A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Resumo

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

Resumo

A propagação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em meio condicionado derivado de células humanas em condições de cultura livre de alimentador tem sido de interesse. No entanto, um método ideal de propagação livre de alimentador ex vivo humanizado para hPSCs não foi desenvolvido; atualmente, substratos exógenos adicionais, incluindo o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), um fator mestre de sustentação de hPSC, são adicionados a todos os meios de cultura e substratos sintéticos, como Matrigel ou laminina, são usados em todas as culturas livres de alimentador. Recentemente, nosso grupo desenvolveu um protocolo simples e eficiente para a propagação de hPSCs usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em uma placa revestida de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSCs. Este protocolo não foi relatado anteriormente e pode permitir que os pesquisadores propaguem hPSCs de forma eficiente em condições de cultivo humanizado. Além disso, esse modelo evita os riscos de contaminação por hPSC por produtos de origem animal, como vírus ou proteínas desconhecidas. Além disso, este sistema facilita a produção em massa de hPSCs usando o revestimento de gelatina, que é simples de manusear, diminui drasticamente os custos gerais de manutenção ex vivo de hPSC.

Introdução

O objetivo deste protocolo é a propagação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em condições totalmente humanizadas ex vivo livres de alimentador, sem a necessidade de suplementação exógena adicional e substratos sintéticos. Até o momento, o desenvolvimento de modelos de cultura de hPSC ex vivo, que permitem a introdução de produtos de cultura na clínica, tem sido uma grande preocupação na pesquisa com células-tronco. Especificamente, dois problemas críticos precisam ser resolvidos. Primeiro, é necessário um sistema de cultura ex vivo humanizado para a propagação de hPSCs que evite o risco de contaminação por produtos de células animais. Em segundo lugar, é necessário um modelo de cultura livre de alimentadores para facilitar a produção em massa fácil e econômica de hPSCs. Para aplicações terapêuticas de hPSCs, é necessário identificar os fatores que regulam sua auto-renovação e diferenciação.

Desde que Xu et al. relataram inicialmente a viabilidade de usar meios condicionados (CM) derivados de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) para cultivar hESCs em Matrigel¹, muitos estudos examinaram métodos ideais de propagação ex vivo para hPSCs^2-4. No entanto, um sistema ideal de propagação de hPSC livre de alimentador ex vivo humanizado não foi desenvolvido porque os métodos atuais requerem substratos exógenos adicionais, incluindo bFGF e insulina, fatores de sustentação de hPSC bem conhecidos, em meios^{de cultura 5-7}. Além disso, substratos sintéticos como Matrigel ou laminina são usados em todas as culturas livres de alimento.

A lógica por trás do desenvolvimento e uso deste protocolo é baseada em nossos estudos anteriores que mostram que as células córions da placenta humana suportam de forma excelente a propagação de hPSCs sem suplementação de bFGF^8-11. Este protocolo tem uma série de vantagens, incluindo sua simplicidade em relação ao manuseio e sua relação custo-benefício, e é uma cultura humanizada quase perfeita que permite a propagação de hPSC sem substratos sintéticos exógenos. A aplicação de CM derivada da placenta humana (hPCCM) para hPSCs envolve 3 etapas. Primeiro, as células do córion são isoladas da placenta humana e cultivadas. Em segundo lugar, o hPCCM é produzido a partir de células cultivadas. Em terceiro lugar, as hPSCs são cultivadas usando hPCCM e suas características são confirmadas.

Este protocolo facilitará as aplicações clínicas de hPSCs e estudos dos mecanismos de proliferação e fixação de hPSC. Neste artigo, é apresentado o protocolo para a propagação bem-sucedida de hPSCs em hPCCM em uma placa revestida com gelatina.

