Medindo Taxas de Herbicida Metabolismo em Dicot Weeds com um ensaio extirpado Folha

Resumo

Este manuscrito descreve como as taxas de metabolismo do herbicida podem ser efetivamente quantificadas com folhas excisadas de uma erva daninha dicotiledônea, reduzindo assim a variabilidade e removendo quaisquer possíveis efeitos de confusão da absorção ou translocação do herbicida normalmente observados em ensaios de plantas inteiras.

Resumo

A fim de isolar e determinar com precisão as taxas de metabolismo de herbicidas em uma erva daninha dicotiledônea de cruzamento obrigatório, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), desenvolvemos um ensaio de folha excisada combinado com uma estratégia de clonagem vegetativa para normalizar a absorção de herbicidas e remover a translocação como fatores contribuintes em populações de watercânhamo resistentes a herbicidas (R) e –sensíveis (S). As análises biocinéticas de pesticidas orgânicos em plantas geralmente incluem a determinação da absorção, translocação (entrega ao local-alvo), destino metabólico e interações com o local-alvo. O metabolismo de herbicidas é um parâmetro importante a ser medido em ervas daninhas resistentes a herbicidas e culturas tolerantes a herbicidas, e normalmente é realizado com testes de plantas inteiras usando herbicidas radiomarcados. No entanto, uma dificuldade com a interpretação dos parâmetros biocinéticos derivados de métodos de planta inteira é que a translocação é frequentemente afetada pelas taxas de metabolismo do herbicida, uma vez que os metabólitos polares geralmente não são móveis dentro da planta após as reações de desintoxicação do herbicida. As vantagens do protocolo descrito neste manuscrito incluem determinação reprodutível, precisa e rápida das taxas de degradação de herbicidas em populações R e S, uma diminuição substancial na quantidade de herbicida radiomarcado consumido, uma grande redução em materiais vegetais radiomarcados que requerem manuseio e descarte adicionais e a capacidade de realizar experimentos com herbicidas radiomarcados no laboratório ou na câmara de crescimento em vez de em uma estufa. À medida que a resistência a herbicidas continua a se desenvolver e se espalhar em populações de ervas daninhas dicotiledôneas em todo o mundo, o método de ensaio de folhas excisadas desenvolvido e descrito aqui fornecerá uma técnica inestimável para investigar a resistência baseada em locais não-alvo devido ao aumento das taxas de metabolismo e desintoxicação do herbicida.

Introdução

Resistência a herbicidas em ervas daninhas apresenta uma séria ameaça para a produção mundial de alimentos e fibras ^1,2. Atualmente, milhares de populações resistentes e biótipos de mais de cem espécies de plantas daninhas em todo o mundo têm sido documentadas e estudadas ^3. Um importante mecanismo que confere resistência a herbicida em plantas, é a alteração de herbicidas genes e proteínas do local-alvo, incluindo as mutações genéticas que afectam a cinética de ligação proteína-herbicida ou amplificação do gene-alvo local ^2. Desintoxicação metabólica via actividades elevados de mono-oxigenase citocromo P450 (P450) ou glutationa S -transferase (GST) enzimas é outro mecanismo que confere resistência a herbicidas em ervas daninhas, que é distinto de várias formas de mecanismos baseados em local de destino ^2. Resistência à base metabólica tem ramificações significativas para se os custos de fitness planta (aka sanções aptidão) pode resultar dos mechanis de resistência ao herbicidam, bem como em relação ao potencial para um único mecanismo de desintoxicação para conferir resistência cruzada ou de vários herbicidas em populações de plantas daninhas ^1,2,4. Geralmente, o metabolismo do herbicida em plantas pode ser dividida em três fases distintas ^5. Fase I envolve a conversão herbicida ou de activação tal como hidroxilação P450-mediada de anéis aromáticos ou grupos alquilo, ou por N - ou reacções de desalquilação O-, levando ao aumento da polaridade e herbicida parcial desintoxicação ^5,6. Recentemente introduzido grupos funcionais na Fase I podem proporcionar sítios de ligação para conjugação de glutationa reduzida por GSTs ou para glicose pelo glicosiltransferases UDP-dependentes na Fase II ^5,7. Por exemplo, o principal metabolito inicial de primi sul furão-metilo no milho é hidroxi-primi sul furão-metilo ^8, que pode ser posteriormente metabolizado para hidroxi-primisulfurão-glucósido (Fase II) e, em seguida, transportados para o vacúolo para armazenamento a longo prazo ou mais metabólica prócessamento ^5,6 (Fase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) é uma de difícil controle, dicot espécies de plantas daninhas anuais que dificulta a produção de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsutum) nos Estados Unidos. O alto grau de diversidade genética de waterhemp é facilitada pela sua biologia dióico e de longa distância vento polinização, e uma única planta waterhemp fêmea pode produzir até um milhão de sementes ^9. Estas sementes são pequenas e facilmente se espalhar, o que naturalmente dotar waterhemp com um mecanismo de dispersão eficaz. Waterhemp exibe germinação contínua durante todo o período de crescimento ^9, e suas sementes são capazes de germinar após vários anos de dormência. Waterhemp é uma planta _C 4 que possui uma taxa de crescimento mais elevada do que a maioria das ervas daninhas de folha larga em sistemas de culturas arvenses ^10. Além disso, numerosas populações waterhemp são resistentes a múltiplos famílias de herbicidas ^3.

