A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Summary

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Abstract

As espinhas dendríticas são pequenas saliências que correspondem aos compartimentos pós-sinápticas das sinapses excitatórias no sistema nervoso central. Eles estão distribuídos ao longo dos dendritos. A sua morfologia é em grande parte dependente da actividade neuronal, e eles são dinâmicos. Espinhas dendríticas expressam receptores glutamatérgicos (receptores AMPA e NMDA) em sua superfície e nos níveis de densidade pós-sináptica. Cada coluna permite que o neurônio para controlar sua atividade estatal e local de forma independente. Spine morfologias têm sido extensivamente estudadas em células piramidais glutamatérgicos do córtex cerebral, usando ambas as abordagens in vivo e culturas neuronais obtidos a partir de tecidos de roedores. Condições neuropatológicas podem ser associados à indução da coluna alterada e maturação, como mostrado em roedores neurónios em cultura e análise quantitativa unidimensional ^1. O presente estudo descreve um protocolo para a análise quantitativa 3D de morfologias coluna usando cortic humanoneurônios al derivadas de células estaminais neurais (progenitoras corticais final). Estas células foram inicialmente obtida a partir de células estaminais pluripotentes induzidas. Este protocolo permite a análise da morfologia da coluna vertebral em diferentes períodos de cultura, e com a possibilidade de comparação entre as células-tronco pluripotentes induzidas obtidas de indivíduos controle com aqueles obtidos de pacientes com doenças psiquiátricas.

Introduction

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais corticais são pequenas e finas saliências que são distribuídos ao longo das dendrites basais e apicais de esses subtipos neuronais em roedores, primatas e cérebro humano. Eles são os sites da maioria das sinapses excitatórias e exibir funções-chave na aprendizagem e processos cognitivos. As estruturas detalhadas de espinhas dendríticas humanas foram tecnicamente estudada por microscopia eletrônica de ^2. No entanto, tal abordagem é demorado e representa a carga de trabalho pesado. Mais recentemente, um (3D) reconstrução tridimensional da morfologia das espinhas dendriticas foi reportado no córtex do cérebro humano utilizando um software específico combinados para análise grande coluna Manual ^3.

A tecnologia verde proteína fluorescente (GFP) acoplado a imunofluorescência representa uma ferramenta precisa para a identificação e medição espinha forma por microscopia de fluorescência. Esta abordagem pode ser facilmente aplicado a culturas de neurónios. However, há dados foram relatados na análise de maturação coluna e morfologia em neurônios humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC).

O objetivo deste estudo foi descrever um protocolo, que permite imagens espinha dendrítica de neurônios humanos cultivados in vitro. Rotulagem GFP, microscopia confocal e análise 3D com o módulo de software de Filamento Tracer Imaris foram utilizados no presente protocolo. Culturas etapas que são necessárias para obter neurónios glutamatérgicos do córtex das camadas II a IV a partir de células estaminais neurais (NSC) também são brevemente descritos aqui. Todo o protocolo para a produção NSC humano já foi publicado em outros lugares ^4.

Protocol

1. Cultura Neuronal

Nota: reprogramação de fibroblastos em células-tronco pluripotentes, o compromisso com a linhagem telencéfalo dorsal, derivação, amplificação e bancário de progenitores corticais final (LCP) foram descritas em Boissart et ^al 4. A diferenciação neuronal de células-LCP como também foi realizada de acordo com Boissart et ai ⁴ com ligeiras modificações. Outros procedimentos foram desenvolvidos para a reprogramação directa de fibroblastos em células estaminais pluripotentes induzidas seguido da sua diferenciação em neurónios. Este protocolo foi mantida, uma vez que permite a produção selectiva de neurónios glutamatérgicos piramidais.

1. Tratar-6 placas de cultura com lamelas de vidro com poli-ornitina (diluído a 1/6 em DPBS, concentração de estoque de 0,01%) O / N, seguido por três lavagens em STDF. Em seguida, adicione a laminina (concentração de 1 mg / ml, diluído 500 vezes em DPBS) durante pelo menos 10 horas, sob a câmara de fluxo .
2. Placa e despachar NSC a baixa densidade (50.000 células / ^cm2) em 6 placas de cultura com lamelas de vidro em 3 ml de meio de cultura consistindo em DMEM / F12 (500 ml), 2 frascos (5 mL cada) de suplemento N2, 2 frascos para injectáveis ​​(10 ml cada) de suplemento de B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades / ml e estreptomicina = 10.000 unidades / ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (da solução: 50 mM) e laminina (1 / 500), sem factores de crescimento. Passo crítico: Realizar este passo cuidadosamente pela adição de células com movimentos de rotação lentos, a fim de reduzir a agregação de células.
3. Remover o meio de cultura. Adicionar meio fresco contendo N2B27 2 ug / ml de laminina solução fresca para manter o neurónio ligado nas lamelas de vidro e evitar aglomeração. Mudar o meio cada 3 dias. Manter algum do meio restante (200 uL) antes da adição de meio fresco, a fim de impedir que a célula de secagem. Alternativamente, proceder rapidamente e alterar o volume total (3 mL).

e_title "> 2. Transdução Lentivirus

Nota: lentivirais GFP foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Uwe Maskos do laboratório no Instituto Pasteur (Paris) e preparado de acordo com o protocolo publicado ^5. Expressão da GFP é dirigido pelo promotor de rato fosfoglicerato-quinase (PGK). Para este estudo, foi título viral de 400 ng / ul (solução estoque em PBS 1x).