Protocolo

Declaração de ética: O estudo da placenta humana foi realizado de forma prospectiva, com a aprovação do Comitê de Ética em pesquisa com seres humanos da Universidade da Coreia (AN09085-001). Todos os experimentos foram realizados em um livre de germes facilidade Clean Room no Centro Médico da Universidade da Coreia. O design e os procedimentos que utilizam hPSCs experimental foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Korea University Medical Center (AN12277-003).

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Brasão todos os pratos de cultura com 0,1% de gelatina. Autoclave salina tamponada com fosfato (PBS) e fórceps. Esterilizar tesouras cirúrgicas, tubos de microcentrífuga, e gaze a 121 ° C sob £ 15 psi durante mais de 15 min.
2. 0,25% de tripsina-etileno amina tetra-acético, ácido preparado pré-aquecido (tripsina-EDTA) e meios de pré-aquecido cultura filtrada (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 g / ml streptomycantes de iniciar os procedimentos.

2. isolamento de células de placenta humana

1. Obter tecido placentário, após o parto cesariana, de mulheres grávidas saudáveis ​​passando por aborto normal ou terapêutico em 7-32 semanas de gestação após a obtenção do consentimento informado por escrito.
2. Já o especialista obstétrica placas corial placenta humana cirurgicamente separados (HPCs) a partir da placenta; incubar estes em 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 20 minutos, e, em seguida, lava-se com 5 ml de PBS.
3. Isolar vilo corial de HPCs usando uma tesoura; mediu as vilosidades e lavá-los três vezes com 1 ml de PBS. Depois de picar a carne, coloque os vilo corial em um tubo de microcentrífuga utilizando uma ponteira; lavar as amostras com 500 � de PBS por pipetagem cima e para baixo, e centrifugar tubos de 120 g durante 3 min. Lavar tecidos duas vezes com 500 ul de meio de cultura de pré-aquecido.
4. Células em meio de cultura em placas revestidas com gelatina a 37 ° C, em 5% de CO ₂ , e em 95% de umidade. Pré-revestimento de todas as placas com gelatina a 0,1% durante 1 hora a 37 ° C. As colónias de células semelhantes a fibroblastos e vai formar o crescimento aderente cerca de 5-7 dias após o início da cultura no mesmo meio.
5. Trocar o meio cada 2-3 dias até a terceira passagem. Durante a cultura, a remoção de detritos de células flutuando no meio de cultura; crescimento de fibroblastos placentários irá anexar à placa. Cultura das células semelhantes a fibroblastos derivadas do HPC-se a ¹⁰ de passagem e, em seguida colhem-los para culturas de células estaminais embrionárias humanas após tripsinização e mitomicina-C (10 ug / ml) de tratamento.
6. Antes da congelação HPCs como amostras de banco, usar de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) para confirmar que HPCs não estão contaminados com agentes patogénicos que infestam a placenta, incluindo Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e as espécies bacterianas, Ureaplasma urealyticum, utilizando um kit de detecção de micoplasma.
   1. Seguir as instruções do fabricante para realizar RT-PCR, utilizar todos os iniciadores e as misturas fornecidas no kit. Use os sobrenadantes das células que foram cultivadas por 36 dias para a detecção de micoplasma. Adicionar 3 mL destas amostras para as misturas de PCR e executar o procedimento 1 ^r PCR durante 35 ciclos, cada um consistindo em 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 2 min, e 72 ° C durante 1 min.
   2. Adiciona-se cuidadosamente 0,5 mL do produto de PCR 1 ^r-se à mistura de PCR e executar o procedimento 2 ^nd PCR durante 30 ciclos utilizando as mesmas condições que anteriormente. Analisar os produtos amplificados por electroforese em gel de 1% de agarose; aplicam-se 10 ul de cada um dos 1 ^e 2 ^de produtos de PCR para os géis.
7. Se HPCs são encontrados para ser contaminados com agentes patogénicos, eliminar estesusando uma combinação de antibióticos (BM-Ciclina), seguindo as instruções do fabricante. Adicionar um novo meio que contém 10 ug / ml de BM-ciclina 1 durante 3 dias, e, em seguida, tratar as células com 5 ug / ml de BM-Ciclina 2 durante mais 4 dias. Repita este ciclo duas vezes e, em seguida, verificar se há contaminação por micoplasma novamente.

