Artigo de método

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um

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DOI:

10.3791/53199

⸱

6 de setembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A homeostase do cálcio do retículo endoplasmático é interrompida em diversas patologias. Um repórter de proteína de monitoramento de cálcio ER secretado (SERCaMP) pode ser usado para detectar interrupções no armazenamento de cálcio ER. Este protocolo descreve o uso de um SERCaMP de Gaussia luciferase para examinar a homeostase do cálcio do RE in vitro e in vivo.

Resumo

O retículo endoplasmático (ER) contém o mais alto nível de cálcio intracelular, com concentrações de aproximadamente 5000 vezes maior do que os níveis citoplasmáticos. Um controlo apertado sobre ER cálcio é imprescindível para o dobramento de proteínas, modificação e tráfico. Perturbações para Er cálcio podem resultar na activação da resposta proteína desdobrada, um mecanismo de resposta de stress do ER de três pinos, e contribuir para a patogénese de uma variedade de doenças. A capacidade de controlar alterações ER cálcio durante o início e progressão da doença é importante, em princípio, no entanto, um desafio na prática. Métodos actualmente disponíveis para o monitoramento ER cálcio, tais como corantes e proteínas fluorescentes dependentes de cálcio, têm fornecido uma visão sobre a dinâmica ER cálcio nas células, porém essas ferramentas não são adequados para estudos in vivo. O nosso laboratório demonstrou que uma modificação para o terminal carboxi de Gaussia luciferase confere secreção do repórter em resposta aDepleção de cálcio ER. Os métodos para a utilização de uma base de luciferase, proteína secretada ER monitorização de cálcio (SERCaMP) in vitro e in vivo em aplicações são aqui descritos. Este vídeo destaca injeções hepáticas, manipulação farmacológica de Gluc-SERCaMP, coleta e processamento do sangue e os parâmetros de ensaio para acompanhamento longitudinal de ER cálcio.

Introdução

O funções em muitas capacidades celulares, incluindo o dobramento de proteínas, a secreção de proteínas, a homeostase lipídica e de sinalização intracelular 1 retículo endoplasmático (ER). Central para a função ER normal é manter as concentrações de cálcio luminais em ~ 5.000 vezes aqueles encontrados no citoplasma 2-4. Este processo intensivo de energia é regulada pela ATPase sarco / retículo endoplasmático de cálcio (SERCA), uma bomba que move íons de cálcio para o ER. O efluxo de cálcio do RE é mediada principalmente pela rianodina (RyR) e trifosfato de inositol (IP3R receptores). Uma vez que muitos processos de ER são dependentes de cálcio, interrompendo o armazenamento pode levar ao estresse ER e eventual morte celular.

ER desregulação de cálcio tem sido observada em doenças, incluindo cardiomiopatia, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e 5. Devido à natureza progressiva destas doenças, tem sido um desafio para delinear a causa-efeito relação entre patogênese e alterações na loja ER cálcio. Uma série de tecnologias têm permitido avanços significativos em nossa compreensão da dinâmica ER cálcio, incluindo corantes e indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis). Corantes de cálcio de baixa afinidade, que aumentam em fluorescência quando ligados a Ca2 +, podem ser carregados em células para examinar compartimentos subcelulares com elevadas concentrações de cálcio 6. Gecis, tal como Catcher D1ER e permitir o monitoramento das flutuações de cálcio com um controle mais preciso da localização subcelular 7-9. Recentemente, uma outra classe de Gecis chamados indicadores de proteína encapsulada em organelo medição de cálcio (cepia) foram descritos 10. Uma terceira abordagem combinando genética e pequena molécula química é-esterase alvo corante de carga (TED), que utiliza um carboxilesterase geneticamente codificado (voltado para o ER) com um corante à base de cálcio éster 11.

Enquanto o AFORementioned abordagens têm forças e fraquezas inerentes, podem fornecer informações valiosas sobre a dinâmica do cálcio ER através de medições agudos de fluorescência. Eles são, no entanto, não é óptima para os estudos longitudinais muitas vezes necessários para investigar a progressão da doença. Com o objectivo de conceber um método para controlar a dinâmica de cálcio durante grandes períodos de tempo, foram identificados e desenvolvida uma modificação da proteína para criar as proteínas secretadas de monitorização de cálcio ER (SERCaMPs) 12.

