A pesquisa translacional do câncer depende da extração de tecidos humanos. Muito trabalho foi feito para otimizar os métodos de extração para análise ex vivo. Aqui, descrevemos os métodos de processamento de tecidos que permitem a saída máxima de dados de amostras limitadas.
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Artigo de método
Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa médica para benefício humano é muito prejudicada pela necessidade de tecidos e sujeitos humanos. No entanto, ao obter o consentimento para amostras humanas, amostras preciosas devem ser manuseadas com o maior cuidado, a fim de garantir a integridade dos órgãos, tecidos e células ao mais alto grau. Infelizmente, o processamento de tecidos, por definição, requer a extração de tecidos do hospedeiro, uma mudança que pode causar grande estresse celular e ter grandes repercussões nas análises subsequentes. Essas tensões podem fazer com que a amostra não seja mais representativa do local de onde foi recuperada. Portanto, um protocolo rigoroso deve ser respeitado durante o processamento dessas amostras para garantir a representatividade. O(s) ensaio(s) desejado(s) também deve(m) ser considerado(s) para garantir que uma técnica ideal seja usada para o processamento da amostra. Aqui está descrito um protocolo para recuperação, processamento e várias análises de tecidos que podem ser realizados em tecidos processados, a fim de maximizar a produção a jusante a partir de amostras limitadas de tecidos.
Introdução
A investigação médica tem beneficiado imensamente com o estudo de ambas as linhas de células humanas e modelos animais. As linhas celulares que permitam um melhor controlo dos componentes de um sistema, bem como a utilização de células a partir do próprio organismo. Trabalhando com células humanas, enquanto mais representativo, apresenta um instantâneo simplificado drasticamente de mecanismos que podem ser responsáveis pela saúde e doença, porque as linhas celulares podem não recapitular o impacto de outras células do estroma, componentes e órgãos que podem afectar as respostas 1. Por outro lado, os modelos animais, embora não totalmente precisos em reproduzir a doença humana e heterogeneidade genética, oferecem mais pistas, permitindo a entrada de sistemas de animais completos, na maioria dos modelos de 2,3.
Deficiências à parte, ambos os métodos têm suas vantagens e são complementares. No entanto, o principal objectivo continua a estudar células humanas e de órgãos, em uma de corpo inteiro, sistema de múltiplos órgãos. Assim, a investigação translacional tem taken grandes passos no sentido de facilitar o estudo de órgãos e tecidos humanos extraídos de pacientes, a fim de compreender melhor os mecanismos da doença subjacente. Investigação translacional oferece a vantagem de se estudar o resultado de tratamentos de doenças e em todo o corpo e em células apropriadas, assim fornecendo o melhor dos dois mundos entre células e animais de trabalho 4.
Investigação translacional também não é sem falhas. Amostras colhidas de pacientes humanos, após a remoção do hospedeiro, são imediatamente submetidos a isquemia e outros fatores externos a partir do qual eles seriam de outra forma protegidas. Isso pode resultar em alterações moleculares e genéticas induzidas pelo estresse, e causar viés nos estudos subsequentes. Portanto, muito esforço foi colocado em extração e processamento de tecidos através de métodos rigorosos para melhor preservar a integridade de órgãos e células para estudos jusante 5. É importante ressaltar que futuras aplicações devem ser consideradas estreitamente ao selecionar métodos ouf processamento de amostras humanas, como certos métodos podem ser prejudiciais aos componentes celulares e vias de sinalização enquanto poupam outros.
Para qualquer pesquisa envolvendo tecidos humanos, questões regulatórias devem ser abordadas. Após os relatórios de Tuskegee e Belmont, houve uma crescente aceitação do fato de que a investigação biomédica foi associada com riscos inerentes, muitas vezes resultando em dilemas éticos inevitáveis 6. A necessidade de normas nacionais e foi reconhecido o governo federal criou Conselhos de Revisão Institucional (IRBs) como um meio para defender os princípios do Relatório Belmont (respeito pelas pessoas, beneficência e justiça).