3. Células de colheita Placenta Humana derivados de meio condicionado (hPCCM)

1. Após a exclusão de contaminação, tratamento das células ligadas (85-90% de confluência; (1,5 x 10 ⁷ células / frasco) com mitomicina C (10 ug / ml) durante 2 horas e 30 minutos, e lavaram-se as células três vezes com 10 ml PBS. Incubam-se as células com meio de pré-aquecido, sem a mitomicina-C durante 24 h.
2. Um dia após o tratamento, incubar as células em 10 ml de meio (DMEM-F12 suplementado com 20% de Knock-Out substituição Serum [KOSR], 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 1% de NEAA, e 1% de penicilina-estreptomicina). Após 24 h de incubação, a colheita CM num tubo cónico de 15 ml efiltrar o CM através de um filtro de seringa de 0,22? m.
3. Adicionar 10 mililitros de novo meio e incubação. Recolhe todos os sobrenadantes a partir das culturas a cada dia durante 1 semana e congelar a forma colhidos a -80 ° C. Evitar congelar-descongelar repetidamente.

4. Cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e indução de células-tronco pluripotentes (iPSCs)

1. Obter linhas de células estaminais embrionárias humanas, as células H1 e H9 (listados no registro do NIH hESC sob o nome WA01 e WA09, respectivamente) e induzida por células-tronco pluripotentes iPSC-1: iPS (prepúcio) -1 e iPSC-2 (IISH1i- BM), do Instituto de Investigação WiCell (Madison, WI, EUA). As células devem ser descongeladas e cultivadas seguindo as instruções do fabricante.
2. Para o grupo de controlo, as células em pratos de cultura de Basement Membrane Matrix-revestidas em meio de cultura definido isento de soro, isento de alimentador e amplamente usado, a 37 ° C e em 5% de CO _2. Inicialmente, sementes 80-100 aglomerados de hPSCs in pratos de 35 mm. Cultivar células em esses pratos até 70-80% de confluência e rotineiramente células de passagem para a sub-cultura de uma vez a cada 5-6 dias, utilizando métodos mecânicos ou enzimáticos (Dispase). Lavar as células duas vezes com meio e placa-los em uma proporção de 1: 4. Substitua o meio com meio fresco todos os dias.
3. Para os grupos experimentais, as células de cultura em hPCCM sobre pratos pré-revestidas com gelatina a 0,1% e executar passagens em rotina uma vez a cada 5 dias, quer mecanicamente ou enzimaticamente. As células em placas a proporções na gama de 1: 6-1: 10. hPSCs anexar a gelatina dentro de 2 dias após a transferência. Substitua o meio com meio fresco diariamente.

5. Caracterização de células estaminais pluripotentes humanas

NOTA: Caracterizar hPSCs usando vários métodos, tais como a coloração da fosfatase alcalina, imunocitoquímica,-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e transferência de western.

