Summary
Vi demonstrerer effekten av skleral tverrbinding med riboflavin og UVA på en aksial forlengelse kaninøye. Axial forlengelse ble indusert i 13 dager gamle New Zealand kaniner (mannlige og kvinnelige) ved å sy sine høyre øye øyelokkene (tarsorrhaphy).
Abstract
Nærsynte personer, spesielt de med alvorlig nærsynthet, er at høyere-enn-normal risiko for katarakt, glaukom, netthinneavløsning og chorioretinale unormalt. I tillegg er patologisk nærsynthet en felles irreversibel årsak til synshemming og blindhet 1-3. Vårt studium viser effekten av skleral kryssbinding ved hjelp av riboflavin og ultrafiolett-A-stråling på utvikling av aksial nærsynthet i en kaninmodell. Den aksiale lengde av øyeeplet ble målt ved A-scan ultralyd i New Zealand hvite kaniner i alderen 13 dager (mannlige og kvinnelige). Øyet deretter gjennomgikk 360 ° konjunktival peritomy med scleral tverrbinding, fulgt av tarsorrhaphy. Axial forlengelse ble indusert i 13 dager gamle New Zealand kaniner ved å sy sine høyre øye øyelokkene (tarsorrhaphy). Øynene ble delt inn i kvadranter, og hver kvadrant hadde to scleral bestrålings soner, hver med et areal på 0,2 cm² og en radius på 4 mm. Tverrbinding ble utført ved å slippe 0,1%dekstran-fri riboflavin-5-fosfat på bestrålingssoner 20 sec før ultrafiolett-bestråling A og hvert 20. sekund i løpet av 200 sek bestrålingstiden. UVA-stråling (370 nm) ble påført vinkelrett på senehinnen ved 57 mW / cm (total UVA-lys dose, 57 J / cm). Tarsorrhaphies ble fjernet på dag 55, etterfulgt av gjentatte aksiale lengdemålinger. Denne studien viser at scleral kryssbinding med riboflavin og ultrafiolett-A-stråling hindrer effektivt okklusjon-indusert aksial forlengelse i en kanin modell.
Introduction
Nærsynthet er den vanligste av brytningsforstyrrelser. Forekomsten av nærsynthet i USA og Europa er rapportert å være rundt 30%, og i asiatiske land påvirker den opp til 60% av befolkningen 1,2. Nærsynt progresjon forekommer hos opptil 50% av myopes, vanligvis med en hastighet på rundt -0,5 dioptrier over en to-års intervall 3. De helsemessige kostnader pålagt av nærsynthet er betydelige, inkludert utgifter til briller, kontaktlinser og refraktiv kirurgi og kostnader knyttet til de økte helserisikoen ved glaukom, katarakt, netthinneavløsning og synshemming 4-6.
I dyrestudier av nærsynthet, er synet reduksjon indusert av øyelokket suturering 7-10, plassering av en sperreinnretningen i kort avstand fra øyet og hornhinnen tatovering 11. Men for kunstig nærsynthet å forekomme i disse studiene har okklusjon prosess som skal utføres på meget unge dyr, som ikke syn deprivasjon eksperimenter CarrIED ut på voksne individer har vist seg vellykket.
En av de viktigste funksjonene til alvorlig nærsynthet er en patologisk endring av sclera med progressiv fortynning av senehinnen, sannsynligvis på grunn av en forstyrret feedback mekanisme av emmetropization etter visuell deprivasjon 12 eller på grunn av en metabolsk forstyrrelse av senehinnen, for eksempel i Ehlers- Danlos syndrom 13. Til syvende og sist, begge mekanismene fører til strekk og tynning av sclera, netthinnen og årehinnen skyldes strukturelle abnormiteter i nærsynt sclera som en redusert kollagen fiber diameter 14,15 og forstyrrelser i fibrillogenese 16.
Flere studier har vist at svekket kollagen tverrbinding er en viktig faktor i den svekkelse fremgangsmåten nærsynte sclera 17-18. Wollensak et al. 19-21 indusert kollagen tverrbinding ved å påføre det foto riboflavin og ultrafiolett-A (UVA) bestråling (370 nm)og bemerket en betydelig, 157% økning i stivhet av svin og menneske sclera in vitro 19 og en 465% økning i kanin skleral stivhet in vivo (Youngs modulus) 20. Kryssbinding hadde også en langsiktig effekt på kanin sclera in vivo: stivhet økt med 320,4% etter 3 dager, 277,6% etter 4 måneder, og 502% etter 8 måneder (Youngs modulus) 22.
