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Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

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DOI:

10.3791/53217

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13 de novembro de 2015

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos uma modificação de um método relatado anteriormente que permite o isolamento de mitocôndrias purificadas e de alta qualidade de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo. Este procedimento resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com alta função durante ensaios respiratórios baseados em microplacas.

Resumo

Disfuncionais mitocôndrias do músculo esquelético desempenha um papel no metabolismo alterado observado com o envelhecimento, obesidade e diabetes tipo II. Ensaios respirométricos mitocondriais isoladas a partir de preparações mitocondriais permitir a avaliação da função mitocondrial, bem como a determinação do mecanismo (s) de acção de drogas e proteínas que modulam o metabolismo. Procedimentos de isolamento atuais requerem muitas vezes grandes quantidades de tecido para produzir mitocôndrias de alta qualidade necessários para ensaios respirométricos. Os métodos aqui apresentados descrevem como de alta qualidade mitocôndrias purificadas (~ 450 mg) pode ser isolado a partir de quantidades mínimas (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético para utilização em medições respiratórias alto rendimento. Nós determinamos que nosso método de isolamento produz 92,5 ± 2,0% mitocôndrias intacto medindo atividade da citrato sintase espectrofotometria. Além disso, a análise de Western blot em mitocôndrias isoladas resultou na expressão fraca da cytosoproteína lic, GAPDH, e a expressão robusta da proteína mitocondrial, COXIV. A ausência de uma banda proeminente GAPDH nas mitocôndrias isoladas é indicativo de pouca contaminação a partir de fontes não-mitocondriais durante o procedimento de isolamento. Mais importante ainda, a medição da taxa de consumo de O2 com a tecnologia de micro-placa de base e a determinação do índice de controlo respiratório (RCR) para ensaios respirométricos acoplados mostra altamente acopladas (RCR;> 6 para todos os ensaios) e mitocôndrias funcionais. Em conclusão, a adição de um passo de picagem separado e reduzindo significativamente accionada por motor de velocidade de homogeneização de um método previamente relatado que permitiu o isolamento de alta qualidade e de mitocôndrias purificadas a partir de pequenas quantidades de rato músculo esquelético que resulta em mitocôndrias altamente acopladas que respiram com elevada função durante microplacas ensaios respirometirc.

Introdução

A principal função das mitocôndrias é produzir ATP a partir da fosforilação oxidativa. No entanto, as mitocôndrias têm muitas outras funções celulares importantes, incluindo, mas não se limitando a: a produção e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, a regulação do cálcio citoplasmático e mitocondrial, o tráfego de organelas, a homeostase iônica e o envolvimento na apoptose1,2. Portanto, não é surpreendente que as mitocôndrias disfuncionais desempenhem um papel em muitas patologias de doenças, como envelhecimento, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, câncer, obesidade e diabetes3,4. É importante ressaltar que as mitocôndrias do músculo esquelético estão especificamente envolvidas em muitas dessas patologias3-5.

Os ensaios de respiração mitocondrial usando mitocôndrias isoladas permitem a avaliação da cadeia de transporte de elétrons e da função de fosforilação oxidativa, e a determinação do(s) mecanismo(s) de ação de drogas e proteínas que modulam o metabolismo. Existem procedimentos de isolamento mitocondrial para vários tipos de tecidos e células para uma variedade de espécies6,7. No entanto, esses procedimentos geralmente requerem grandes quantidades de tecido/células para um rendimento mitocondrial de alta qualidade necessário para ensaios respirométricos clássicos.

Os ensaios respiratórios baseados em microplacas permitem medições de alto rendimento usando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas, geralmente apenas alguns μg por poço8. Portanto, apresentamos uma modificação dos métodos publicados anteriormente7 para permitir que mitocôndrias de alta qualidade sejam isoladas de quantidades menores de músculo esquelético de camundongo para uso em ensaios respiratórios baseados em microplacas. Além disso, são fornecidos métodos para estabelecer a qualidade da preparação do isolamento mitocondrial e a integridade das membranas mitocondriais. Dado que as mitocôndrias do músculo esquelético estão envolvidas em muitas condições patológicas, a medição do consumo deO2 em estudos mecanicistas está se tornando mais prevalente na pesquisa biomédica9,10.

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Protocolo

Os estudos em animais foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care e usar Comité na Virginia Polytechnic Institute e State University.

