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Artigo de método

Purificação de embarcações do cérebro do rato

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DOI:

10.3791/53208

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10 de novembro de 2015

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo que permite a purificação do compartimento vascular do cérebro do camundongo. Os vasos cerebrais isolados incluem células endoteliais ligadas por junções apertadas e cercadas por uma lâmina basal contínua, pericitos, células musculares lisas vasculares, bem como membranas astrogliais perivasculares.

Resumo

No cérebro, a maior parte do sistema vascular consiste de uma barreira selectiva, a barreira sangue-cérebro (BBB) ​​que regula a permuta de moléculas e células do sistema imunológico entre o cérebro e o sangue. Além disso, a enorme demanda metabólica neuronal requer um regulamento momento-a-momento de fluxo sanguíneo. Notavelmente, anormalidades destes regulamentos são características etiológicos da maioria das patologias cerebrais; incluindo o glioblastoma, acidente vascular cerebral, edema, epilepsia, doenças degenerativas (ex: doença de Parkinson, doença de Alzheimer), tumores cerebrais, bem como das condições inflamatórias tais como esclerose múltipla, meningite e disfunções cerebrais induzidas por sepsia. Assim, a compreensão dos eventos de sinalização que modulam a fisiologia vascular cerebral é um grande desafio. Muito conhecimento sobre as propriedades moleculares e celulares de vários tipos de células que compõem o sistema vascular cerebral pode ser adquirida a partir da cultura primária ou separação de células a partir de tecido cerebral dissociado recentemente. Contudo,Propriedades tais como polaridade celular, a morfologia e as relações intercelulares não são mantidos em tais preparações. O protocolo que se descrevem aqui é concebido para purificar fragmentos dos vasos do cérebro, ao mesmo tempo manter a integridade estrutural. Mostra-se que os vasos isolados são constituídos por células endoteliais seladas por junções apertadas, que são rodeadas por uma lâmina basal contínua. Pericitos, células musculares lisas, bem como as membranas de astrócitos endfeet perivasculares permanecem ligados à camada endotelial. Finalmente, nós descrevemos como a realização de experimentos de positividade em vasos cerebrais purificados.

Introdução

O funcionamento adequado do sistema nervoso central (SNC) requer um ambiente extracelular altamente regulada, e as demandas metabólicas são enormes em comparação com outros órgãos 1. O SNC também é extremamente sensível a uma vasta gama de produtos químicos, geralmente inofensivo para órgãos periféricos, mas a ela, neurotóxica. Para assegurar um funcionamento correcto, a maior parte do "vasculatura SNC forma uma barreira endotelial; a barreira sangue-cérebro (BBB), que controla o fluxo de moléculas e iões, bem como a passagem de células do sistema imunológico entre o sangue e o cérebro, mantendo assim a homeostase devida 2, mas também limitar a entrada de drogas terapêuticas, os tratamentos que impedem assim de distúrbios neurológicos 3. Ao nível celular, a certificação é sustentada principalmente por extensos junções apertadas entre as células endoteliais, expressão polarizada de transportadores de efluxo e uma taxa muito baixa transcitose 4. Propriedades e as funções da certificação são principalmente induzida por NEcélulas ighboring 4. Em particular, pericitos desempenhar um papel importante na indução e manutenção da certificação 5,6. Sendo células contrácteis, pericitos também regular o fluxo sanguíneo como fazem os 7 células de músculo liso circundantes grandes vasos. Finalmente, astrócitos, as principais células gliais do cérebro, enviar grandes processos chamados endfeet em torno da maioria da vasculatura cerebral 8 e modula a certificação integridade e quiescência imune 9, a transferência de metabolitos para neurónios de 10, e induzir o acoplamento apertado entre a actividade neuronal e o fluxo de sangue 11,12.