Terapeutiske forsøk på å arrestere nærsynt progresjon er publisert 23-26, men suksessen til disse metodene er kontroversielle. Det er ingen effektiv måte for å hindre progressiv myopi er funnet til dags dato.
Årsakene til nærsynthet er fortsatt kontroversielt, og behandlingen er en utfordring. På basis av disse funnene, er det en hypotese at skleral tverrbinding kan tjene som et middel for sklera basert behandling av myopisk progresjon. Hensikten med denne studien er å undersøke scleral kollagen crosslinking effekt på utvikling av aksial nærsynthet indusert av visuelle aksen okklusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene ble behandlet i henhold til ARVO vedtak om bruk av dyr i forskning. Studien protokollen ble godkjent av den institusjonelle Utvalget for Forsøksdyrforskning (godkjenning nr 022-4598-2;. 021211).
1. Forberedelse til kirurgi # 1
- Vei og bedøve en 13 dager gammel New Zealand hvit kanin med en intramuskulær injeksjon av ketamin-hydroklorid 100 mg / ml (100 mg / kg) og xylazin hydroklorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg). Disse doser brukes på grunn av lengden av den kirurgiske prosedyren. Sikre riktig nivå av anestesi ved mangel av en smerte refleks.
- Ved hjelp av en steril bomullspinne, påfør en liten mengde oftalmisk salve til de ikke-opererte øyet for å hindre hornhinnen tørker ut. Påfør 0,9% normal saltvann dråper på det opererte øyet hornhinnen under operasjonen for å hindre at hornhinner tørker ut.
- Utfør tre aksiale lengdemålinger i hvert øye etter lokal anestesi (oxybuprocaine hydroklorid 0,4%) ved hjelp av en ultralyd A-skanner og deretter gjennomsnitt målingene. Anvende proben vinkelrett til den sentrale hornhinnen.
2. Kirurgi # 1 - Pre Cross Linking Step
- Ved hjelp av kirurgiske oftalmiske tenger og sakser under en oftalmisk operasjonsmikroskop, lage en 360 ° konjunktival peritomy med kirurgiske oftalmiske tenger og sakser.
- Ved hjelp av en vinklet pinsett eller en muskel krok identifisere de fire extraocular rectus muskler og isolere dem med 2-0 flettet silke ikke-needled sting.
MERK: silke sting vil hjelpe til med å flytte hele kloden i ønsket retning. Øyeeplet er delt inn i kvadranter mellom de fire rectus musklene (fire kvadranter).- Mark med en hud markør to soner i hver kvadrant, en ved ekvator sclera og en på bakre sclera. Disse er bestrålingssoner.
- Forbered en 3 ml til 5 ml sprøyte som inneholder 0,1% dekstran-free riboflavin-5-phosphate. Koble sprøyten til en 26 G tåre kanyle eller 25 G konisk hydrodelineator.
- Klargjør bestrålingsinnretning som omfatter en UV A (370 nm) lyskilde koblet til en skrå ned skreddersydde fiberoptisk. Etter måling av energi kraft og kalibrering (se merknad nedenfor), stille inn enheten til 57 mW / cm².
MERK: Kalibrering ble utført kommersielt av produsenten. Denne metoden gir en total UVA-lys dose på 57 J / cm. (57 mW / cm 2 på 0,2 cm 2 er 11,4 mW / 0,2 cm 2 under anvendelse av 11,4 mW / 0,2 cm 2 til 200 sekunder er en kumulativ belastning på 2,2 J per 0,2 cm2 flekk)
3. Kirurgi # 1 - Cross Linking
- Beveg øyeeplet ved å trekke de silkesuturer i motsatt retning av det valgte kvadrant som skal behandles (f.eks Trekk opp og nasal ved behandling av den nedre temporale kvadrant). Utfør øyeeple bevegelse ved hjelp av en 2-0 flettet silke ikke-nålet sutur som jegsolates hver rectus muskel.