Uma população de waterhemp (designado MCR) de Illinois é resistente à 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) herbicidas -inhibiting ^11, tais como a mesotriona, bem como a atrazina e acetolactato sintase (ALS) -inhibiting herbicidas, incluindo primi sul furão-metilo , devido à não-alvo do local mecanismos baseados ^12,13. Uma população diferente de waterhemp designado ACR ^14, que é-primi sul furão-metilo resistentes (devido a uma mutação no gene de ALS) e atrazina-resistentes, mas sensível a mesotriona, e uma população waterhemp designado WCS ¹⁴ que é sensível à primi sul furão-metilo, mesotriona, atrazina e foram usadas em comparação com MCR na nossa pesquisa anterior ¹² e experiências actuais (resumidas na Tabela 1). Estudos iniciais não detectaram alterações nos níveis de sequências genéticas HPPD ou expressão, ou reduzida absorção mesotriona, no MCRpopulação quando comparados com populações sensíveis à mesotriona ^12. No entanto, estudos de metabolismo com plantas inteiras mostraram níveis significativamente mais baixos de pai mesotriona herbicida em comparação com o ACR MCR e WCS, o que se correlacionou com respostas fenotípicas anteriores para mesotrione ^11,12.

Waterhemp População	Abreviatura	Fenótipo para Mesotriona	Mecanismo de resistência mesotriona	Fenótipo para primisulfurão	Mecanismo de resistência primisulfurão
O Condado de McLean-Resistant	MCR	Resistente	Metabolismo *	Resistente	Metabolismo
Adams County-Resistant	ACR	Sensitive	-	Resistente	Mutação alvo local em ALS 14
Wayne County-Sensitive	WCS	Sensível	-	Sensível	-

* Mecanismos de resistência não-alvo do local, com excepção metabolismo reforçada, também podem conferir resistência mesotriona na população MCR ^12.

Tabela 1: Descrição das populações waterhemp de Illinois utilizados neste estudo.

Além de determinar as taxas de metabolismo herbicida em plântulas waterhemp intactas, uma abordagem experimental diferente foi desenvolvido e utilizado na nossa investigação anterior para investigar o metabolismo usando um ensaio excisado waterhemp folha ^12, bem como vários inibidores de P450 (por exemplo, tetcyclacis e malatião). Este método foi adaptado especificamente para waterhemp de um PREVIinvestigação ous do metabolismo primisulfurão-metil em milho extirpado deixa ^15, uma vez que o ensaio de folha excisada ainda não haviam sido notificados para a realização de pesquisas metabolismo herbicida numa planta dicotiledônea. O inseticida malathion organophophosate tem sido frequentemente utilizado para in vivo e em pesquisa herbicida metabolismo vitro para indicar envolvimento P450 ^16. Por exemplo, a tolerância eo metabolismo rápido de mesotriona no milho são devido a hidroxilação do anel P450 catalisada, o que foi verificado quando malathion aumento da sensibilidade do milho para mesotriona ^17. Da mesma forma, malatião inibiu o metabolismo do inibidor de primi sul furão-metilo ALS de milho em folhas excisadas ^15. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada é que os dados gerados são independentes de padrões de translocação da planta inteira de, um factor importante a considerar quando se avalia o metabolismo de sistémicas, herbicidas pós-emergentes em plantas. Por conseguinte, este método permite que quantitativa emetabólica análises qualitativas para se concentrar em uma única folha tratada ^12.