SERCaMP contorna várias limitações associadas com outras metodologias, através de uma abordagem minimamente invasiva para interrogar repetidamente o armazenamento de cálcio ER. Temos anteriormente demonstrado que o péptido carboxi-terminal ASARTDL (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-leucina-ácido aspártico) é suficiente para promover a retenção no ER; no entanto, em condições que causam decréscimos em ER de cálcio, a sequência do péptido não é mais capaz de reter ER localization e a proteína é secretada 13. A base da tecnologia SERCaMP é o apêndice da ASARTDL ao terminal carboxi de uma proteína segregada (por exemplo, luciferase Gaussia, ou Gluc) de tal modo que a secreção é desencadeada pela depleção de cálcio ER, criando, assim, um repórter robusta de ER desregulação de cálcio 12. A expressão de glic-SERCaMP através de métodos transgénicos permite fluidos biológicos, incluindo meio de cultura celular e de plasma para ser analisado para alterações na actividade gluc como um indicador da homeostase do cálcio ER. O método tem aplicações para o estudo longitudinal de alterações progressivas na loja ER cálcio tanto in vitro como in vivo. O protocolo seguinte é escrito como um esboço geral para a utilização de base SERCaMP-Gluc para estudar a homeostase do cálcio ER, mas o protocolo pode servir como um guia para SERCaMPs repórter alternativos.

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Protocolo

1. Ensaio In Vitro: Detecção SERCaMP de lançamento de uma linha celular SH-SY5Y Estável

  1. Placa SH-SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) em placas de cultura de tecidos tratados com 150.000 células por cm2 de área de superfície. Para placas de 96 cavidades, por exemplo, sementes de 50.000 células por poço (Figura 1A). Crescer as células SH-SY5Y em DMEM (alto teor de glucose, GlutaMAX, piruvato) + 10% de soro de crescimento bovina + 1x penicilina / estreptomicina.
    1. As células da passagem até 15 vezes (Figura 1B). Número passagem superior não foi testado.
    2. E volta para as células incubadora humidificada a 37 ° C com 5,5% de CO 2 e incubar durante a noite.
  2. Antes do tratamento experimental (s), recolher uma amostra de linha de base para cada poço de transferência de 5 ul de sobrenadante de cultura a uma opaco paredes placa de 96 poços. Antes de coletar, bata suavemente a placa de todos os lados e agite para evitar os efeitos da inclinação. Selar a placa opaca com um adesivo sfolha de Ealing e armazenar a 4 ° C até à hora de ensaio enzimático.
    Nota: Segregada glic-SERCaMP é muito estável em meio de cultura celular. Nós anteriormente relatado de aproximadamente 5-10% da actividade gluc foi perdido após uma incubação de 72 h a 37 ° C (incubado em células SH-SY5Y) 12.
  3. Tratar as células como desejado para examinar a depleção de cálcio ER (por exemplo, do meio ambiente, farmacológico, as manipulações genéticas). Evitar longa exposição ao ambiente externo (fora da incubadora controlada) como alterações no pH irá ocorrer rapidamente em CO2 atmosférico. Adicionar HEPES ao meio de cultura a 20 mM, para estabilizar o pH 14, se forem necessárias manipulações prolongados. Evite a exposição à luz ao usar HEPES no meio de cultura 15.
    1. Controlo positivo: Tratar as células com 100 nM thapsigargin (Tg) ou ácido ciclopiazônico 50 mM (CPA) para 4-6 hr para experimentos em células SH-SY5Y. Resposta máxima em outras linhas de células podem exigir incubações mais longas ou concen diferentetrações de compostos.
    2. Controle negativo: meio de cultura Collect a partir de células SH-SY5Y parentais. Na nossa experiência, a luminescência fundo para este ensaio é de menos de 0,05% de secreção basal a partir de células SH-SY5Y-gluc-SERCaMP estáveis.
  4. Recolha e armazenamento de amostras de 5 mL de mídia condicionado nas timepoints desejados, conforme descrito na etapa 1.2.
  5. Avaliar a atividade enzimática no meio como descrito na Seção 5.
  6. Examine Gluc intracelular por immunoblot ou ensaio de luminescência.
    1. Para imunotransferência: As células em tampão de lise RIPA modificado contendo 50 mM de Tris (pH 7,4), NaCl 150 mM, desoxicolato de sódio 0,25%, EDTA 1 mM, NP40 a 1% e inibidores de protease. Separado em gel de SDS-poliacrilamida e transferência para uma membrana de PVDF 0.20 uM. Incubar com anticorpo gluc membrana (1: 2000 de diluição) durante a noite a 4 ° C. Execute incubação de anticorpos e de membrana lavagens secundárias, conforme o protocolo definido pelo usuário para reagente de detecção de escolha.
    2. Paraensaio de luminescência (Figura 2): execute os seguintes passos no gelo:
      1. Remover todo o meio dos poços da placa de cultura de tecido e lavar com 200 jil de PBS frio.
      2. Adicionar 75 ul de tampão de lise contendo Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, NP40 a 1% e inibidores da protease a cada poço.
      3. Girar a placa num agitador orbital (120 rpm) a 4 ° C durante 20 min.
      4. Pipeta suavemente o ligado cima e para baixo usando uma pipeta multicanal, evitando bolhas de ar. Transferir 5 mL de ligado a uma placa opaca e avaliar luminescência conforme descrito na Seção 5.