IRB Qualquer instituição é uma comissão de médicos, pesquisadores e membros da comunidade que são responsáveis por proteger os participantes da pesquisa. Ela exige que o consentimento voluntário ser obtido de todos os participantes de estudos de investigação biomédica, e que este consentimento ser documentados em um consentimento informado fo rm. O processo de consentimento informado tem como objetivo fornecer informações adequadas a um participante, para que uma decisão informada pode ser feita sobre se deve ou não se inscrever em um estudo, ou para continuar a participação. A este respeito, o documento de consentimento informado devem ter boa legibilidade e deve ser escrito em uma linguagem que pode ser facilmente compreendida (6 a 8 de leitura nível) pela população-alvo. A possibilidade de coerção ou influência indevida deve ser minimizado, eo assunto deve ser dado tempo suficiente para considerar a participação. O participante também devem ser autorizados a exercer o seu direito de retirar seu consentimento em qualquer estágio durante o curso do estudo sem penalidade. Consentimento voluntário é um pré-requisito obrigatório para a participação de um sujeito na pesquisa e é também juridicamente eficaz 7.
De acordo com os regulamentos para a protecção da saúde humana sujeita 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), os participantes do estudo devem ser informados do propósito da pesquisa, os procedimentos envolvidos na pesquisa, alternativas à participação, todos os riscos previsíveis e desconfortos (incluindo não só danos físicos mas também possível dano psicológico, social ou econômica, desconforto ou inconveniente), benefícios da investigação para a sociedade e, possivelmente, para o indivíduo, tempo em que o sujeito é esperado para participar, pessoa a contactar para respostas a perguntas ou em caso de lesão ou de emergência relacionadas com a investigação, declaração indicando que a participação é voluntária e que a recusa em participar não acarretará quaisquer consequências ou qualquer perda de benefícios, como um compromisso no atendimento clínico normal que o participante tenha direito a receber como resultado de suas / seus diagnósticos e, finalmente, uma declaração sobre o direito do sujeito a confidencialidade e direito de retirar-o estudo em qualquer altura sem quaisquer consequências. Os espécimes de tecido a partir de participantes que retirar o consentimento durante o curso do estudo não deve ser depositado imediatamente e deve ser esgotado. Renúncia de um ou mais elementos do consentimento informado pode ser obtido a partir do IRB para alguns projetos de pesquisa que não poderia ser feito praticamente sem uma alteração dos elementos exigidos ou para estudos onde os elementos necessários não são aplicáveis. Deve ser tomado muito cuidado para assegurar a confidencialidade dos dados. O Seguro de Saúde Portabilidade e Accountability Act (HIPAA) é uma lei federal que impede o uso ou divulgação de "informações médicas protegidas" (PHI) sem o consentimento por escrito dos participantes. PHI inclui, mas não está limitado a informação transmitida a saúde ou mantida em qualquer forma ou meio e inclui campos que podem ser utilizados para identificar um indivíduo 9.
Através deste trabalho, pretendemos delinear o protocolo que deve ser seguido durante tissue processamento - incluindo aquisições e armazenamento e enfatizar a importância de seguir essas diretrizes rígidas, de modo a minimizar os vieses que podem resultar devido às tensões de um tecido é submetido a extração em cima. Também nos esforçamos para fornecer um breve resumo dos ensaios a jusante ou análise (Figura 1) que podem ser executadas em tais espécimes para que os leitores podem fazer um julgamento qualificado sobre o ensaio (s) melhor se adapte às suas necessidades.
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Protocolo
Declaração de ética: Este protocolo é aprovado pela University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Espécime Procurement
- Coletar amostras de tecido de tumor pesquisa excesso e tecido normal relacionada 10-12. Conservar as amostras em gelo triturado, para evitar autólise.
- Enviar todos os tecidos, dispositivos médicos e corpos estranhos removidas durante um procedimento cirúrgico para o Departamento de Patologia para exame necessário, a fim de facilitar um diagnóstico patológico.
- Lidar com tecido alocados para a pesquisa de acordo com a investigação e as políticas aplicáveis e os procedimentos bancários tecido.
NOTA: coleção Biospecimen envolve a coordenação dos patologistas, patologistas 'assistentes, histotechnologists e especialistas de recolha de tecidos.