A capacidade para estudar as propriedades moleculares e celulares do sistema vascular cerebral é crucial para caracterizar melhor a sua contribuição para a fisiologia do cérebro e fisiopatologia. Para fazer face a esta questão, as estratégias para isolar sistema vascular cerebral do cérebro têm sido desenvolvidos, que permitem a preparação de fragmentos de vasos cerebrais intactas. Cerebral navio purification foi inicialmente descrita usando cérebros de bovinos 13 e melhorado e adaptado para outras espécies, em particular roedores 14. Neste último estudo, a utilização de filtros de tamanho variável foi introduzido para separar vasos cerebrais em fracções enriquecidas em recipientes de diferentes diâmetros. Curiosamente, em tais preparações, as células endoteliais mantiveram suas propriedades metabólicas 15, funcionalidade transportador 16 e 17 de polarização. Aqui, descrevemos detalhadamente este protocolo e ainda demonstrar que os navios isolados reter a maior parte de seu em estruturas in situ. As células endoteliais permanecem ligados por junções apertadas e rodeado por uma lâmina basal contínua. Pericitos e células musculares lisas permanecem ligadas à camada endotelial, bem como as membranas de astrócitos perivasculares. No entanto, astrócitos, células microgliais, neurónios e os oligodendrócitos são eliminados. Finalmente, descreve-se um procedimento para executar imunocoloração em vasos cerebrais isoladas.

Até agora a maioria dos estudos moleculares e celulares relacionadas com o sistema cerebrovascular foram realizados em células dos vasos cerebrais purificados dissociadas utilizando estirpes repórter do mouse específicos de células ou procedimentos baseados imunocoloração 18,19 classificando-célula. Embora estas técnicas permite o isolamento de populações de células vasculares cerebrais quase puros, células isoladas perder completamente a sua morfologia in situ e interacções, que por sua vez, afecta grandemente as suas propriedades moleculares e celulares. O protocolo aqui descrito, permitindo o isolamento de fragmentos cerebrovasculares inteiras sem a necessidade de anticorpos específicos ou manchas de ratinhos transgénicos, oferece uma boa alternativa, a estrutura global dos vasos cerebrais isoladas é conservada, assim, diminuir repercussões sobre as suas propriedades moleculares. Isolado navios poderiam, então, ser usado para estudar a atividade do gene, a síntese de proteínas e regulação no BBB, como recentemente descrita 20,21 . Finalmente, em relação ao laser captura microdissection 22,23 o presente protocolo é barato, fácil de executar e rapidamente adaptável em qualquer laboratório.

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Protocolo

1. Soluções e Materiais

  1. Preparar soluções de vasos isolamento: B1, adicionar 1,5 mL de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, adicionar 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, adicionar 1 g de BSA para 100 ml de B1.
  2. Modificar o suporte do filtro cortando o fundo fora da parte superior de enroscar.
  3. Preparar soluções de positividade: solução de fixação, paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4; Permeabilização / solução de bloqueio, soro de cabra diluído a 5% e Triton X100 a 0,25% em PBS pH 7,4.
    Nota: Fixação depende do tipo de anticorpos primários usados.

2. Dissecção

Nota: As condições estéreis não são requeridos, a menos que os navios são usados ​​para fins de cultura de células.

  1. Prepara-se uma proveta de 150 ml com 20 ml de B1. Manter em gelo e cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar.
  2. Profundamente anestesiar o mouse sob um capuz com uma pequena toalha de papel embebido em 1 ml de isoflurano pura que é adicionado into da gaiola. A anestesia é verificada pela ausência de reacção com uma pitada do dedo do pé. Matar o rato por deslocamento cervical.
    NOTA: Estes passos são realizados em conformidade com os regulamentos nacionais e institucionais.
  3. Opcional: realização de perfusão intracardíaca com 20 ml de PBS 1x para eliminar o teor de sangue 24.
  4. Seção da pele com um bisturi do pescoço até o nariz e puxe-o para longe. Remove todos os cabelos contaminantes com PBS 1x.
  5. Para abrir o crânio, insira primeiro tesoura anteriormente ao bulbo olfatório, e abrir a tesoura para romper o crânio em duas partes.
  6. Retire cuidadosamente o cérebro usando uma espátula cérebro. Dissecar o plexo coróide dos ventrículos laterais, pois iria contaminar a preparação do vaso sanguíneo 38.
    NOTA: Opcional: A preparação final conterá parênquima e vasos meninges. Se não for desejado, meninges pode ser removida seguindo o procedimento descrito por 38.
  7. Transfer o cérebro em o copo contendo solução B1 no gelo. Até 8 cérebros pode ser tratado em conjunto.

3. A homogeneização do tecido cerebral

  1. Usando dois bisturis, manualmente e vigorosamente bateu o cérebro na solução B1, posteriormente, obter pequenos pedaços de cerca de 2 mm.
  2. Homogeneizar a preparação com um homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 passagens a 400 rpm. Assegure-se que o tubo de vidro é mantido em gelo e que a parte superior do douncer está em solução quando se deslocam para baixo e para cima, de modo a evitar a formação de bolsas de ar. Se várias amostras são preparadas, lavar a douncer com água ionizada entre cada homogeneização.