1. Instalação (Time: ~ 45 min)

  1. Lojas de congelados descongelamento de tripsina a 0,25%, tampão de isolamento para mitocôndrias (IBM) 1 e IBM2 em um banho de água a 37 ° C.
  2. Enxágüe copos e instrumentos de dissecação em etanol a 70%, seguido por água de alta pureza.
  3. Preparar a solução de tripsina a 0,05% a partir de 0,25% estoque de tripsina diluindo 1 parte de tripsina em 4 partes IBM1.
  4. Misturar protease e fosfatase cocktail inibidor com tampão de lise celular (1: 100 rácio) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca.
  5. Alíquotas de 5 ml (5 ml / rato) de tripsina a 0,05% para um tubo de plástico de 15 ml.
  6. Ajuste motorizado homogeneizador de tecidos a 80 RPM.

2. Isolamento de mitocôndrias Músculo Esquelético (Tempo: ~ 90 min)

  1. Euthanize um rato por CO 2 inalação, seguido por deslocação cervical.
  2. Remover músculo vermelho do músculo gastrocnémio e quadríceps, que inclui o sóleo (~ 75-100 mg no total) tal como descrito nas etapas a seguir:
    1. Descasque a pele para o mouse.
    2. Remova a almofada de gordura sobre o ponto de origem do quadríceps. Corte o tendão do quadríceps que está ligado à patela com uma tesoura de ponta fina.
      Nota: O quadríceps é identificado por sua posição anatômica na porção anterior do fêmur proximal.
    3. Lentamente cortar o aponeurosis entre o osso e os quadríceps, evitando a artéria femoral, para libertar os quadríceps do osso. Corte o tendão com uma tesoura de ponta fina no ponto de origem no fêmur para liberar o músculo quadríceps e coloque o músculo quadríceps em refrigerados PBS.
    4. Remover o tecido adiposo visível sobre o quadríceps com uma tesoura. Virar o quadríceps de forma que a parte do músculo que se recobre o fémur é virado up. Abra o músculo quadríceps com uma pinça em um movimento de ventilação. Retire as duas porções musculares vermelhas visíveis de cada lobo com uma tesoura de ponta fina e coloque em um copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1.
      Nota: músculo quadríceps aparecem como dois lobos com uma tira de músculo vermelho localizado perto da borda lateral de cada lóbulo.
    5. Corte a pele que recobre o tendão de Aquiles com tesouras com ponta fina e descascar a pele na direção do mouse. Cortar o tendão de Aquiles exposta e descasque o músculo em direcção ao corpo do rato.
    6. Corte o tendão no côndilos lateral e medial do fêmur com uma tesoura de ponta fina para libertar o gastrocnêmio e coloque o gastrocnêmio anexado aos seus tendões em refrigerados PBS.
    7. Virar o gastrocnêmio sobre e descolar o músculo sóleo e coloque no copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1. Fan abrir o gastrocnêmio. Remova os três porções visuais vermelhas musculares (duas tiras vermelhas lateral e um medial superficial) com tesoura de ponta finas e transferi-los para o copo contendo 5 ml de refrigerados IBM1.
  3. Remover outro ~ 75-100 mg de vermelho de músculo a outra perna do rato (conforme descrito no passo 2.2) e colocar num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com protease e fosfatase cocktail inibidor e tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodecil sulfato de sódio, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Imediatamente piscar-congelar esta segunda amostra em azoto líquido para posterior utilização em transferência Western (ver passo 6.1).
  4. Colocar uma superfície de plástico pré-gelada, plana sobre gelo em um balde grande. Pour uma gota de IBM1 sobre a superfície de plástico e utilizar uma pinça para colocar todo o músculo vermelho segmentado (passo 2.2.4 e 2.2.7) em IBM1 gota. Picar o tecido muscular durante 2 minutos usando 3 individuais lâminas de barbear borda, alterando lâminas de barbear a cada 40 seg.
  5. Transferir o tecido moído para um novo recipiente com 5 ml de IBM1 fresco, mantendo a superfície de plástico sobre o the proveta e raspando o músculo para a proveta com uma lâmina de barbear. Tome esta solução e drená-lo através de um filtro de células 100 mm colocados em um tubo de 50 ml.
  6. Seque o tecido com um limpador tarefa delicada e, em seguida, transferi-la para 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. Use pinças para remover o tecido a partir da tarefa do limpador.
  7. Incubar o tecido muscular em gelo durante 30 min em solução de tripsina a 0,05%.
  8. Rodar as tubo de 15 ml contendo mistura de tripsina / músculo a 200 xg durante 3 min a 4 ° C.
  9. Despeje o sobrenadante tripsina em um recipiente de resíduos e ressuspender o sedimento com 3 ml de gelo frio IBM1. Transferir o tecido para um tubo de 45 ml homogeneizador de vidro. Lavar as 15 ml tubo cônico com mais 1,5 ml IBM1 para recolher qualquer amostra restante e adicione ao tubo de homogeneizador de vidro.
  10. Colocar o tubo homogeneizador de vidro para um copo ou recipiente de plástico a meio caminho cheio de gelo de modo que o homogeneizador de vidro move-se minimamente no interior da taça.
  11. Homogeneizar a mistura tecido / IMB1 com o pilão de PTFE ligados a um homogeneizador de tecido accionada por motor com 10 passagens a 80 rpm. Segure a parte inferior de cada passagem para ~ 2 seg.
  12. Transferir o homogeneizado de tecido para um novo tubo de 15 mL cónico e enxaguar o tubo homogeneizador de vidro com 6,5 ml de IBM1. Verter a IBM1 para dentro do tubo cónico de 15 ml contendo homogeneizado de tecido.
  13. Girar o tubo de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Delicadamente despeje o sobrenadante para um tubo de centrífuga de alta resistência vidro e descartar o pellet.
  14. Girar o sobrenadante do passo anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  15. Remover o sobrenadante e re-IBM1 suspender o sedimento, adicionando-se lentamente 500 ul de IBM2. Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e homogeneizar suavemente o sedimento em IBM2 com mistura e agitação movimentos. Adicionar mais 4,5 ml de IBM2 à mistura após a pelete é totalmente suspenso.
    Nota: Evite trituração excessiva ao quebrar pedaços maiores de pelotas como tHis pode danificar as membranas mitocondriais.
  16. Girar o homogenato / tecido IBM2 a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Esta etapa pode ser repetida num tubo de centrífuga limpo de alta resistência, para a quantificação mais precisa da proteína de mitocôndrias isoladas no Passo 4, uma vez de BSA residual pode contribuir para o conteúdo de proteína total.
  17. Remover o sobrenadante e suavemente, mas completamente re-suspender o sedimento, adicionando dois incrementos de 25 ul de IBM2 com uma ponta de pipeta com a ponta cortada. Agitar suavemente o sedimento e misturar após cada adição de 25 ul de IBM2. Coloque este estoque mitocondrial no gelo.