2. Patologia Quality Assurance (QA)
- Completar e verificar os registros do paciente como uma medida precoce QA e consultar um patologista para avaliar pa diagnósticotient registros (relatórios de patologia, slides de tecidos, etc.) e amostras de tecidos. Amostras de tecido juiz sobre características morfológicas de interesse, como porcentagem do tumor, necrose, a interface tecido-tumor, etc. Isto está de acordo com as melhores práticas biorrepositório 10-12.
- Após a revisão inicial, realizar revisões periódicas dos dados biorrepositório e amostras de investigação durante toda a duração da estadia dos biospecimen.
- Resultados de links e anotações de investigações histopatológicos e outros para as amostras e fornecer esses dados para os pesquisadores por meio de um sistema de software biorrepositório proprietário.
NOTA: processos de QA garantir a integridade de ambos os aspectos clínicos e técnicos das operações biorrepositório. - Realizar testes genéticos e moleculares para verificar e caracterizar as amostras para uso clínico.
- Coletar e analisar os dados com base no feedback dos pesquisadores que têm vindo a utilizar as amostras de experimentos de laboratório. Pistaamostras que utilizam a tecnologia de código de barras. Esse sistema de rastreamento eletrônico também é defendida nas melhores práticas biorespository 10-12.
3. Espécime / processamento de tecidos
- Sempre armazenar amostras de tecido fresco em gelo húmido e processo tão rapidamente quanto possível, de modo a limitar as mudanças induzidas pela extracção da amostra de tecido a partir do seu ambiente natural. Processo normal tumor-combinado e amostras de tecido tumoral separadamente para evitar a contaminação cruzada.
NOTA: Com base em protocolos de pesquisa, o processamento pode envolver biospecimen recolha das amostras em um ou mais tipos de meios de comunicação. - Antes de iniciar o processo, preparar um prato de cultura estéril de Petri, um bisturi, bem como uma agulha ou uma pinça para processamento de tecidos. Certifique-se de que os tubos foram preparadas, etiquetado, e colocado para fora, a fim de limitar o tempo de processamento da amostra (Figura 2).
- Todas as informações tecido relevante, tais como nome do paciente, número, o tratamento, a data decirurgia, e outras informações relevantes que possam ser apropriadas para o estudo, devem ser feitas facilmente acessíveis em um banco de dados tecido institucional. A informação limitada paciente deve ser realizada no laboratório em papel ou em formato de planilha.
NOTA:. Só coletar informações biospecimen relevantes para a natureza do viz pesquisa, pesquisa biomédica básica, pesquisa clínica, investigação de translação, etc. Para obter informações específicas da doença, a equipe biorrepositório deve coletar dados considerados necessários pela literatura atual e organizações que regem a garantir o diagnóstico adequado e de investigação significativa. Isto inclui, mas não está limitado a tipos de tumores e cancro preparo informações. - Plano de todas as experiências subsequentes desejados antecipadamente, para decidir sobre o tamanho de secções de tecido necessárias para cada tipo de análise, assim como a localização de excisões. Idealmente, embora impossível, todas as análises devem ser representativas da secção de tecido inteiro, a fim de explicar heterogenei tecidoty e limite viés de análises a jusante. Coloque todos os itens necessários para fora em avanço como representado na Figura 2.
- Coloque a amostra de tecido em campo aberto Petri prato de cultura, plana contra a superfície.
NOTA: Permitir somente o pessoal autorizado da biorrepositório para lidar com amostras identificadas e para revisar os dados de saúde identificados. Os investigadores devem acessar somente os identificadores de doentes, como permitido pelo consentimentos e na forma regulamentada pelo IRB. Todas as amostras devem ser adequadamente rotuladas e devem incluir, no mínimo, um número de identificação de tecidos e tecido tipo único. Não incluem qualquer PHI nos rótulos, de acordo com as regulamentações HIPAA. - Inspecione a amostra de todos os ângulos, para obter uma melhor compreensão da sua estrutura e dimensões. Pin a amostra para o fundo do prato com a agulha, e vá para a linha de divisão do tecido ao longo do seu eixo maior e mais representativo.