2. Ensaio In Vitro: A transfecção transiente de células imortalizadas com SERCaMP

Nota: Temos observado que os procedimentos de transfecção transiente pode induzir estresse celular e diminuir o subsequente resposta Gluc-SERCaMP. A seguinte abordagem foi desenvolvida para minimizar transfecção eff ECTS em células SH-SY5Y. Optimização do presente processo (incluindo a escolha do reagente de transfecção) para linhas celulares alternativos pode ser necessária. Quando possível, é recomendado o uso de linhas celulares estáveis ​​ou métodos de transdução viral delineados nas secções 1 e 3, respectivamente.

  1. Placa de células SH-SY5Y numa placa de 100 mm a 4 x 10 6 células. Este prato vai ser suficiente para re-semente de cerca de 300 poços (96 formato de placa de poço) seguindo o procedimento de transfecção.
  2. Transfectar células com reagente Xfect utilizando 20 ug de ADN de plasmídeo (que codifica glic-SERCaMP) e 6 uL de reagente Xfect. DNA escala e reagente Xfect em conformidade para recipientes de cultura maiores ou menores.
  3. Retorno células para incubadora durante 48 horas.
  4. Tripsinizar as células e propagar novamente para placas de 96 poços a 60.000 células por poço. Siga os passos subsequentes descritos na Seção 1.

3. In Vitro Ensaio: Viral Expression mediada pelo vetor de Gluc-SERCaMP

tenda "> Nota: viral adeno-associado (AAV) vector embalagem 16 e 12 de purificação e produção de lentivírus 13 têm sido relatados previamente.