- Påfør fotosensibilisator oppløsning inneholdende 0,1% dekstran-fri riboflavin-5-fosfat på bestrålingssonen 20 sec før bestrålings starter.
- Bestråle bestrålingssonen ved hjelp av en skrå ned skreddersydde fiberoptisk for en bestråling periode på 200 sek. Måle arealet av hver sone som 0,2 cm² med en radius på 4 mm.
- Påfør fotosensibilisator oppløsning inneholdende 0,1% dekstran-fri riboflavin-5-fosfat på bestrålingssonen hvert 20. sekund i løpet av 200 sek bestrålingsperiode.
MERK: Utfør bestråling og dropping av riboflavin samtidig av to kirurger. - Gjenta trinn 3,1-3,4 for hver av de fire øyeeple kvadranter.
4. Kirurgi # 1 - Post Cross Linking Step
- Barbere pelsen rundt øyet. Trim lokket marginene ved hjelp av kirurgiske oftalmiske saks og deretter forsiktig sy øvre og nedre øyelokk bruker 4-0 flettet silke elfenben farge - 3/8 sirkel revers skjære- 13 mm lengde C-3 nål (tarsorrhaphy). Anvende en liten mengde av oftalmisk salve på lokket margin på slutten av prosedyren (kloramfenikol 5%).
5. Kirurgi # 1 - Post Operativ Care
- Hold dyr under en varmelampe under gjenoppretting. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Plasser dyret i et rent bur med nytt sengetøy før det er fullt restituert. Etter utvinning, vil dyret bli returnert til dyrerom. Gå tilbake dyret til sin mor bare når våken.
- I løpet av første 48 timer, undersøke dyrene om den generelle tilstanden og tegn på sykdom eller infeksjoner. Administrere analgesi som angitt i del 1. Administrer analgesi som nødvendig hvis en endring i kanin oppførsel er observert. (Metamizol faller 50mg / kg hver 6. time).
6. Kirurgi # 2
- Femti-fem dager etter surgery # 1, veie og bedøve kanin med en intramuskulær injeksjon av ketamin-hydroklorid 100 mg / ml (100 mg / kg) og xylazin hydroklorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg).
- Ved hjelp av kirurgiske oftalmiske saks under en oftalmisk operasjonsmikroskop, fjern tarsorrhaphy. Utfør tre aksiale lengde målinger på hvert øye etter lokal anestesi (oxybuprocaine hydroklorid 0,4%) ved hjelp av en ultralyd A-skanner og deretter gjennomsnitt målingene. Anvende proben vinkelrett til den sentrale hornhinnen.
- Avlive kaninene med intraperitoneal fenobarbital-natrium (200 mg / 1,5 kg kroppsvekt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og 2 viser grafisk de aksiale lengdemåling av to grupper. Gruppe 1 kaniner gikk skleral tverrbinding og tarsorrhaphy på høyre øye mens det venstre øyet ikke ble operert (figur 1). Gruppe 2 kaniner gikk bare peritomy og tarsorrhaphy på høyre øye, mens det venstre øyet ikke ble operert (figur 2).
I gruppe 1, som gjennomgikk skleral tverrbinding og tarsorrhaphy, den midlere aksiale lengde i det høyre øyet målte 10,68 ± 0,74 mm før øyelokk sutur og 14.29 ± 0,3 mm 55 dager senere, for en gjennomsnittlig forskjell på 3,61 ± 0,76 mm. Tilsvarende verdier i unoperated / unsutured venstre øyet var 10,70 ± 0,79 mm og 15,14 ± 0,32 mm, for en gjennomsnittlig forskjell på 4,44 ± 0,81 mm (figur 1). Sammenligning av de aksiale lengder av suturertog unsutured øyne på slutten av okklusjon fase viste en mindre netto økning i suturerte øyne.