Uma estratégia de clonagem vegetativo, em combinação com o protocolo de folha excisada, foi previamente utilizado em waterhemp para conduzir estudos de metabolismo ^12. Devido à natureza de cruzamento de waterhemp (plantas masculinas e femininas separadas), e elevado grau de diversidade genética dentro das espécies Amaranthus dióicas ^9, este protocolo assegurado que waterhemp mudas geneticamente idênticas foram analisadas dentro dos experimentos longo do tempo. Este artigo demonstra a utilidade do método para a medição de folha excisada taxas de metabolismo herbicida em plantas daninhas dicotiledóneas um (waterhemp). A quantidade de herbicida-mãe remanescente foi determinada em cada ponto de tempo (Figura 1) por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, e foi adequado com uma curva de primeira ordem simples, a fim de estimar o tempo para 50% de herbicida absorvida para degradar ( DT _50). Representantecromatogramas da cromatograf ia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) são exibidos para ALS-resistentes e sensíveis ao waterhemp populações, que indicam o desaparecimento de herbicida-mãe e formação concomitante de metabolito polar (s) durante um estudo de tempo-curso (figura 2). O foco do nosso artigo é descrever e demonstrar a utilidade do ensaio da folha excisada em combinação com um método de clonagem vegetativa para determinar as taxas precisas e reprodutíveis do metabolismo de herbicidas em plantas dicotiledôneas, utilizando anel marcado ^(URL-14 C) herbicidas de maneira uniforme em três populações waterhemp que diferem nas suas respostas a planta inteira de HPPD- e inibidores da ALS herbicidas (Tabela 1).

Protocolo

1. Planta Material, condições de crescimento, e vegetativo Clonagem

Nota: Três populações waterhemp foram investigados nesta pesquisa: MCR (do Condado de McLean, IL), ACR (a partir de Adams County, IL), e WCS (a partir de Wayne County, IL) (Tabela 1).

1. Coletar e suspender sementes waterhemp em 0,1 g ^L -1 de ágar: solução de água a 4 ° C durante pelo menos 30 dias para melhorar a germinação. Nota: Algumas populações waterhemp estão dormentes, mas este passo ajuda a superar a dormência de sementes e fazer germinar mais uniformemente.
2. Germinar sementes de cada população waterhemp (como na Tabela 1) em 12 x 12 cm tabuleiros contendo um meio de envasamento em estufa.
   1. Manter condições de estufa em 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr ^12.
   2. Suplemento de luz natural da estufa com luz de lâmpadas de halogeneto de mercúrio para fornecer um mínimo de 500 umol m ^-2 fluxo ^seg1 fóton no nível da planta dossel.
3. Transplante mudas surgiu quando eles são 2 cm de altura em 80 cm ³ vasos em casa de vegetação.
4. O transplante das plântulas em 950 cm ³ vasos contendo uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: areia de turfa: quando mudas são 4 cm de altura. Adicionar 5 g de grânulos de libertação lenta de fertilizantes para cada vaso e misturar esta mistura com o solo.
5. Cortar e remover o meristema apical contendo as três folhas mais novas a partir de 7 cm plantas altas para eliminar dominância apical.
   Nota: Esta etapa garante que cada planta vai crescer o suficiente tiros três centímetros axilares para clonar.
6. Especiais de Consumo cinco rebentos axilares (3 cm de comprimento), quando mudas são cerca de 14 cm de altura de cada população waterhemp (como na Tabela 1). Remover a maior parte das folhas de rebentos axilares desses para diminuir a perda de água após a subsequente manuseamento, mas mantêm as duas folhas mais jovens para permitir um maior crescimento em cima do transplante.
   Nota: Manusear com cuidado e tentar não danificar os rebentos quando a remoção das folhas. Etiquetar cada planta com uma estaca.
7. Transplante axilar atira em 80 cm ³ vasos (uma de mudas por vaso) em substrato, que é o mesmo meio utilizado para a germinação. Substrato deve ser saturado inicialmente até formar raízes na câmara de crescimento, em seguida, manter a umidade e coloque panelas constantes na câmara de crescimento durante 7 dias para estabelecer raízes.
   Nota: As plantas são muito sensíveis, neste ponto e não deve ser salientado.
   1. Manter o crescimento em condições de câmara 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr ^12.
   2. Uma combinação de lâmpadas incandescentes e fluorescentes pode ser utilizada para fornecer a luz na câmara de crescimento e deve fornecer, pelo menos, 550? Mol m ^-2 s ^-1 fluxo de fotões em planta nível ^calote 12.
8. Transplante de novo em 950 cm ³ potes (uma muda por vaso) containing uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: turfa: areia (também incluem 5 g de liberação lenta grânulos de fertilizantes) quando as plantas clonadas são 4 cm de altura, em seguida, transferir de volta para o efeito estufa.
9. Clonar as plantas uma segunda vez usando o mesmo método descrito acima (ou seja, repetir as etapas 1,5-1,8, e, em seguida, vá para o passo 2.1). Para um estudo típico curso de tempo, gerar clones a partir de, pelo menos, seis usinas independentes de cada população waterhemp e gravá-los como linhas MCR _{1-6, 1-6} e ACR WCS _1-6.
   1. Estabelecer pelo menos seis "pai" linhas clonais distintos, a fim de repetir a experiência e adequadamente representar a variabilidade genética dentro de cada população waterhemp.
   2. Dependendo de quantos pontos serão analisados ​​tempo, gerar sub-clones suficientes de cada um "pai" linha clonal para realizar um estudo curso de tempo.