  1. Titer-gluc SERCaMP AAV utilizando os seguintes iniciadores e sondas: iniciador de sentido directo, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; iniciador de sentido reverso, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sonda (5'-FAM-6 / 3'-BHQ-1 marcado), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'para a PCR quantitativa.
    1. Preparar a curva padrão por linearização de um plasmídeo contendo gluc e purificação do ADN utilizando um spin-coluna (por exemplo, Machery-Nagel NucleoSpin Gel de PCR e de limpeza). Quantificar o ADN por separação num gel de agarose ao lado de uma escada de massa. Preparar diluições 1:10 de DNA a partir de 100 pg / ml a 10 fg / ml em PBS. Calcular as cópias / ml de DNA de plasmídeo Gluc em cada uma das concentrações com base no peso molecular do plasmídeo.
    2. Dilui-se os estoques de AAV em PBS (diluição apropriado será dependenteparâmetros de preparação viral e determinado empiricamente).
    3. Executar a reacção de PCR num sistema de PCR em tempo real usando as seguintes condições: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 seg, e 60 ° C x 1 min durante 41 ciclos. Calcular cópias / ml utilizando a curva padrão.
  2. Lentivírus título com um p24-X kit Lenti titulação rápida. Descongelar lentivirais alíquotas em gelo e diluir a proteína p24 de controlo em meio SH-SY5Y.
    1. Dilui-se a lentivírus de tal modo que ele irá cair sobre a curva padrão (por exemplo, 1: 20000 ou 1: 100.000). O factor de diluição necessária irá variar de acordo com os parâmetros da preparação lentivirais e deve ser determinada empiricamente. Siga as instruções do fabricante para todas as etapas subseqüentes.
  3. Células de placa para placas de 96 poços. Para as células SH-SY5Y, chapeamento procedimentos descritos na Seção 1 pode ser seguido. Por neurónios corticais primários de ratos, as células devem ser isoladas e cultivadas em placas revestidas de forma adequadas previamente descrito 16. Manter neurónios corticais primárias de rato em meio Neurobasal suplementado com B27 1x e 500 uM de L-glutamina. Realizar trocas meio médio em dias alternados.
  4. Transduzir as células com vírus. O objetivo de transdução viral é conseguir a baixa expressão de nível, como Gaussia luciferase fornece sinal robusto.
    1. De AAV de transdução de células SH-SY5Y: transdução no dia seguinte chapeamento. Diluir AAV a 6,0 x 10 7 vg / mL em tampão de diluição de AAV (PBS + 0,5 mM MgCl2). Adicionam-se 5 ul de AAV diluída (3,0 x 10 8 VG; MOI de aproximadamente 6000) por poço da placa de 96 poços (Figura 3A). Use 10% de alvejante para inativar resíduos vetor viral.
    2. De AAV de transdução de neurónios corticais de rato primários: transduzir 6-8 dias após o plaqueamento. Diluir AAV a 4,0 x 10 6 vg / mL em tampão de diluição de AAV. Adicionar 5 uL de AAV diluída (2,0 x 10 7 VG; MOI de aproximadamente 350) por poço dePlaca de 96 poços (Figura 3B). A MOI óptimo deve ser determinado empiricamente para outros tipos de células. Use 10% de alvejante para inativar resíduos vetor viral.
    3. Transdução lentiviral de células SH-SY5Y: transdução no dia seguinte chapeamento. Diluir lentivírus a 20 pg / mL de p24 (concentração determinada utilizando o kit de titulação) em solução salina equilibrada de Hank. Adicionar 5 uL de vírus diluído por poço (100 pg de p24, equivalente a 1.250.000 partículas lentivirais, ou ~ 1250 IFUs) de uma placa de 96 poços contendo 100 uL de volume. Dimensione adequadamente para formatos maiores. Use 10% de alvejante para inativar resíduos viral.
  5. Recolha de uma amostra pré-tratamento do meio e iniciar tratamentos experimentais 48 h (SH-SY5Y) ou 5-7 dias (rato primários neurónios corticais) após transdução.

4. Ensaio In Vivo SERCaMP

Nota: Antes de realizar quaisquer procedimentos com animais não se esqueça de obter a devida aprovação através da sua instituição. Tudocirurgias de sobrevivência são para ser feito em condições estéreis com anestesia adequada. Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados e estão em conformidade com as diretrizes do NIH ACUC.