- Corte um pequeno pedaço de tecido e colocá-lo em um estéril 1,5 ml microcentrifuge tubo contendo 1 ml de solução de estabilização de ARN. Esta amostra pode ser colocada em gelo durante o restante do processo e armazenadas a 4 ° C até ser necessário.
NOTA: Ao trabalhar com ARN, as luvas devem ser sempre usadas e pontas de filtro sem RNase devem ser usadas para limitar as possibilidades de degradação e contaminação ARN. - Lay out de uma cassete de biópsia aberta e pré-rotulados na tampa da caixa de Petri de cultura. Corte um pedaço de tecido com a espessura de 3 a 5 mm e transferi-lo para a cassete. Coloque a gaveta em 10% de formalina tamponada neutra (NBF) para um mínimo de 72 hr. Transfira a cassete em etanol 70% para armazenamento a longo prazo antes de parafina-incorporação.
NOTA: Rotulagem de cassetes devem ser realizados a lápis ou com marcadores recomendado como uso de xileno durante o processamento, caso contrário, apagar etiquetas. - Corte um pedaço de tecido e colocá-lo em um molde de tecido. Cubra a secção de tecido em temperatura de corte ideal (OCT) composto, e congelá-lo imediatamentea -20 ° C durante cryosectioning. Esta secção de tecido pode ser armazenado a -20 ° C até estar pronto para cryosectioning.
- Cortar uma ou várias peças de tecido e transferi-los para um tubo de 50 ml contendo tampão de MACS (1x tampão fosfato salino (PBS), 0,5% de soro fetal de bovino (FBS), 2 ácido etilenodiaminotetracético mM (EDTA)) para o fluxo de posterior análise de citometria . Para a citometria de fluxo, amostras maiores pode ser preferível que as células podem ser perdidos durante a dissociação tumor, fixação e permeabilização celular quando necessário. Geralmente, esta seção pode ser tomada no final, uma vez que todas as outras peças foram processadas. Sobra amostra representativa do tumor podem ser utilizados para citometria de fluxo. Opcionalmente, este tubo pode ser armazenado a 4 ° CO / N ou utilizado para a coloração de citometria de fluxo, imediatamente após a digestão numa suspensão de células (ver Passo 4 - Coloração de citometria de fluxo).
- Cortar o tecido restante em pedaços não maiores do que um tamanho máximo de 0,5 mm x 0,5 mm e transferi-los para criogénicofrascos para congelação imediata em nitrogênio líquido. Estas amostras de snap congelado pode ser utilizado para análises futuras e para fins de colaboração.
NOTA: cuidados extras devem ser tomados quando se trabalha com nitrogênio líquido como contato direto pode causar ferimentos graves. Olhos devem ser protegidos com óculos de segurança com proteção lateral ou com uma viseira. Luvas criogênicas também deve ser usado para proteger contra queimaduras causadas por nitrogênio líquido salpicos e contacto directo. As luvas devem se encaixar corretamente, mas estar solto o suficiente para ser removido rapidamente devem nitrogênio líquido respingo neles.
4. Citometria de Fluxo Coloração
- A homogeneização de tecidos
- Preparar o meio de digestão com DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) e a colagenase I (2 mg / mL). Coloque tumor fresco ou O / N-armazenado em tampão MACS na tampa de uma placa de Petri, e submergir com meio de digestão.
NOTA:. Existem métodos de digestão diferentes, cada um com vantagens (isto é, proteína da superfície celular expression, viabilidade). Verifique se você tem o método adequado para a sua aplicação a jusante desejar. - Pin do tumor para o fundo do prato com uma agulha, e o corte a partir do exterior para o centro, com um bisturi, até que o tumor tem uma textura semelhante a pasta. Transferir mix tumor a um tubo de 50 ml, selo e coloque em um saco plástico para evitar vazamentos. Tubo de transferência para uma incubadora, e rodar a 225 rpm, 37 ° C, 1 h.
- Filtro de suspensão de células tumorais através de um filtro de células 70μm. Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg, 4 ° C, 5 min. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de tampão de FACS (500 ml de PBS, 1 ml de 0,5 M de EDTA, estoque de 10 ml de FCS ou FBS).
