   Nota: As condições de cultura descritas suporta a expansão da população homogénea de queratinócitos e com a morfologia típica de calçada (Figura 2C). Ocasionalmente, alguns queratinócitos diferenciadas, com morfologia de grande e plana e perderam potencial replicativo, pode ser observado na cultura. Caracterização de queratinócitos pode ser realizada por imunocoloração utilizando anticorpos contra citoqueratina 14, como previamente descrito ^17. Linhas celulares de queratinócitos estabelecidas devem também ser testados para micoplasma após 1-3 passagens utilizando o kit disponível comercialmente.

3. Geração de hiPSCs de Queratinócitos Usando vectores epissomais

1. Pré-revestimento de uma placa de 6 poços comGelatina a 0,1% (2 ml / poço). Permitir que a gelatina de revestimento durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente.
2. Para o experimento de reprogramação, de uso queratinócitos não mais tarde do que a passagem 6. dissociar os queratinócitos em uma única suspensão de células com 1 ml de tripsina a 0,25% por poço, durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar a tripsina com 1 ml de meio contendo soro (por exemplo, meios de FBS) e recolher num tubo de 15 ml.
3. Centrifugar as células durante 3 min a 200 xg e ressuspender as células em meio de queratinócitos. Placa 1 × 10 × 10 ⁵ -1,5 ⁵ queratinócitos por cavidade em uma placa gelatinizado O / N.
4. No dia seguinte (dia 0), verifique a placa para garantir células são 50-60% confluentes.
   Nota: Se os queratinócitos são menos de ~ 50% confluentes eles podem não crescer bem após a transfecção.
5. No Dia 0, efectuar a transfecção dos vectores epissomais de reprogramação nos queratinócitos, usando uma proporção de reagente de transfecção de 8 ul a 2? G de DNA total de plasmídeo.
   1. Tirar 0,5 ug de cada um dos quatro plasmídeos (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) e dilui-se em 100 ul de meio de soro reduzido (por exemplo, meio OPTI-MEM).
      Nota: O plasmídeo pCXLE-eGFP é usado para monitorar as eficiências de transfecção em queratinócitos e não é necessário para reprogramação.
   2. Adicionar 8 mL de reagente de transfecção de ADN diluída. Misture sacudindo o tubo. Permitir que a mistura de reacção contendo o ADN para descansar sem perturbação à temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Substituir o meio de queratinócitos com meio fresco.
   4. Adicionar cuidadosamente a mistura reaccional para a cultura de queratinócitos de ADN e incubar numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 4 horas.
      Nota: Não é recomendado para executar prolongado transfecção O / N em queratinócitos como eles apresentam baixa sobrevivência pós-transfecção.
   5. Depois de 4 horas após a transfecção, substituir o meio de queratinócitos com meio fresco.
6. No Dia 1 (1 dia de pós-transinfecção), alterar a forma de queratinócitos e verificar a eficiência de transfecção pela estimativa da percentagem de células positivas eGFP sob um microscópio fluorescente. Tipicamente> 60-70% de eficiência de transfecção é observado para queratinócitos primários usando esse protocolo.
7. No Dia 2, repetir a transfecção como descrito na etapa 3.5. Dois transfecções sucessivas seriam tipicamente atingir> 90% de eficiência de transfecção. Cultura de queratinócitos geralmente atinge confluência até ao final do segundo transfecção.
   1. Prepare uma placa de 10 cm de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) alimentador para cada reação reprogramação. Prepare alimentadores MEF mitoticamente inactivadas como descrito anteriormente ^18.
   2. Pré-revestimento de uma placa de 10 cm com 5 ml de gelatina a 0,1% durante pelo menos 20 min. Placa 4 × 10 ⁶ MEF mitotically inativado por placa de 10 cm em meio FBS. Permitir que as células assentar e unir O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora com 5% de CO _2.
8. No Dia 3, harcolete os queratinócitos com 0,25% de tripsina, tal como descrito no passo 3.2 e 3.3. Ressuspender as queratinócitos em meio KSR e placa 90% de queratinócitos a partir de um poço de uma placa de 6 poços num prato de 10 centímetros MEF alimentador com meio KSR.
9. A partir do dia 4 em diante, mudar o meio KSR todos os dias.
   1. Alternativamente após o Dia 18, substituir o meio de cultura a cada segundo dia.
      Nota: os queratinócitos não-reprogramado deixará de proliferar, enquanto colônias hiPSC com limite definido que se assemelham a células estaminais embrionárias humanas (hESCs) vão surgir a partir do dia 14-21.
10. Isolar colônias hiPSC por dissecção manual a partir do dia 21 em diante. Evite colônias hiPSC que estão intimamente agrupadas e apenas escolher colônias hiPSC que estão claramente separados dos outros.
    Nota: colônias hiPSC pode ser pego mais cedo, mas a colônia com limites definidos pode não ser óbvio em momentos anteriores, dada a dimensão pequena colônia. Eficiências de reprogramação podem variar entre different queratinócitos do paciente, e também é influenciado por outros factores, tais como o número de passagens ou a taxa de proliferação de queratinócitos.
    1. Para dissecção manual das colônias hiPSC, use uma agulha de 26G para cortar colônias hiPSC sob um microscópio de dissecação. Cortar uma colónia hiPSC em pequenos pedaços ao redor de 300-600 uM de comprimento. Transferir os pedaços de uma colônia hiPSC em um novo alimentador de placas MEF (2,5 × 10 ⁴ MEF / cm ²⁾ para estabelecer uma linha clonal de hiPSCs. Inicialmente, a cultura de cada linha clonal hiPSC em um poço de uma placa de 12 poços ou de cultura de órgãos pratos, em seguida, expanda a 6 formato de placa bem.
    2. Manter linhas clonais estabelecidos de hiPSCs em meio KSR sobre alimentadores MEF. Uma vez que a cultura atingir 70 - 80% de confluência com colónias hiPSC ~ 1,5 milímetros de diâmetro, hiPSCs passagem utilizando métodos padrão enzimáticas Passaging (Accutase, dispase ou colagenase IV) de acordo com as instruções do fabricante.
11. Caracterizar linha hiPSC estabelecidos para confirmar pluripotência e sua capacidade de se diferenciar em células representativas das três camadas germinativas, in vitro e / ou in vivo ^13,19. Além disso, linhas hiPSC Testar rotineiramente estabelecidos para micoplasma usando kits disponíveis comercialmente para garantir que eles são livres do patógeno. Rotineiramente monitorar estabilidade genômica de linhas hiPSC por cariótipo ou análise baseada em array variação do número de cópias (CNV).