  1. Instrumentos cirúrgicos autoclave antes do início da cirurgia (121 ° C, 30 minutos de esterilização, o tempo de secagem de 20 minutos). Limpe todos os instrumentos de uma ultrasonicator imediatamente a seguir todos os procedimentos e antes da autoclavagem. Manter condições estéreis durante a cirurgia sobrevivência. Para cirurgias que requerem vários animais, limpar instrumentos cirúrgicos com 70% de álcool, ultrasonicate e talão esterilizar entre ratos. Consulte a Lista de Materiais para instrumentos necessários.
  2. Prepare rato para a cirurgia. Aqui usamos Sprague-Dawley machos (180-200 g).
    1. Anestesiar ratos utilizando isoflurano gás durante 3 min (4-5% de isoflurano entregue a 1.000 cc / min), seguido de injecções intraperitoneais de xilazina (8 mg / kg) e cetamina (80 mg / kg). Aplicar pomada oftálmica para proteger córneas de secar. Bcirurgia egin uma vez que o rato está profundamente anestesiado como demonstrado pela ausência de reflexo de retirada seguinte cauda ou pé pitada.
    2. Raspar a região do abdômen ligeiramente abaixo das costelas (baixo região torácica) para a região abdominal média. Esfregue a área cirúrgica três vezes, alternando 70% de álcool e Betadine matagal. Coloque rato em decúbito dorsal na área cirúrgica esterilizada com campos cirúrgicos estéreis.
  3. Diluir AAV-gluc-SERCaMP a 7,6 x 10 9 vg / ml (concentração final). Misturar bem invertendo o tubo.
    Nota: Faixa de concentração pode variar viral (Figura 4).
    1. Pipetar 105 l de AAV diluída num prato esterilizado. Utilize uma agulha de calibre 30 para recolher o vírus para uma seringa.
  4. Realizar a cirurgia para expor o fígado e injetar AAV-Gluc-SERCaMP.
    1. Antes de se fazer uma incisão no abdómen, aplicar bupivacaína a 0,25% para a área da incisão. Usando um bisturi, fazer uma incisão horizontal abaixo da caixa torácica (apmadamente 2-3 cm). Blunt dissecar para separar o tecido conjuntivo da hipoderme.
    2. Corte músculo abdominal, expondo o lóbulo medial direito de fígado.
      Nota: lóbulos adicionais podem ser injetados com base na aplicação final.
    3. Coloque o animal sob microscópio cirúrgico e ajustar para obter lóbulo medial direito de fígado no campo de visão. Injetar vírus no parênquima do lobo medial; 3 locais diferentes, cerca de 33 mL por local.
      Nota: Deixar agulha no tecido durante 5-10 segundos após a injecção para garantir a entrega de todo o volume de injecção.
    4. Suturar o músculo abdominal e pele separadamente e adicionar Neosporin usando algodão aplicador com ponta. Coloque rato numa câmara de recuperação até que a consciência é recuperada e rato é capaz de manter a posição vertical. Não deixe de rato (s) sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa isoladamente até que a incisão foi curado e suturas foram removidas (7-14 dias).
      Nota: De acordo com as diretrizes do NIH pós-cirúrgicas, manter registro cirúrgico. Anotar cartão de gaiola com procedimento, data, identificação do experimento, o peso corporal e dia da cirurgia. Dor / desconforto, a produção de fezes, atividade e consumo de alimentos e água estão a ser monitorado e registrado 3 dias pós-cirurgia. Analgesia pós-operatória é fornecido pela adição de acetaminofeno para a água potável (450 mg / 100 cc), embora nós normalmente não observar sinais de dor ou desconforto após a cirurgia.
  5. Comece a coleta de sangue da cauda 4-7 dias após a injeção. Prepare tubos de coleta de sangue por meio de rotulagem e pré-pesagem. Adicionar 50 uL de heparina (1000 U / ml) a cada tubo.
  6. Ponto de rato na câmara de anestesia de isoflurano durante 3 min (4-5% de isoflurano entregue a 1.000 cc / min). Remover rato da câmara e coloque no cone do nariz (2-3% isoflurano entregue em 500 cc / min). A coleta de sangue pode começar uma vez que o rato está profundamente anestesiados como demonstrado pela ausência de reflexo de retirada seguinte cauda piNCH.
    1. Usando uma tesoura esterilizada cortar ponta da cauda (1-2 mm) e coletar sangue gota a gota, em pré-cheia tubo de heparina. Recolha de sangue até o volume atinge maior do que 2: 1 a relação de heparina no sangue (> 100 mL de sangue / 50 uL de heparina). Volumes de colheita de sangue pode ser ajustada com base no projeto experimental. Use um aplicador de algodão molhado para aplicar o pó styptic para a cauda para parar o sangramento.
    2. Tubos de sangue da loja, a 4 ° C, se a recolha de amostras subsequentes. Limpe a tesoura com almofada de etanol e talão esterilizar entre coleções.
    3. Pesar tubos de coleta e ajuste com heparina para obter proporção 2: 1 (sangue: heparina). Este passo irá normalizar a quantidade de heparina em cada amostra (Tabela 1).
    4. Tubos de centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (plasma) para um tubo fresco e armazenar a -80 ° C até à hora de ensaio de luciferase (seção 5).
      Nota: o armazenamento de amostras a 4 ° C até 72 horas antes do ensaio enzimático tem minimal efeito sobre luminescência (Figura 5A). Até 3 ciclos de congelação-descongelação de amostras de plasma não têm efeito sobre luminescência (Figura 5B).
  7. Administração tapsigargina (controlo positivo):
    1. Prepare tapsigargina por diluição em etanol a uma concentração final de 2,5 mg / ml. Injectar thapsigargin a 1 mg / kg ip na parte inferior do abdômen.
      Nota: tapsigargina aumenta induzida pela trombina coagulação das plaquetas 17 e pode fazer a coleta de sangue da cauda mais difícil.
  8. Gaussia ensaio de luciferase:
    1. Descongelar as amostras de plasma em gelo.
      Nota: Para os estudos longitudinais, degelo e realizar ensaio de luminescência para todas as amostras timepoint no mesmo dia (usando preparação única de substrato).
    2. Transferência de 10 ul de plasma a uma placa com paredes opacas e medir a atividade enzimática como descrito na seção 5. Execute 3-4 repetições técnicas de cada amostra de plasma.
  9. Euthanasiuma
    Nota: A vantagem da tecnologia SERCaMP é a capacidade de se longitudinalmente monitor de ER cálcio. Dependendo dos parâmetros experimentais e endpoint análises, os animais são de ser sacrificados por medidas adequadas para endpoint analisa e em conformidade com orientações ACUC institucionais.