1. Transduzir neurónios iPSC derivados humanos em qualquer etapa de maturação por partículas virais através da adição de 1 ul da solução de estoque contendo 40 ng de vector lentiviral GFP por poço de cultura (placas de 6 poços) e incubar durante 48 horas em meio de cultura fresco. Nota: Para este protocolo, a duração da incubação permite uma boa rotulagem das estruturas da coluna vertebral.

3. Imunofluorescência

Nota: A fim de melhorar a rotulagem de toda a morfologia da coluna, imunofluorescência foi realizada utilizando um anticorpo anti-GFP em condições permeabilizadas.

1. Remover o meio de cultura e as células transduzidas fixar em lamelas em paraformaldeído a 4% durante 10 min à TA, depois lavar 3 vezes em PBS 1X (10 min cada).
2. Immerge lamelas em PBS suplementado com 0,05% de Triton (100x) e 10% de soro de cavalo durante 1 h à TA, em seguida, lavar 3 vezes em PBS 1x.
3. Adicionar 100 ul de 1x PBS suplementado com 4% de soro de cavalo e anticorpo primário (1 / 1.000) criado contra GFP e diluída por um factor de 1,000 a cada lamela. Incubar numa caixa escura S / N a 4 ° C, e depois lavar 3 vezes com PBS 1x.
4. Diluir com Alexa Fluor 488 conjugado com anticorpo (1/200) em PBS suplementado com 0,5% de Tween 20 e incubar durante 1 h à TA. Em seguida, lavar 3 vezes em 1x PBS e montar lamelas em lâminas de vidro com meio de montagem para a microscopia de fluorescência.

4. dendríticas Spine Imagem

1. Execute confocal de imagem através de um microscópio de varredura a laser confocal.
2. Selecione neurônios saudáveis, com uma morfologia piramidalnd uma arborização dendrítica completo, e quantificar, pelo menos, 10 neurônios por condição de experiências separadas. Quantificar 60-100 mM por dendrite.
3. Adquirir imagens usando um óleo 40X NA = 1,3 objetiva e uma linha de laser de 488 nm para excitação GFP, com uma potência de pico típica a nível amostra de cerca de 20 mW. Definir tamanho do pixel em torno de 80 nm para provar corretamente espinhas dendríticas.
   Nota: A chamada análise posterior para uma imagem na qual o ruído não comprometa a segmentação adequada dos dendritos e espinhas. Com as definições de amostragem e de potência espaciais mencionadas acima, observamos que um pixel em tempo de permanência de 3,15 mS é suficiente para coletar fótons suficientes para construir tal imagem. Para amostras de dim, a qualidade da imagem pode ser melhorada por uma média de 2 a 4 varrimentos. Pode ser necessária a aquisição de vários azulejos XY para cobrir a região de interesse, o que, em seguida, devem ser costuradas antes do processamento.
4. Para provar todo o volume neurônio, adquirir uma pilha-Z, comZ um espaçamento que varia de 150 nm a 300 nm, obtendo-se 20 a 30 fatias Z.
   Nota: A resolução espacial lateral, obtida com essas configurações é 234 nm ea resolução axial é 591 nm. A amostragem escolhida aqui é adequada, mas, como a resolução axial é maior do que o menor tamanho das espinhas a ser trabalhada, a análise favorece as espinhas que se estendem lateralmente a partir das dendrites.
   

5. 3D Quantificação de espinhas dendríticas

Nota: As secções que se seguem descrevem especificamente a utilização do software para análise Imaris. Existem implementações alternativas, incluindo NeuronStudio ^{15 ou} Metamorph ^{8, que} pode fornecer resultados semelhantes.

Use as seguintes configurações-chave:

1. Como uma etapa de pré-processamento, usar a filtragem Gaussian através das instalações de processamento de imagens oferecidas pelo software. Executar filtragem Gaussian através do Processamento de Imagem> Smoocoisa> Filtro de Gauss. Definir a largura do filtro para ser igual ao tamanho do pixel em XY.
2. Execute um traçado semi-automática de dendrites, utilizando o módulo de Filament Tracer do software.
   1. Em primeiro lugar, calcular o diâmetro dendrite, usando a função da distância no separador Fatia do software.
   2. Na guia Ultrapasse, clique na ferramenta filamentos. Para uma melhor robustez, este protocolo se baseia em rastreamento semi-automática; clique em Ir criação automática. O módulo de interface agora está mostrando a guia Draw. Aqui, selecione autopath como um método, Dendrite como um tipo, e introduzir o diâmetro estimado dendrite.
   3. Use o modo Selecção do ponteiro, virando o cursor em uma caixa. Shift-botão direito do mouse sobre o ponto de partida dendrite. Nota: o software realiza cálculos iniciais.
   4. Mova o ponteiro ao longo da dendrite. Desde o ponto de partida (representamed como uma esfera azul), é mostrada uma linha amarela que representa o caminho dendrite mais provável. Shift-esquerdo do mouse sobre o ponto final dendrite.
3. Execute o espinhos segmentação automática. Nota: Os espinhos sobre a dendrite rastreada encontram-se automaticamente pelo módulo de interface.
   1. Na interface do módulo, clique na guia Criação. Na lista drop-Reconstruir, escolher Rebuild Dendrite Diâmetro e marque a caixa de dados Fortaleza. Em seguida, clique em Reconstruir.
   2. Definir o limite para que o volume segmentado corresponde ao volume dendrite real. Como um algoritmo, selecione Shortest Distância do Mapa distância. Clique no botão Avançar.
   3. Determine o menor diâmetro da cabeça da coluna eo comprimento máximo, novamente usando a ferramenta distância na guia Fatia do software, em seguida, voltar para a guia Ultrapasse e inserir os parâmetros. Fou este protocolo, valores em torno de 200-300 nm para o diâmetro mínimo e 4 mm de comprimento máximo são bons pontos de partida. Não marque a caixa Permitir ramo de espinhos. Clique no botão Avançar.
   4. Ajustar o Limiar Pontos de sementes de modo a que os pontos azuis representam espinhas localizar a cabeça da coluna reais. Clique no botão Avançar. Nota: O cálculo do núcleo é feito agora e pode ser demorado.
4. Classificar espinhas, indo para a aba Ferramentas da interface do módulo. Clique em Classificar espinhos. Na interface do usuário for solicitado, certifique-se de que existem quatro classes, definidas pela morfologia da seguinte forma: Stubby: comprimento <1 mm; Cogumelo: Comprimento (espinha)> 3 e largura Max (cabeça)> largura média (pescoço) x 2; Longo e fino: A média de largura (cabeça) ≥ largura média (pescoço); Filopodia-like: Comprimento ≤ 4 mm (sem cabeça).
   Nota: O moInterface dule gera quatro novos objetos filamentos contendo os resultados da classificação.
5. Exportação de dados estatísticos: em qualquer um desses quatro interfaces de objeto, vá para a guia Estatísticas.
   Clique sobre a exportação todas as Estatísticas botão para arquivo.
   Nota: Outros valores estatísticos podem ser exportados para dendrites (. Por exemplo, comprimento, área, diâmetro, profundidade ramo, ramificação ângulo, volume, etc dizer.), E por espinhas (por exemplo, retidão, a área de ligação, comprimento e volume de distintas partes da espinha, espinha de diâmetro, densidades, etc.)

Results

O presente estudo descreve um protocolo padronizado para a coluna quantificação das dendrites cultura de neurônios piramidais derivadas da IPSC. Este protocolo permite a análise de maturação coluna sobre neurónios humanos e sua possível comparação com a maturação das espinhas em culturas neuronais de roedores normais, bem como em modelos animais in vivo.

A Figura 1A representa um esquema dos diferentes passos de cultura que permitem a produção de neurónios piramidai...

Discussion

A quantificação das características morfológicas dos neurônios piramidais contou com o software. A interface Filament Tracer foi utilizada para a segmentação de neurônios e espinhos, eo módulo XT foi utilizado para suas análises.

Para analisar a precisão da nossa técnica, primeiro comparou os parâmetros morfológicos medidos (comprimento, área e volume total de espinha quando aplicável), com os publicados usando ratos neurônios piramidais maduros na cultura ^{6, 7 e} tecidos cerebrais...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), sem Cálcio, Magnésio e Fenol Vermelho	Gibco/ Life Technologies	14190169
Solução de Poli-L-Ornitina Biorreagente	Sigma Aldrich	P4957
Laminina de camundongo	Dutscher Dominique	354232 Suplemento
N2	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Suplemento sem Vitamina A (50x)	Gibco / Life Technologies	12587010
DMEM / NUT. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoetanol	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Penicilina-Steptomicina	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Soro de Coelho Anticorpo Policlonal	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Soro para cavalos	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit	Gibco/ Life Technologies	A11034
Anticorpo Policlonal Anti-betaIII tubulina	Millipore	AB9354
Coverglass 13 mm	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent com DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Líquido Viscoso	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Fibroblastos Humanos	Coriell Linha Celular Biorrepositório	GM 4603 e GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, EUA
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss (Alemanha)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG,	Zurich versão 6.4.0 Filament	Tracer e Imaris XT módulos são necessários
Software Huygens	Software Huygens, SVI, Holanda	Versão Pro	Opcional (para testes de deconvolução)