A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Resumo

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

Resumo

A propagação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em meio condicionado derivado de células humanas em condições de cultura livre de alimentador tem sido de interesse. No entanto, um método ideal de propagação livre de alimentador ex vivo humanizado para hPSCs não foi desenvolvido; atualmente, substratos exógenos adicionais, incluindo o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), um fator mestre de sustentação de hPSC, são adicionados a todos os meios de cultura e substratos sintéticos, como Matrigel ou laminina, são usados em todas as culturas livres de alimentador. Recentemente, nosso grupo desenvolveu um protocolo simples e eficiente para a propagação de hPSCs usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em uma placa revestida de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSCs. Este protocolo não foi relatado anteriormente e pode permitir que os pesquisadores propaguem hPSCs de forma eficiente em condições de cultivo humanizado. Além disso, esse modelo evita os riscos de contaminação por hPSC por produtos de origem animal, como vírus ou proteínas desconhecidas. Além disso, este sistema facilita a produção em massa de hPSCs usando o revestimento de gelatina, que é simples de manusear, diminui drasticamente os custos gerais de manutenção ex vivo de hPSC.

Introdução

O objetivo deste protocolo é a propagação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em condições totalmente humanizadas ex vivo livres de alimentador, sem a necessidade de suplementação exógena adicional e substratos sintéticos. Até o momento, o desenvolvimento de modelos de cultura de hPSC ex vivo, que permitem a introdução de produtos de cultura na clínica, tem sido uma grande preocupação na pesquisa com células-tronco. Especificamente, dois problemas críticos precisam ser resolvidos. Primeiro, é necessário um sistema de cultura

Protocolo

Declaração de ética: O estudo da placenta humana foi realizado de forma prospectiva, com a aprovação do Comitê de Ética em pesquisa com seres humanos da Universidade da Coreia (AN09085-001). Todos os experimentos foram realizados em um livre de germes facilidade Clean Room no Centro Médico da Universidade da Coreia. O design e os procedimentos que utilizam hPSCs experimental foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Korea University Medical Center (AN12277-003).

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Brasão todos os pratos de cultura com 0,1% de gelatina. Autoclave salina tamponada com fosfato....

Resultados

Uma vantagem deste método de propagação HPSC é que ele utiliza componentes segregadas a partir de células humanas. Um passo mais ciritical no protocolo é o isolamento e cultura de células derivadas da placenta humana. Isto requer a dissecção precisa e de uma parte exacta da placa HPC vilosidades. A Figura 1 mostra o procedimento para o isolamento de células derivadas da placenta humana. Este processo é simples e conveniente para o isolamento de células, e pode ser facilmente realizada dentro de 1 hora. .......

Discussão

Este modelo foi desenvolvido para propagar com sucesso hPSCs, mantendo ao mesmo tempo as suas características, em condições humanizadas de cultura isento de alimentação, sem a adição de factores de crescimento exógenos, tais como recombinantes de bFGF ou insulina, permitindo a manipulação de hPSCs num microambiente humanizado. Suplementação exógena bFGF é comum e a aplicação de substratos, tais como Matrigel ou laminina é essencial para a cultura livre de alimentador de hPSCs ^14.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mitomicina-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μ g/ml
Kit de detecção de micoplasma	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatina	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Ciclina	Roche	799 050	10 μ g/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
Kit de Caracterização de Células ES	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® Kit DNA Micro	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® Kit de amplificação de PCR	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Analisador Genético	Biosistemas Aplicados Inc.

Espectrofotômetro de Gota Nano 4322288