Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

Resumo

O objetivo deste vídeo é para demonstrar como executar extração de DNA automatizado a partir de linhas fixas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de referência padrão de células e de gotículas digital de análise de PCR (ddPCR) para detectar mutações raras em um ambiente clínico. Detecção de mutações em amostras de FFPE demonstra a utilidade clínica de ddPCR em amostras FFPE.

Resumo

ddPCR é um método de PCR altamente sensível que utiliza um sistema de emulsão água-óleo. Usando um gerador de gotículas, uma amostra de ácido nucleico extraída é particionada em ~ 20.000 gotículas de água em óleo de tamanho nanométrico, e a amplificação de PCR ocorre em gotículas individuais. A abordagem ddPCR está na identificação de mutações de sequência, alterações no número de cópias e rearranjos estruturais selecionados envolvendo genes-alvo. Aqui, demonstramos o uso de ddPCR como uma técnica poderosa para quantificar com precisão mutações raras de BRAF V600E em linhagens celulares padrão de referência FFPE, o que é útil na identificação de indivíduos com câncer. Em conclusão, a técnica de ddPCR oferece o potencial de traçar com precisão o perfil das mutações raras específicas em diferentes genes em vários tipos de amostras FFPE.

Introdução

A acumulação de mutações genéticas nos genes reguladores chave altera a programação de células normais como a proliferação celular, diferenciação, sobrevivência e, levando a ^um cancro. A via RAS-RAF-cinase de MAP-medeia as respostas celulares a sinais de crescimento. Mutações BRAF oncogênico pode resultar de mutações driver no gene BRAF, que podem causar o BRAF oncoprotein para tornar-se hiperativa ^2. As mutações no gene BRAF também resultar na sinalização a jusante através hiperactiva MEK e ERK ^3, que, por sua vez, conduz ao crescimento celular e proliferação excessiva de forma independente do crescimento mediada pe....

Protocolo

1. Extração de DNA de linhas celulares FFPE Referência Padrão

Nota: Para este procedimento, a extracção do ADN foi realizada a partir de linhas celulares padrão de referência (FFPE HD598, HD593, HD617, HD273 e de tipo selvagem (WT)) usando o kit de isolamento de DNA de tecidos FFPE como descrito no protocolo abaixo. Extracção automática do DNA foi conseguida seguindo as instruções do fabricante para o isolamento de DNA total.

1. Usando um micrótomo eo bloco FFPE original, preparar manualmente seções frescas antes da extração de DNA e análise, de acordo com os procedimentos estabelecidos. Assegurar que a amostra de entrada para a s....

Resultados

Pela nossa análise ddPCR, estudamos as linhas de células-padrão de referência mutação BRAF V600E FFPE. O leitor gota se conecta a um laptop software de análise de dados do computador de corrida. Cada gotícula individual é definido com base na amplitude fluorescente como sendo positivos ou negativos. O software fornecido pelo fabricante também permite um corte definido pelo usuário para ser inscrito para definir o limite entre as gotículas positivos e negativos. O número de gotículas de positivos e negativos em .......

Discussão

Aqui, destaca-se a aplicabilidade do ddPCR e isolamento de DNA a partir de amostras de linhas celulares FFPE padrão de referência para uma avaliação específica mutação genética. Neste estudo, a TPS método de isolamento de DNA automatizado é utilizado, que pode ser facilmente adaptado, automatizada, e pode acomodar até 48 amostras diferentes simultaneamente, permitindo experiências escala maior e menor variabilidade. Uma das limitações do isolamento de ADN no presente trabalho é que todas as amostras FFPE é único, e irá .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento Hamilton MICROLAB STARlet IVD	Siemens	10701001	Automated DNA Isolation
instrument QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	772BR1119
QX200	Bio-Rad	771BR1497
capaz de ajuste		621BR17718
Seladora de placas PCR PX1	Bio-Rad	770BR1575
Software QuantaSoft	de isolamento de DNA Bio-Rad
Caixa de Reagentes de Preparação de Tecidos VERSANT 1	Caixa de	de Preparação de
VERSANT 1	Pontas Siemens	10632399
CO-RE	Análise
	Bio-Rad	Cartucho de concentração DG8 BR186-3010	2X
	Bio-Rad	BR186-4008
	Bio-Rad	BR-186-3005
Junta	Bio-Rad	BR186-3006
Óleo de leitor de gotículas	Bio-Rad	BR-186-3004

Leitor de gotículas Máquina de PCR convencional de tempo de rampa Kit Reagentes Tecidos Siemens 10632398 de mutação DDPCR da Siemens Óleo gerador de gotículas