4. Purificação Vessel

  1. Transferir o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 ml e proceder à centrifugação a 2000 g durante 10 min a 4 ° C. Um grande interface de branco (na maior parte da mielina) irá formar na parte superior do vaso de pelete (vermelho, se não de perfusão foi realizada).
  2. Desprezar o sobrenadante. O sedimento navio e da interface branca irá permanecer solidários juntos. Adicionar 20 ml de solução B2 gelada e agitar o tubo manualmente e vigorosamente durante 1 min.
  3. Proceda à segunda centrifugação a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. A mielina irá agora formar uma camada branca densa na superfície do sobrenadante.
  4. Retirar cuidadosamente a camada de mielina de as paredes do tubo, segurando o tubo e rodando-a lentamente para permitir que o sobrenadante a passar ao longo das paredes. Descartar o sobrenadante com mielina. O sedimento contendo os vasos permanece presa na parte inferior do tubo.
  5. Seque a parede interior do tubo com um papel absorvente enrolada em torno de uma pipeta de plástico de 5 ml e remover todos os fluidos residuais, evitar tocar o sedimento navio. Manter o tubo de cabeça para baixo sobre um papel absorvente para drenar o líquido remanescente.
  6. Suspender o sedimento em 1 ml de solução B3 gelada por pipetagem cima e para baixo com dicas de baixa ligação, keeping o tubo em gelo, em seguida, adicionar mais 5 ml de solução B3. Certifique-se de que os navios são dispersas, tanto quanto possível e não formam agregados.

5. Filtration

  1. Prepara-se uma proveta em gelo com 30 ml de solução B3 gelada. Cubra com filme plástico para evitar a contaminação do ar.
  2. Colocar um filtro de malha 20 uM sobre um suporte de filtro modificado na parte superior de um frasco de Becker e equilibrar através da aplicação de 10 ml de solução B3 gelada.
  3. Verter a preparação navio no filtro e lavar os vasos com 40 ml de solução B3 gelada.
  4. Recuperar o filtro usando uma pinça limpa e mergulhe-o imediatamente no copo contendo a solução B3. Retire os navios do filtro sacudindo-o suavemente.
  5. Verter o conteúdo do copo num tubo de plástico de 50 ml e centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.
  6. Nota: Como alternativa, a suspensão dos vasos cerebrais 'a partir do passo 4.6 pode ser filtrado sobre um filtro de malha 100 micrometros de.Neste caso, navios maiores são preferencialmente retidos no filtro enquanto o fluxo através contém principalmente microvasos (capilares), que são, em seguida, filtrada através de um filtro de 20 fim mesh como acima.
  7. Ressuspender o sedimento de microvasos em 1 ml de solução B3 gelada e transferi-lo, pipetando-o para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.

6. Fixação, permeabilização e bloqueio

  1. Vasos de transferência por pipetagem em tubos de PCR de 0,2 ml contendo PBS usando um 1,0 ml baixa ponta de ligação. Tenha cuidado para não tocar os vasos, pois podem aderir à parte exterior da ponta. Executar todas as etapas a seguir em um microscópio binocular.
  2. Para cada um dos seguintes mudanças de meio, deixar os tubos em gelo até os vasos ter atingido o fundo, e pipetar a maior parte dos líquidos usando longos e coisa gel de carregamento de pontas de pipeta.
  3. Remover a maior parte do PBS e adicionar 200 ul de solução fixadora.Suspender os vasos agitando suavemente e incuba-se durante 20 min à TA.
  4. Pipeta a solução fixadora e substituí-la por 200 mL de 1x PBS (primeira lavagem), incubar durante 5 min a RT e repita esta etapa 3 vezes. Cada vez, verificar que os navios tenham correctamente depositada no fundo dos tubos e pipeta fora 1x PBS, garantindo os vasos não são tocados.
  5. Após a última lavagem, substitua por PBS 1x / solução de permeabilização de bloqueio e incubar 1 hora à TA, ressuspensão dos vasos, agitando suavemente ao longo do tempo.