5. Ensaio de luminescência

  1. Prepare soluções coelenterazina (CTZ), diluindo o composto em metanol acidificado (30 mL de 10 N de HCl a 3 ml de metanol) a 20 mM. Preparar alíquotas de uso único e armazenar a -80 ° C.
  2. Prepara-se o substrato de trabalho no dia do ensaio.
    1. Para ensaios in vitro, diluir coelenterazina a 8 uM em PBS, por exemplo, adicionar 10 ul de estoque de 20 mM a CTZ 25 ml de PBS (Figura 6A, B).
    2. Para ensaios in vivo, diluir coelenterazina para 100 M em PBS, ácido ascórbico 500 mM, NaCl 5.
  3. Incubar CTZ preparado para, pelo menos, 30 minà temperatura ambiente antes de iniciar o ensaio.
    Nota: Esta etapa é muitas vezes incluído em Gaussia ensaios de luciferase, pois há relatos de decadência substrato rápido durante o primeiro 30 minutos após a preparação. Não observamos este efeito em nosso sistema (Figura 6C); no entanto, que muitas vezes incluem o passo de incubação que temos encontrado nenhum impacto negativo sobre o ensaio.
  4. Usar um leitor de placas que é capaz de monitorizar a bioluminescência e equipado com um injector de substrato. Prime as linhas com substrato.
    Nota: O substrato inicial através das linhas pode ser propenso à degradação. Para evitar leituras artificialmente baixos para amostras iniciais, injetar 20-30 poços vazios (que carregam um prato vazio no leitor) antes de medir amostras experimentais.
  5. Injectar 100 ul de substrato para os poços, agitar velocidade média durante 5 segundos, e medir a emissão de luz. Para o leitor de placas Biotek Sinergia II, integrar a emissão de luz ao longo de 0,5 segundos (amostras in vitro) e 5 segundos (emamostras in vivo) para a etapa de leitura. Otimizar os parâmetros de leitor de placas para o desempenho do ensaio ideal.
    Nota: exposições Gaussia luciferase cinética flash com deterioração rápida do sinal (em comparação a brilhar cinética observadas com outros luciferases). A cinética em flash de Gluc é influenciada por soro em meio de cultura de células (Figura 7A), destacando a importância de controlar a composição do meio através de amostras. Devido à rápida decomposição de luminescência após a adição de substrato (cinética de flash), o tempo entre Inject e ler passos deve ser uniforme para todas as amostras. O leitor de placas deve ser definido para injetar substrato para um bem, espere um tempo fixo (por exemplo, usamos um passo trepidação 5 seg), e ler muito bem. A adição de substrato a uma placa inteira antes de leitura apresenta um desafio significativo, a menos que de substrato pode ser adicionado a todas as cavidades ao mesmo tempo. Se um injector não está disponível, o problema pode ser parcialmente contornadas por incubação da placa durante 10 min entre o substrato adição e medição (evitando assim a parte íngreme da curva de decaimento) (Figura 7B).
  6. Repetir a injecção, o tempo de espera, e ler passos para cada poço na placa.