2. Realização de um estudo de metabolismo com extirpado Waterhemp Leaves

1. Extirpar o terceiro mais jovens folhas (2 a 3 cm de comprimento; incluem 0,5 cm de pecíolo ligado) quando as plantas waterhemp clonados são de 10 a 12 cm de altura para o metabolismo do herbicida ea DT ₅₀ análise.
2. Pecíolos Cut folha de cada planta waterhemp uma segunda vez (assegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) sob a água, e coloque estas extremidades cortadas em 1,5 ml frascos de plástico (uma folha por frasco) ^15.
   Nota: Cortando uma segunda vez sob a água impede a formação de bolhas de ar e conectar vasos do xilema.
   1. Em primeiro lugar, submergir parcialmente folhas excisadas com corte pecíolo em tampão de pré-incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) durante 1 h.
   2. Em segundo lugar, cada folha se mover para um novo frasco contendo 1,5 ml de um tampão de incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6), além de 150 fiM ^[URL-14 C] herbicida, e incuba-se a 28 ° C durante 1 h para permitir a absorção do herbicida nas folhas.
      Nota: A ^C-14 e mesotriona ^{14 C-primisulfurão-metil foram utilizados em nossos estudos em actividades específicas de cerca de 20 mCi mmol -1. Ambos difusão e absorção através da corrente xilema transpiração contribuem para a quantidade de herbicida retomado por folha.
      Nota: O efeito de inibidores metabólicos sobre o metabolismo do herbicida pode ser determinada, modificando passos 2.2.1 e 2.2.2. Adicionar 100 uM do inibidor para o tampão de pré-incubação e deixar incubar durante 2 horas, em seguida, transferir para tampão de incubação com o herbicida e adicionar novamente 100 uM de inibidor. Por exemplo, malathion e tetcyclacis inibir certas actividades do citocromo P450 em plantas 15-17.}
   3. Lave a parte imersa das folhas excisadas com água deionizada e transferir folhas excisadas para um quarto de força Murashige e Skoog (MS) solução sais (500 mL) para 0 h, 5 h, 11 h, 23 h, ou 35 horas, respectivamente, na câmara de crescimento durante o estudo do metabolismo curso de tempo.
3. Colheita removendo licenças a partir da solução de incubação no ponto de tempo apropriado e moer manualmente cada folha do tecido em azoto líquido usando um tubo de polipropileno (15 ml) e pilão de vidro.
4. Extrair herbicida marcado radioactivamente e os seus metabolitos de cada folha com 7 ml de acetona a 90% com um homogeneizador de tecidos laboratorial no mesmo tubo de polipropileno como acima. Lavar homogeneizador de tecidos com um adicional de 7 ml de 90% de acetona, e continuar a homogeneizar até que o tecido está completamente pulverizado (geralmente cerca de 2 min). Nota: 90% de acetona pode ser utilizado para a extracção da maior parte dos herbicidas a partir de tecidos de plantas. No entanto, se este método é possível extrair mais do que 90% dos compostos radiomarcados absorvidas, em seguida, 90% de metanol ou 90% de acetonitrilo pode ser substituído, tal como o solvente de extracção.
5. Etiqueta 90% extractos de acetona (14 mL no total) e armazenar a 4 ° C durante 16 horas para permitir a extracção adicional para ocorrer.
   Nota: Após esta extração de folhas tratadas, a quantidade de rad extraívelioactivity é tipicamente pelo menos 98% de compostos radiomarcados absorvidos pela folha tratada. Radioactividade não extractável (resíduos ligados) em folhas excisadas em média apenas 0,3% em todos os pontos de tempo no nosso estudo anterior ^12, mas esta quantidade pode variar de acordo com o herbicida utilizado e ponto de tempo examinado.
6. Centrifugar as amostras a 5000 xg durante 10 min e concentrar-se os sobrenadantes a 40 ° C com um evaporador rotativo até um volume final de 0,5 ml é obtida. Transfira este volume para um tubo de plástico de 2,0 ml.
7. Adicionar acetonitrilo: água (1: 1, por volume) para ajustar o volume final da planta extrai a 1,25 ml e re-centrifugar a 10000 xg durante 10 minutos para remover quaisquer partículas.
8. Medir radioactividade total em uma alíquota de cada amostra (dpm ul ^-1) por espectroscopia de cintilação líquida (LSS) ¹² e normalizar valores de ^{[marcado com 14 C]} compostos injectados para análise por HPLC (por exemplo, 10,000 total de dpm / amostra / run) para y-eixos será uniforme entre as amostras ao representar graficamente os resultados.