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e re-suspensão numa concentração de 1x10 7 células / ml. Transferir 100 ul por cavidade (10 6 células) em uma placa de fundo redondo de 96 bem para a coloração.
- Preparar o meio de digestão com DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) e a colagenase I (2 mg / mL). Coloque tumor fresco ou O / N-armazenado em tampão MACS na tampa de uma placa de Petri, e submergir com meio de digestão.
- Viabilidade e Coloração de anticorpos
- Adicionar 200 uL de solução de viabilidade mancha a cada poço e mistura-se. IncuBATE durante 30 minutos, a 4 ° C, no escuro. Spin down células a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirar o sobrenadante.
- Adicionar mistura de anticorpos no recomendado / concentração titulado (como por fabricante) para antigénios de superfície em 200 ul de tampão de FACS. Incube as células a 4 ° C, 30 min, no escuro. Spin down células a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirar o sobrenadante.
- Lava-se com 200 ul de tampão de FACS, as células de girar a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e o sobrenadante aspirado. Ressuspender as células em 200 ul de tampão de FACS e prossiga para a citometria de fluxo para a aquisição e análise.
NOTA: Se executar citometria de fluxo coloração intracelular, execute fixação e permeabilização passos e coloração intracelular entre os passos 4.2.2 e 4.2.3. Se se realizarem coloração de citocinas, as células devem ser pré-activada de coloração anterior, tal como recomendado, e um inibidor de transporte de proteína intracelular e secreção de tais como monensina deve ser utilizado durante a activaçãoassegurar a retenção de factores solúveis. As células fixadas podem ser armazenadas a curto prazo (uma semana) a 4 ° C no escuro antes da aquisição de um citómetro de fluxo.
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Resultados
Os resultados apresentados abaixo mostram o fluxo de estratégia de citometria de gating para ampla fenotipagem imune em um tumor melanoma processado. O dia da coloração, amostra de tecido foi digerido com colagenase e homogeneizada I e ADNase I de incubação durante 60 min, a 37 ° C sob rotação 225 rpm. Após a digestão, a suspensão de células foi filtrada através de um filtro de células de 70 um para eliminar os detritos e as células foram coradas com fluxo marcado com fluorescência citometria de anticorpos para fe...
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Discussão
Em última análise, os métodos de processamento deve ser ditada pela hipótese desejado e antecipado ensaios técnicos para ser executada (Figura 1). A secção que se segue serve como uma visão geral para descrever os ensaios potenciais que podem ser executadas em tais secções de tecido. É de nenhuma maneira uma visão geral exaustiva, mas destina-se a ajudar a orientar os métodos de processamento de amostras e escolha de ensaios a jusante, descrevendo técnicas e listando seus pontos fortes e fracos.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelas contribuições filantrópicas da John G. e Maria Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) ea Research Alliance Melanoma. Os autores gostariam de agradecer à Universidade de Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institucional Bank (ITB) para coordenar a distribuição de tecidos e recolha e facilitar a investigação translacional, bem como Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, o Departamento de MD Anderson Cancer Center Patologia e do Programa de Melanoma do chute Lua. Por fim, os autores gostariam de agradecer todos os pacientes e famílias afetadas por melanoma.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agulhas | BD | 305167 | |
| Bisturis descartáveis de aço inoxidável | Miltex | 4-410 | |
| Placa de cultura de tecidos | de biópsia Corning 353003 | ||
| Thermo Fisher | 58931 | ||
| Solução estabilizadora de RNA | Ambion | AM7021 | |
| 1,5 ml Eppendorf tubos | Phenix | MAX-815 | |
| Tubos de 50 ml | Corning | 430290 | |
| 10% Neutro Tamponado Formalina | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Recipientes de Formalina | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Solução de temperatura de corte ideal (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I Roche | 11088793001 | ||
| 70μ filtros de células m | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 placas de fundo redondas de 96 poços | Corning | 3799 | |
| Solução de coloração viva/morta | Life Technologies | L34957 |
Referências
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Reimpressões e permissões