I gruppe 2, som gjennomgikk bare peritomy og tarsorrhaphies, betyr aksiale lengde i det høyre øyet målte 10,50 ± 0,67 mm før øyelokk sutur og 15,69 ± 0,39 mm 55 dager senere, for en gjennomsnittlig forskjell på 5.19 ± 0.85 mm. Tilsvarende verdier i unoperated / unsutured venstre øyet var 10,54 ± 0,71 mm og 14,74 ± 0,38 mm, for en gjennomsnittlig forskjell på 4,20 ± 0,67 mm (figur 2). Sammenligning av de aksiale lengder av suturerte og unsutured øyne på slutten av okklusjon fase viste en større netto økning i suturerte øyne.
Sammenligning av gjennomsnittlig endring i aksial lengde av de høyre øyne mellom gruppe 2 (5,19 ± 0,85 mm) og gruppe 1 (3,61 ± 0,76 mm) ga en betydelig lavere verdi ved slutten av okklusjon phase (55 dager) i øynene som gjennomgikk tverrbindingsprosedyren (p <0,001, parametriske Mann-Whitney test). Den mellom-gruppe forskjell i gjennomsnittlig aksial lengde på venstre øyne (4,20 ± 0,67 mm vs. 4,44 ± 0,81 mm) var ikke statistisk signifikant (p = 0,39, Mann-Whitney ikke-parametrisk test).
Figur 1. Høyre øye aksiale målinger før og etter kryssbinding skleralt og tarsorrhaphy vs venstre øye aksielle målinger. Den midlere aksiale lengde av det høyre øye før skleral tverrbinding og tarsorrhaphy (RE start) og etter fjernelse av tarsorrhaphy 55 dager senere (RE ende). Den midlere aksiale lengde av det venstre øyet ved baseline (LE start), og 55 dager senere (LE ende). Det venstre øyet ble ikke operert, og ble stående åpen. Feilstolpene indikerer standardfeil av gjennomsnittet. (Re-trykt med permission fra referanse 27). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Høyre øye aksiale målinger før og etter tarsorrhaphy vs venstre øye aksielle målinger. Den midlere aksiale lengde av det høyre øye før tarsorrhaphy (RE start) og etter fjernelse av tarsorrhaphy 55 dager senere (RE ende). Den midlere aksiale lengde av det venstre øyet ved baseline (LE start), og 55 dager senere (LE ende) sikret venstre øye ble ikke operert og er igjen åpent. Feilstolpene indikerer standardfeil av gjennomsnittet. (Re-trykt med tillatelse fra referanse 27). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer den første in vivo studie av forebyggelse av aksial myopi i en kaninmodell ved å bruke kryssbindingsteknologi med riboflavin og UVA-bestråling. Selv om forskjellige forsøksdyr kan anvendes i denne type studie, valgte vi kaniner for det meste på grunn av størrelsen av øynene og behovet for å utføre tverrbinding på skleral overflaten.
Vi fant ut at å utsette kaninen sclera og sy øvre og nedre øyelokk for å være utfordrende prosedyrer. Vi anbefaler trimming lokket marginer og bruke sting nevnt i vår protokoll for å sikre at øyelokkene er helt lukket for den gitte perioden uten behov for korrigeringer.
En viktig ting å vurdere, er behovet for å kalibrere bestråling enheten og fiberoptisk for den nødvendige kraft energi.
H & E histologiske lysbilder viste ingen giftige endringer i netthinnen på øynene som gjennomgikk tverrbindingsprosedyren. Videre undersøkelser bør utføres for å løse potensielle toksisitet av riboflavin og UVA bestråling på netthinnen, årehinnen og sclera, med fokus på posisjon, mengde energi og eksponeringstid.
Flere begrensninger av denne studien tilsier hensynet. Bare preoperative og postoperative aksiale lengde ble målt. Den aksiale lengde av øyeeplet ble målt ved hjelp av A-scan ultralyd. Vi gjorde ikke vurdere biometriske egenskaper, refraktiv analyse eller biomekaniske egenskapene til sclera.
Til sammen tror vi at effekten av scleral kryssbinding med riboflavin og UVA på den aksiale forlengelse av kaninøyne vil ha en positiv innvirkning på nærsynthet forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Ms Dalia Sela og Mr. Emi Sharon for deres profesjonelle og gode tekniske arbeid i laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
- McBrien, N. A., Gentle, A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia. Prog. Retin. Eye Res. 22, 307-338 (2003).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Au Eong, K. -G., Tan, D. T. H. Myopia: attempts to arrest progression. Br. J. Ophthalmol. 86, 1306-1311 (2002).