3. HPLC Análise do herbicida nas folhas excisadas Metabolismo

Nota: Resolva radioatividade extraível total de herbicidas em pai e herbicidas metabólitos utilizando as seguintes condições RP-HPLC ^12.

1. Realizar RP-HPLC com uma coluna C ₁₈ (4,6 x 250 mm, 5 um de tamanho de partícula, por HPLC analítica) com um caudal de 1 ml min ^-1 para a maioria dos herbicidas não-polares.
   Nota: as colunas C ₄ ou C ₁₂ de RP-HPLC pode também ser utilizado para optimizar a separação do herbicida parente de seus metabolitos. Um filtro pré-coluna e / ou pré-coluna também pode ser usado para proteger e aumentar a vida útil da coluna RP.
   1. Utilize a seguinte fase móvel para RP-HPLC: Eluente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) em água, e Eluente B 100% de acetonitrilo de grau HPLC.
      Nota: metanol de grau HPLC, também pode ser utilizado como Elafluente B para a resolução de compostos mais polares e metabolitos, mas esteja ciente de que os tempos de retenção também pode mudar.
      Nota: O perfil de eluição usado para resolver a mesotriona ou primi sul furão-metilo a partir dos seus metabolitos polares em nossa pesquisa ¹² é a seguinte: Etapa 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) num gradiente linear (12 min); Passo 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) num gradiente linear (5 min); Passo 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) em um gradiente linear durante 2 minutos (num total de 19 min).
      Nota: Gradientes isocráticas e passos podem ter de ser ajustadas com base nas propriedades físicas do material de origem, de modo a optimizar a resolução.
   2. Seguir os passos de gradiente linear acima, com A: B (1: 9, v / v) A: B (4: 1, v / v) num gradiente linear (3 min) e A: B (4: 1, v / v) passo isocrático (durante pelo menos 2 min) para re-equilibrar a coluna RP antes de injectar o seguinte extracto ^12.
2. Detectar e visualizar compostos radiomarcados com um fluxo Scintillation Analyzer. Registar a quantidade de herbicida-mãe restante em cada amostra como uma percentagem da radioactividade total em cada amostra (detectados e quantificados pelo fluxo de cintilação Analisador de acordo com as instruções do fabricante) para determinar as taxas de metabolismo herbicida em cada população waterhemp durante o curso do tempo.