3. A homogeneização da Whole Tissue Lysate (Tempo: ~ 45 min; pode ser feito durante Passo 7)

  1. Remover o músculo do que foi colocada em azoto líquido a partir do passo 2.3 e incubar à temperatura ambiente até estarem completamente descongelados.
  2. Picar o tecido para ~ 30 segundos em gelo com uma tesoura de ponta fina.
  3. Adicione duas colheres de 100 ul de ZircoÓxido nio Beads para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de rosca a partir do passo 3.2 que contém o tecido picada. Homogeneizar o tecido em um homogeneizador de tecidos moinho de esferas usando dois a três ciclos de 5 min a uma velocidade de 4-6 configuração (ajuste médio).
  4. Girar-se a mistura a partir do passo 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante utilizando uma ponta de pipeta de 1.000 ul, após a centrifugação e transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Desprezar o pelete e colocar o sobrenadante em gelo.

4. Determinação da proteína (Tempo: ~ 30 min)

  1. Determinar a concentração de proteína de lisado de todo o tecido (passo 3.4) e da mitocondrial (passo 2.17) utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA de acordo com as especificações do fabricante.

5. As mitocôndrias Membrane Integridade; Citrato sintase (CS) Atividade (Tempo: ~ 15 min)

  1. Faça dois separados 1: 20 diluições do estoque mitocondrial em água de alta pureza. Adicionar0,1% de Triton X-100 para uma amostra e sonicate-lo em um nível baixo (765 Watts, amplitude de 2). Deixe a outra diluição no gelo. Recolocar a amostra de gelo após sonicação.
  2. Realizar um ensaio de citrato sintase tanto com a não-sonicada e sonicada diluições mitocondriais utilizando um ensaio espectrofotométrico conforme anteriormente descrito 11,12.
  3. Determinar a percentagem de membranas mitocôndrias intactas, utilizando as seguintes equações:
    (CS atividade não-sonicado ÷ sonicado atividade CS) * 100


100- N- (percentagem obtida a partir de cima)

6. As mitocôndrias Qualidade de isolamento; Western Blotting (Horário: De acordo com Lab Protocol)

  1. Realizar Western blotting em todo o lisado de tecido e mitocôndrias isoladas como anteriormente descrito 12.
    Nota: O uso de anticorpos primários para GAPDH (1: 1000 de diluição em 5% de BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1000 de diluição em 5% de gordura não-leite / TBS-T), seguido por anti-cabra, e anticorpos secundários de coelho, respectivamente (1: 10.000).