- Bullimore, M. A., Jones, L. A., Moeschberger, M. L., Zadnik, K., Payor, R. E. A retrospective study of myopia progression in adult contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 2110-2113 (2002).
- Rose, K., Smith, W. E., Morgan, I., Mitchell, P. The increasing prevalence of myopia: implications for Australia. Clin. Exp. Ophthalmol. 29, 116-120 (2001).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Shih-Yen, E. C., Chua, W. H. Myopia and associated pathological complications. Ophthal. Physiol. Opt. 25, 381-391 (2005).
- Tano, Y. Pathologic myopia - where are we now. Am. J. Ophthalmol. 134, 645-660 (2002).
- Greene, P. R., Guyton, D. L. Time course of rhesus lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 42, 529-534 (1986).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. The development of experimental myopia and ocular component dimensions in monocularly lid-sutured tree shrews (Tupaia belangeri). Vision Res. 32, 843-852 (1992).
- McKanna, J. A., Casagrande, V. A. Reduced lens development in lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 26, 715-723 (1978).
- Shapiro, A. Experimental visual deprivation and myopia. Doc. Ophthalmol. Proc. Ser. 28, 193-195 (1981).
- Wiesel, T. N., Raviola, E. Increase in axial length of the macaque monkey eye after corneal opacification. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 18, 1232-1236 (1979).
- Weiss, A. H. Unilateral high myopia: optical components, associated factors and visual outcomes. Br J Ophthalmol. 87, 1025-1031 (2003).
- Mechanic, G. Crosslinking of collagen in a heritable disorder of connective tissue: Ehlers-Danlos syndrome. Biochem. Biophys. Res. Com. 47, 267-272 (1972).
- Curtin, B. J., Iwamoto, T., Renaldo, D. P. Normal and staphylomatous sclera of high myopia. An electron microscopic study. Arch. Ophthalmol. 97, 912-915 (1979).
- Liu, K. R., Chen, M. S., Ko, L. S. Electron microscopic studies of the scleral collagen fibre in excessively high myopia. J. Formosan Med. Assoc. 85, 1032-1038 (1986).
- Funata, M., Tokoro, T. Scleral change in experimentally myopic monkeys. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 228, 174-179 (1990).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen cross-linking increases form deprivation myopia in tree shrew. Exp. Eye Res. 59, 475-486 (1994).
- Iomdina, E. N., Daragan, V. A., Ilyina, E. E. Certain biomechanical properties and cross linking of the scleral shell of the eye in progressive myopia. Proceedings of XIVth Congress on Biomechanics. Paris: International Society of Biomechanics. , 616-617 (1993).
- Wollensak, G., Spörl, E., Seiler, T. Riboflavin / ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am. J. Ophthalmol. 135, 620-627 (2003).
- Wollensak, G., Spörl, E. Collagencrosslinking of human and porcine sclera. J. Cataract Refract. Surg. 30, 689-695 (2004).
- Wollensak, G., Iomdina, E., Dittert, D. -D., Salamatina, O., Stoltenburg, G. Cross-linking of scleral collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophthalmol. Scand. 83, 477-482 (2005).
- Wollensak, G., Iomdina, E. Long-term biomechanical properties of rabbit sclera after collagen crosslinking using riboflavin and ultraviolet (UVA). Acta Ophthalmol. 87, 193-198 (2009).
- Wildsoet, C. F., Norton, T. T.
- Avetisov, E. S., Tarutta, E. P., Iomdina, E. N., Vinetskaya, M. I., Andreyeva, M. I. Nonsurgical and surgical methods of sclera reinforcement in progressive myopia. Acta Ophthalmol. Scand. 75, 618-623 (1997).
- Thompson, F. B. A simplified sclera reinforcement technique. Am. J. Ophthalmol. 86, 782-790 (1978).
- Whitmore, W. G., Curtin, B. J. Scleral reinforcement: two case reports. Ophthalmic Surg. 18, 503-505 (1987).
- Dotan, A., Kremer, I., Livnat, T., Zigler, A., Weinberger, D., Bourla, D. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-A radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