Resultados

O cabelo passa por três fases diferentes do ciclo de crescimento: anágena (fase de crescimento), catágena (fase de regressão) e telógena (na fase de repouso) ^20,21. O folículo piloso anágena contém várias camadas de epitélio; essas camadas incluem os ORS, IRS e do eixo do cabelo (Figura 1). Cabelos anágenos eventualmente sofre a transição para a fase catágena, que é marcado por apoptose das ORS e rescisão de diferenciação eixo do cabelo. Finalmente, a transição de cabelo catagen à fase telóge...

Discussão

Geração de hiPSCs específicos do paciente oferece uma abordagem única para estudar patogênese nos tipos de células doentes in vitro, e também fornece uma plataforma para a triagem de drogas para identificar novas moléculas que podem resgatar os fenótipos da doença. Esta abordagem de modelagem doença usando hiPSCs tem produzido resultados promissores para uma variedade de doenças, incluindo a síndrome de QT longo, doença de Huntington, doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica ^22. Várias ini...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mistura de antibióticos:
250 ng/ml Anfotericina B Antimicótica B	Sigma	A2942-20ml	A mistura de antibióticos é composta em PBS.
1X Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) médio:			O meio KSR é filtrado usando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes do uso. O bFGF é adicionado fresco ao meio antes do uso.
Reposição de soro knockout de 20% (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 com glutamax	Invitrogen	10565-042
1× Aminoácido não essencial MEM	Invitrogen	11140-050
0,5 vezes; Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
0,1 mM de β-mercaptoetanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, adicionado fresco)	Millipore	GF003
:
EpiLife com 60  µ M Cálcio	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1× Suplemento de crescimento de queratinócitos humanos (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:			O meio FBS é filtrado usando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes do uso.
10% de soro fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamina	Invitrogen	25030
0.25% tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056
Matriz Extracelular (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Estoque e loja da Aliquota Matrigel em -80° C seguinte fabricante» s instruções. A concentração de estoque de Matrigel varia ligeiramente de lote para lote (~ 9mg / ml). Recomendamos o uso de 200µ l matrigel para revestir uma placa de 12 poços (~150µ g/poço).
Kit de Matriz de Revestimento	Plasmídeos Invitrogen	R-011-K
:			Observe que o pCXLE-eGFP é usado apenas para monitorar a eficiência da transfecção e não é necessário para reprogramação.
-                  pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgene	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Reagente de transfecção Fugene HD	Promega	E231B
Gelatina (de pele suína)	Sigma	G1890	Compõem 0,1% de gelatina em água destilada. Autoclave antes do uso.
Meio sérico reduzido: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
O alimentador			MEF) MEF pode ser inativado pelo tratamento com mitomicina C ou irradiação, conforme descrito anteriormente 16.
Agulha 26G	Terumo	NN2613R
placa de 6 poços (tratada para cultura de tecidos)	BD Biosciences	353046
placa de 12 poços (tratada para cultura de tecidos)	BD Biosciences	353043 placa de
10 cm (tratada para cultura de tecidos)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Use a 10 mg/ml
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Use a 1 mg/ml
de anticorpo TRA-160	Millipore	MAB4360	Use a 5 µ g/ml
OCT4 anticorpo	Santa Cruz	SC-5279	Uso em 5 µ g/ml
anticorpo NANOG	R& D Systems	AF1997	Use em 10 µ g/ml
Kit de detecção MycoAlert	Lonza	LT07-418