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Resultados

O método Gluc-SERCaMP permite a avaliação da homeostase do cálcio ER por amostragem líquidos extracelulares. Vários controlos podem ser incluídos no desenho experimental para melhorar a interpretação dos resultados. Em primeiro lugar, a utilização de um repórter constitutivamente segregada (por exemplo, sem a glic ASARTDL C-terminal ou "n-gluc Tag") podem ser empregues para avaliar os efeitos dos tratamentos experimentais sobre a via secretora (secreção celular global) e de expressão do transgene. Por...

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Discussão

Este protocolo destaca o in vitro e in vivo da utilidade glic-SERCaMP para monitorar a depleção de cálcio ER. Embora a modificação de proteínas para gerar SERCaMP parece generalizar a outras proteínas repórter 12, optamos Gaussia luciferase por sua robusta (200-1.000 maior vezes) bioluminescência em comparação com outras luciferases 18. Nós demonstramos detectável libertação induzida por thapsigargin Gluc-SERCaMP através de uma gama de doses 100 vezes de vírus Gluc-SERCaMP entregu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Abuso de Drogas. Agradecemos a Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno e Josh Hinkle por suas contribuições para o desenvolvimento deste método.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de 1,5 mlFisher 02-682-550
Solução 10% NP-40Pierce28324para ensaios intracelulares de GLuc
Seringas Luer-Lok de 1 mlFisher14-823-30
Pontas de filtro de 200 microlitrosRaininRT-L200F
3-0 AgulhasFisherNC9598192
30 G FisherScientific14-821-13A 
Folhas adesivas de vedação de microplacasThermoAB-0558
Almofadas de preparação de álcoolFisher22-246-073
Sistema de fluxo automático de anestesiaEZ AnestesiaEZ-AF9000
Câmara de recuperação de animaisLyon VetICU-912-004
Suplemento B27Life Technologies17504-044
Solução BetadineFisherNC9386574
BleachCloroxn/a
Soro de crescimento bovinoThermoSH30541.03
Coelenterazine, NativeRegis Technologies1-361204-200
Aplicadores com ponta de algodãoPuritan806-WC
Agulhas de corte Suturas circulares de 3/8WPI501803
Limpador ultrascônico digitalFisher ScientificFS60D
DMEM glicose alta, GlutaMAX, piruvatoLife Technologies10569-010
Escada de massa de DNALife Technologies10496-016
Gaussia luciferase (proteína recombinante)Nanolight321-100
Gaussia luciferase anticorpo (para WB, ICC ou IHC)New England BiolabsE8023S1:2,000 (WB)
Germinator 500CellPoint ScientificDS-401
Placas de ensaio Gluc (96 poços, opacas)Fisher07-200-589
Solução salina balanceada de HankLife Technologies14175-095
HeparinaAllmedtech63323-276-02
IsofluraneButler Schein29404
CetaminaHenry Schein995-2949
Kwik Stop Mordomo em pó hemostáticoSchein5867
L-glutaminaSigmaG8540
MetanolFisher a452-4
Centrífuga Microfuge 22RBekman Colter368831
NeosporinFisher19-898-143
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nikon StereoscopeNikonSMZ745T
Nucleospin Gel e PCR CleanupPipeta Machery-Nagel740609
P200RaininL-200XLS+
p24 Lenti-X kit de titulação rápidaClontech632200
Selo de filme PCRFisherAB0558
Penicilina/estreptomicinaCoquetel de15140-122
SigmaP8340
E-Z AnesthesiaEZ-258
Lâminas de bisturi, #10Ferramentas de ciência fina Inc10010-00
Ratos SD 150-200 gCharles RiverRatosratos encomendados a 150-200 g.  Cirurgia 5 dias após a chegada
Brincos para pequenos animaisNational Band and Tag co1005-1
Campos cirúrgicos estéreisBraintree ScientificSP-MPS
Synergy 2 leitor de placasBioTekn/a
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
ThapsigarginSigmaT9033prejudicial a
Mistura de embalagens lentivirais de VirapowerTechnologiesK4975-00
Xfect Transfection reagenteClontech631318
XylazineValley Vet468RX
Suturas cirúrgicas inibidores de protease Life Technologies Filtro de carvão ReFresh de saúde humana Life

Referências

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