4. Procedimentos Estatísticos

1. Organizar tratamentos em um delineamento inteiramente ao acaso (ou outro arranjo adequado para análise estatística).
2. Realizar duas experiências independentes com cada tratamento, composta de três réplicas biológicas para cada experimento. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total. Se o efeito de experiência não é significativa (α = 0,05), combinar e analisar os dados de cada experiência independente. Se o efeito experimento é significativo, em seguida, analisar cada experiência em separado.
   Nota: Inclua os primeiros três repetições biológicas in Experimento 1 e os próximos três repetições biológicas no Experimento 2. Cada repetição biológica representa um "pai" distinta linha clonal derivada de cada população (MCR _{1-6, 1-6} ACR, e WCS _1-6), de modo que cada tempo- Curso de Análise utiliza plantas geneticamente idênticas. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total, o que permite uma representação adequada da variabilidade genética ea determinação de um mediano DT ₅₀ para cada população waterhemp.
3. Analisar os dados com análise não linear de regressão dos mínimos quadrados e encaixá-los com uma curva simples de primeira ordem, a fim de estimar a DT _{50 s.} A equação abaixo descreve o modelo:
   
4. onde, neste modelo de Y representa a percentagem de herbicida-mãe remanescente no tempo t, μ _{i é a} DT para cada ₅₀waterhemp população i, eo parâmetro _C 0 é o valor estimado do pai herbicida presente em t = 0 ^12.

Resultados

Foram detectadas grandes diferenças nas taxas de metabolismo mesotriona entre qualquer WCS ou ACR e MCR (Figura 1). Em cada ponto de tempo, MCR tinha metabolizado mesotriona mais rapidamente do que as duas populações sensíveis à mesotriona, WCS e ACR, que se correlaciona com a planta inteira de respostas fenotípicas anteriores ^11. Ao clonar plantas suficientes a partir de uma única planta parental de cada população, análises de curso-tempo do metabolismo dos herbicidas estão uniforme e reprod...

Discussão

O método extirpado-leaf aqui descrito foi usado anteriormente em pesquisar metabolismo primisulfurão no milho deixa ^15, mas os nossos resultados demonstram que este protocolo é igualmente eficaz, preciso e reprodutível para medir o metabolismo do herbicida em um dicot ¹² espécies de plantas daninhas. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada em comparação com os estudos da planta inteira de uma folha que é excisada é independente de padrões de translocação da planta inteira de pós-emergência...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	para sementes pré-germinativas
Meio de envasamento	Sun Gro Horticultura	49040233	para crescimento de plantas
Nutricote	Agrivert	MISTURA TOTAL 13-13-13 T100	fertilizante de liberação lenta
Câmara de crescimento E15	Controlled Environments Limited	20207	cultura de plantas
Base Tris Fisher	Scientific	BP152-500	tampão para folhas excisadas
HCl (concentrado)	Fisher Scientific	A144500	ajustar o pH dos
sais Murashige e Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M0404	incubação de folhas excisadas
Metanol	Fisher Scientific	A452-4	lavagens de folhas após incubação
Acetona	Sigma-Aldrich	179124	extrações de plantas
Acetonitrila (grau HPLC)	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC fase móvel
Ácido fórmico	Mallinckrodt Analytical	MK259205	acidifica a fase móvel pH
Microcentrífuga	Eppendorf	5417R	Tubos de 1,5 ou 2,0 ml
Centrífuga (temperatura controlada)	Eppendorf	5810R	Tubos de 15 ou 50 ml
Tubo de centrífuga de polipropileno	Corning Inc.	430790	15 ml, estéril
Evaporador rotativo	BÜ Amostras	plantas concentradas	R200
Espectrometria de cintilação líquida (LSS)	Packard Instruments	104470	quantifica 14C
Cromatografia líquida de alta eficiência	Perkin Elmer	N2910401 resolve	metabólitos de herbicidas
Analisador de cintilação de fluxo	LabLogic System	1103303	para análise por HPLC de 14C
Hypersil Gold C18 column	Thermo-Scientific	03-050-522	Fase invertida
Coquetel Ultima-Flo M	Perkin Elmer	6013579	para analisador de cintilação de fluxo
Coquetel de cintilação (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	para LSS; homogeneizador de laboratório biodegradável
	Kinematica	CH-6010	homogeneizar amostras de folhas

de CHI