7. respirométrico Ensaio Run (Time: ~ 90 min)

  1. Realizar ensaios respirométricos desejados utilizando baseado O 2 tecnologia de medição do consumo de microplaca, como descrito anteriormente (ver artigo do companheiro e Rogers et al 8).
  2. Determinar a relação de controle respiratório (RCR) dividindo Estado 3 por Estado 4o (RCR) ou dividindo 3U Estado por Estado 4o. Use o (média) ponto médio, ou o mais elevado (estado 3) e taxas mais baixas (4o Estado) a partir de vestígios ponto-a-ponto ao determinar RCR.

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Resultados

Atividade da citrato sintase serve como uma medida para a integridade da membrana, uma vez sintase de citrato é localizado na membrana mitocondrial interna, e, portanto, não devem estar presentes nas suspensões de mitocôndrias com membranas intactas. A Figura 1 representa a actividade da sintase de citrato em amostras não sonicada mitocondriais em comparação com sonicada amostras do mesmo isolamento. Sonicando os resultados mitocôndria em um aumento estatisticamente significativo na atividade da citrato...

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Discussão

Os métodos aqui apresentados proporcionam uma descrição detalhada de um procedimento de isolamento de quantidades mínimas mitocondrial (~ 75-100 mg) de rato músculo esquelético. Este procedimento de isolamento é capaz de produzir alto funcionamento, as mitocôndrias puro (~ 450 mg) como evidenciado pela O2 taxas de consumo, valores RCR, atividade da citrato sintase máxima e expressão de proteína de immunoblotting. Importante, as mitocôndrias isoladas a partir deste processo pode ser usado para múltiplos ensaio...

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Divulgações

George Rogers é um funcionário da Seahorse Bioscience que produz o instrumento para o qual este protocolo foi modificado.

Agradecimentos

O Fralin Life Science Research Institute e o Metabolic Phenotyping Core da Virginia Tech apoiaram este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Essencialmente gordurosoSigma AldrichA6003N / A
livre de ácido - BSA
Tris / HClPromegaH5123N / A
KCLSigma AldrichP9541N / A
Tris BasePromegaH5135N / A
EDTASigmaAldrich E6511N / A
EGTASigma AldrichE4378N/A
SacaroseSigma AldrichS7903N/A
D-ManitolSigma Aldrich63559N/A
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho fenolThermo Scientific25200-056N/A
Cloreto de Sódio
Cristais Brancos ou Pó Cristalino
≥ 99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
Dodecil Sulfato de SódioSigma AldrichL3771 N/A
Desoxicolato de sódioSigma AldrichD6750 N/A
Éter nonilfenílico de polioxietileno (12), ramificadoSigma Aldrich238651N/A
de borda únicaFisher Scientific12-640N/A
Falcon- 100 uM Filtros de células de nylonFisher Scientific352360N/A
Halt Protease & Coquetel de inibidor de fosfatseThermo Scientific1861284N / A
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml com tampa de roscaThermo Scientific3474N / A
Grânulos de óxido de zircônioFisher ScientificC9012112N / A
anticorpo GAPDH (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
Anti- COXIV anticorpoCell Signaling4844sQualquer proteína mitocondrial da membrana interna será suficiente
Burro affinipure conjugado com Peroxidase, Anti Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N/A
Peroxidase conjugada affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific23225N/A
Ácido Pirúvico, 98%Sigma Aldrich107360Loja em 4 ° C,pH até 7.4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico
Ácido SuccínicoSigma AldrichS9512Armazene à temperatura ambiente, pH até 7.4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico
L(-) Ácido Málico, BioXtra, ≥ 95%Sigma AldrichM6413Armazene em temperatura ambiente, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico
Ácido L-glutâmicoSigma AldrichG1251Armazene em temperatura ambiente, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio respirométrico, a 7,4 com KOH antes de usar em ensaio
Cloreto de L-carnitina PalmitoilSigma AldrichP1645Armazene a -20 ° C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351Loja a -20 ° C
Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)Sigma AldrichC2920Loja em 2-8 ° C
fenilhidrazona
≥ 98% (TLC), pó [FCCP]
Antimicina A de streptomyces sp.Loja Sigma AldrichA8674a -20 ° C
Adenosina 5′-difosfato monopotássio sal desidratado [ADP]Sigma AldrichA5285Armazenar a -20 &graus; C, a 7,4 com KOH antes do uso no ensaio
RotenonaSigma AldrichR8875Armazenar em temperatura ambiente
Lâminas de barbear respirométrico respirométrico

Referências

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