Descrevemos como entregar proteínas e pequenas moléculas impermeáveis a células em células de mamíferos cultivadas por um protocolo simples de co-incubação com um reagente que faz com que as organelas endocíticas se tornem vazantes.
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Artigo de método
Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estratégias de entrega macromoleculares tipicamente utilizar a via endocítica como uma via de entrada celular. No entanto, endossomal aprisionamento limita severamente a eficiência com a qual macromoléculas penetrar no espaço citosólico de células. Recentemente, nós contornado este problema ao identificar o reagente dfTAT, um dímero de ligações dissulfureto da TAT péptido marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Geramos um dímero marcado por fluorescência do péptido TAT prototípico de penetração celular (CPP), dfTAT, que penetra as células vivas e atinge o espaço citosólico de células em particular com uma alta eficiência. Entrega citosólica de dfTAT é conseguida em várias linhas de células, incluindo células primárias. Além disso, a entrega não tem impacto sobre a viabilidade das células visivelmente, a proliferação ou a expressão do gene. dfTAT pode entregar pequenas moléculas, péptidos, anticorpos, enzimas biologicamente activas e um factor de transcrição. Neste relatório, nós descrevemos os protocolos envolvidos na dfTAT síntese e administração celular. O manuscrito descreve como controlar a quantidade da proteína entregue ao espaço citosólico de células, variando a quantidade de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, são discutidas as atuais limitações desta nova tecnologia e etapas envolvidas na validação de entrega. Os protocolos descritos devem ser extremamente útil para ensaios baseados em células bem como para a manipulação ex vivo e reprogramação das células.
Introdução
A administração de proteínas, péptidos ou pequenas moléculas celulares impermeável em células vivas é muitas vezes desejável em muitas aplicações biológicas ou biotecnológicos (imagiologia celular, ensaios funcionais, de reprogramação celular, etc.) 1-4. Muitas abordagens de entrega já foram relatados, incluindo microinjecção, electroporação, ou a utilização de agentes veiculares (por exemplo., Péptidos de penetração de células, tais como tat, lípidos) 5-7. Cada técnica tipicamente tem prós e contras específicos que podem fazer essas abordagens adequadas para certas aplicações, mas não para outros. Problemas comuns envolvem a e....
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Protocolo
1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntese
Nota: dfTAT é produzida em duas etapas: a síntese do monómero fTAT por síntese de péptidos em fase sólida, seguido por dimerização de dissulfureto para formar dfTAT ligação.
- Ondas 500 mg de resina MBHA-Amida Rink em dimetilformamida (DMF) em 50 ml de uma embarcação SPPS padrão durante 1 h.
- Realizar Fmoc desprotecção através da incubação da resina protegido com Fmoc numa solução de piperidina a 20% (20% de piperidina em DMF, 10 ml (0,30 mmol). Levar a cabo passos de desprotecção duas vezes (1 x 5 minutos e 1 x 15 min), com um passo de lavagem utilizando DMF (o passo de lavagem incl....
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Resultados
Para avaliar a diferença entre fTAT e dfTAT, células HeLa são incubadas durante 1 hora com cada um dos péptidos para determinar a diferença na sua localização celular. A internalização dos dois CPP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência. A Figura 2 mostra que fTAT (20 uM) localiza em uma distribuição pontuada. Esta distribuição é consistente com o restante péptido retido no interior de endossomas. Em contraste, o sinal de fluorescência de dfTAT (5 uM) exibe uma distribuição homogénea em t.......
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Discussão
As células utilizadas para entrega dfTAT não deve ser excessivamente confluente (> 90% de confluência) pois isso pode afetar a eficiência de entrega. As células devem também ser saudável: células mortas na cultura podem libertar fragmentos apoptóticos com as quais pode interagir dfTAT (por exemplo, ADN de núcleos degradados). Este por sua vez, pode interferir com a eficiência de entrega e a qualidade de imagem. As células devem ser lavadas cuidadosamente para remover FBS antes de adicionar dfTAT. BSA present.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este artigo foi apoiado pelo Prêmio Número R01GM087227 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, do Programa de Pesquisa Avançada Norman Ackerman e da Fundação Robert A. Welch (Grant A-1769).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Heparina | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cisteína | Hyclone | Pedido especial | |
| Aminoácidos protegidos por Fmoc | Novabiochem | ||
| dfTAT | As amostras serão fornecidas mediante solicitação (contato: pellois@tamu.edu) | ||
| Biossegurança | |||
| Microscópio de epifluorescência invertida | Olympus | modelo IXB1 | equipado com um estágio de aquecimento mantido em 37 ° C e com uma câmera Rolera-MGI Plus retroiluminada com dispositivo de multiplicação de elétrons acoplado (EMCCD) (Qimaging). |
| 37 &graus; C umidificado, 5% CO2 incubadora | |||
| Sintetizador de peptídeos ou vaso para pré-formar a síntese |
Referências
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Del....
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Reimpressões e permissões