7. Immunostaining

  1. Substitua o / bloqueio solução de permeabilização com a mistura de anticorpos primários (ver referências dos anticorpos usados ​​aqui e diluições na tabela modelo de Materiais) diluído na / solução de bloqueio permeabilização, e incubar a 4 ° CO / N.
  2. Após 3 lavagens em PBS, à TA, incubar os vasos com a mistura de anticorpos secundários diluído em PBS durante 2 hà TA.
  3. Nota: recomendamos a realização de coloração nuclear com Hoechst (1: 2.000) ou DAPI (1: 2.000), a fim de distinguir os navios de possíveis contaminantes cabelos ou poeiras sob o microscópio.
  4. Após 3 lavagens em PBS, ressuspender os vasos em 50 ul de PBS.

8. Montagem e Observação

  1. Prepare uma ponta com um capilar de vidro siliconizada: cortar uma ponta de pipeta P200 utilizando um bisturi e ajustar o capilar no interior. O volume aproximado do tubo capilar é de 40 ul.
  2. Transferir os recipientes para uma lâmina de vidro usando o capilar de vidro siliconizada e cuidadosamente remover o líquido com um pedaço de papel absorvente.
  3. Aplicar uma única gota de meio de montagem para os navios e mantenha uma lamela a 45º permitindo que a gota espalhar-se ao longo da borda do deslizamento. Vamos sair da lamela e permitir meio para espalhar lentamente. Deixá-lo seco O / N à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Os navios podem ser observados sob uma fluoresmicroscópio confocal ent.

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Resultados

Aqui, descrevemos um protocolo permitindo o isolamento mecânica dos vasos cerebrais 14. Figura 1 resume as principais etapas desta técnica. A arquitetura dos vasos cerebrais é complexa e inclui vários tipos de células, isto é, células endoteliais seladas por junções apertadas e pericitos, rodeados por células de músculo liso, e os processos de astrócitos do pé 9. Assim, após o isolamento dos vasos cerebrais, que teve como objetivo caracterizar a estrutura dos vasos purific...

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Discussão

A barreira sangue-cérebro regula a passagem de substâncias fisiológicas dentro e fora do sistema nervoso central e o protege contra substâncias potencialmente nocivas presentes no sangue. Ele está envolvido em várias patologias do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas 2 e tumores cerebrais 28. A baixíssima permeabilidade da certificação também dificulta a passagem de agentes terapêuticos que visam células neurais e ao desenvolvimento de métodos que pretendem abrir reversível a certificação sem ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Labex MemoLife e pelo ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en placas)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Moedor de Tecidos Tamanho CCentrífuga Thomas scientific3431E25
5415  REppendorf
centrífuga 5810 REppendorf5811000320
Estereomicroscópio modular de alto desempenhoLeicaMZ6
fornece Leica LED1000 de alta qualidadeLeicaLED1000
pontas de baixa ligação (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm porta-filtro PP 8/PkMilliporeSX0004700
Disco de filtro de rede de nylon Hidrofílico 20 µ m 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Disco de filtro de rede de nylon Hidrofílico 100 µ m 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Tubo de Borosilicato de Parede PadrãoInstrumento SutterB150-86-7.5
Lâminas de MicroscópioThermo Scientific1014356290F
Lamínulas, Espessura 1Thermo ScientificP10143263NR1
Tubos de parede fina de 0,2 ml e tampa abobadadaThermo ScientificAB-0266
  PARAFILM M (tamanho do rolo 4 pol. &vezes; 125 pés)SigmaP7793-1EA
HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenolTecnologia de vida14175-129
HEPES (1M)Tecnologia de vida15630056
Dextrano de Leuconostoc spp. Sr. ~70.000Sigma31390
Albumina de soro bovinoSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldeído (p/v), sem metanol Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimida H 33342 tricloridrato (Hoechst)Sigma14533
Meio de montagem Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectina GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugado; Diluição 1/100Life technologyI21411
Agrin (coelho); diluição 1/400gentilmente cedida pelo Dr. Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100diluição 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547  diluição 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893  diluição 1:500
Anti AQP4 (coelho)SigmaA5971  diluição 1:500
Anti Cx43 (camundongo, Clone  2)BD Biosciences610061  diluição 1:500
Anti Olig2 (coelho)MilliporeAB9610  diluição 1:200
Anti NF-M (camundongo)fornecido pelo Dr. Beat M. Riederer, Universidade de Lausanne, Suíça.  diluição 1:10
Anti Iba1 (coelho)Wako019-19741  diluição 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029  diluição 1:2.000
Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488Tecnologia de vidaA11034  diluição 1:2.000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424  diluição 1:2.000
Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 555Tecnologia de vidaA21429  diluição 1:2.000
O sistema compacto

Referências

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