1. Imunofluorescência
   1. Para immunofluorescence de coloração, hPSCs cultura e fixar as células em câmaras de 8 poços de deslizamento com 4% (w / v) de paraformaldeído durante 10 min; em seguida, as células permeabilizadas com 0,1% (v / v) de Triton-X100 durante 15 min, e bloquear as células durante 1 h com 3% (v / v) de soro de cavalo normal em PBS contendo 0,1% (v / v) de Tween- 20. Lave PBS duas vezes durante 5 minutos entre cada passo.
   2. Incubar as células com o anticorpo primário (Oct-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluição de 1: 1000) O / N a 4 ° C e com o anticorpo secundário.
   3. Antes da montagem, incubar as células com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 5 min no escuro. Lavar as células rigorosamente três vezes durante 5 min cada e secos completamente, as células no escuro. Preservar as células na fluorescência meio de montagem e observá-los sob um microscópio de fluorescência.
2. qRT-PCR
   1. Isolar o ARN total a partir de células utilizando um kit RNeasy Mini acordo com as especificações do fabricante e quantificar o ARN extraído utilizando um Espectrofotómetro Nano gota.
   2. Sintetizar ADNc por adição de 2 ug de ARN total para a 20 ul de mistura de reacção contendo o oligo (dT) e iniciadores de transcriptase reversa Superscript II; siga as instruções do fabricante no presente processo.
   3. Amplificar o cDNA sintetizado com um sistema iQ Bio-Rad iCycler, usando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e as sequências de primers descritos na Tabela Suplementar S1. Normalizar os valores de limiar de ciclo dos genes de interesse para os da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH).
3. A fosfatase alcalina (AP) coloração
   1. Detectar a atividade AP usando o celular ES Caracterização Kit, de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. No dia 5, aspirar a mídia e corrigir os hPSCs com paraformaldeído a 4% em PBS durante 12 min. Não overfix; que fixa as células durante mais de 2 minutos resultará na inactivação de fosfatase alcalina. Aspirar o fixador e lavar com 1x Rinse Buffer. Nãopermitir que os poços sequem entre etapas.
   3. Adicionar solução de coloração suficiente para cobrir cada poço (1 ml por poço de um prato de 35 mm). Incubar as placas no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Após a incubação, lavar pratos com 1x lavagem com tampão. Células de cobertura com 1x PBS para evitar a secagem e examinar e imagem das células marcadas utilizando um microscópio Olympus.
4. Western Blot
   1. Realizar a análise Western blot, conforme descrito anteriormente em ^9. Resumidamente, a determinação das concentrações de proteína em lisados ​​celulares. Resolver quantidades iguais de proteína sobre uma electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) em gel de dodecilsulfato de sódio e transferir as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF).
   2. Bloquear a blot e sonda que O / N com anticorpos primários diferentes a 4 ° C; subsequentemente incubar a mancha com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 hora. Lava-se a membrana três vezes durante 10 min de cada vez entre incubações. Detectar sinais usando um reagente ECL.
5. Curto Repita Tandem (STR) Análise
   1. hPSCs foram colhidas a partir do controle e os grupos experimentais na mesma passagem. O ADN genómico foi extraído usando um kit de ADN Micro, de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Amplificar o ADN genómico de 16 loci genéticos diferentes usando o Kit AMPF / STR Amplificação por PCR, de acordo com as especificações do fabricante e electroforese capilar foi realizada utilizando um analisador genético.

Resultados

Uma vantagem deste método de propagação HPSC é que ele utiliza componentes segregadas a partir de células humanas. Um passo mais ciritical no protocolo é o isolamento e cultura de células derivadas da placenta humana. Isto requer a dissecção precisa e de uma parte exacta da placa HPC vilosidades. A Figura 1 mostra o procedimento para o isolamento de células derivadas da placenta humana. Este processo é simples e conveniente para o isolamento de células, e pode ser facilmente realizada dentro de 1 hora. ...

Discussão

Este modelo foi desenvolvido para propagar com sucesso hPSCs, mantendo ao mesmo tempo as suas características, em condições humanizadas de cultura isento de alimentação, sem a adição de factores de crescimento exógenos, tais como recombinantes de bFGF ou insulina, permitindo a manipulação de hPSCs num microambiente humanizado. Suplementação exógena bFGF é comum e a aplicação de substratos, tais como Matrigel ou laminina é essencial para a cultura livre de alimentador de hPSCs ^14.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mitomicina-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μ g/ml
Kit de detecção de micoplasma	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatina	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Ciclina	Roche	799 050	10 μ g/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
Kit de Caracterização de Células ES	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® Kit DNA Micro	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® Kit de amplificação de PCR	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Analisador Genético	Biosistemas Aplicados Inc.

Espectrofotômetro de Gota Nano 4322288