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Artigo de método

Condições que afetam Espaço Social em

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DOI:

10.3791/53242

⸱

5 de novembro de 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Entomology, Cornell University

Neste artigo

Resumo

O efeito dos genes e do ambiente no espaço social de Drosophila melanogaster pode ser quantificado por meio de um paradigma analítico poderoso, mas direto. Mostramos aqui diferentes fatores que podem afetar esse espaço social e, portanto, precisam ser levados em consideração ao projetar experimentos nesse paradigma.

Resumo

O ensaio aqui descrito espaço social pode ser utilizado para quantificar interacções sociais de Drosophila melanogaste R - ou outros insectos pequenas - de uma maneira simples. Como já foi previamente demonstrada 1, numa câmara de bi-dimensional, que primeiro forçar as moscas para formar um grupo compacto, subsequentemente, o que lhes permite levar a sua distância preferida entre si. Depois de ter resolvido as moscas, medimos a distância para o vizinho mais próximo (ou espaço social), o processamento de uma imagem estática com o software on-line gratuito (ImageJ). A análise da distância para o vizinho mais próximo permite aos pesquisadores determinar os efeitos de fatores genéticos e ambientais sobre a interação social, enquanto controlando para possíveis fatores de confusão. Diversos fatores, como capacidade de subida, hora do dia, sexo e número de moscas, pode modificar o espaçamento social das moscas. Nós, assim, propor uma série de controlos experimentais para mitigar esses efeitos de confusão. Este ensaio podeser utilizado para, pelo menos, duas finalidades. Primeiro, os pesquisadores podem determinar a forma como a sua mudança ambiental favorito (como o isolamento, temperatura, estresse ou toxinas) terá impacto social, espaçamento 1,2. Em segundo lugar, os pesquisadores podem dissecar as bases genéticas e neurais desta forma básica de comportamento social 1,3. Especificamente, ele foi usado como uma ferramenta de diagnóstico para estudar o papel de genes ortólogos que estariam envolvidas no comportamento social em outros organismos, tais como genes candidatos para o autismo em humanos 4.

Introdução

As interações sociais são cruciais para o bom desenvolvimento e saúde dos indivíduos dentro de um grupo como um todo, e pode ser observado através de numerosas espécies, a partir de seres humanos (Homo sapiens) para os organismos mais simples, como as moscas da fruta (Drosophila melanogaster) 5,6. Uma mosca da fruta indivíduo ou meios comuns de compartilhamento humano para processar a informação sensorial durante essas interações, quer seja: auditiva, visual, olfativa, tátil, ou gustação. Nós e outros a hipótese de que há uma neurocircuitry potencialmente compartilhada subjacente respostas comportamentais a interações sociais e que as células neuronais e genes envolvidos pode ser conservada evolutiva 7. Uma vez que a interação inicial ocorreu, o espaço social entre os indivíduos que interagem vão quer aumento (evitação social 8) ou diminua (formação de grupos / agregação 5). Interações mais complexas, como agressividade ou namoro, pode então ter lugar.

Nem ferramentas e métodos sofisticados, nem grandes investimentos em tempo e treinamento são necessários para quantificar esta forma simples de comportamento social, tornando-se uma poderosa ferramenta analítica. Aqui, nós explicar um protocolo simples que quantifica distância inter-fly, ou espaço social, para avaliar a interacção social em grupos estáveis ​​de Drosophila melanogaster, como usado nos seguintes estudos 1-4,9. O espaço social refere-se a uma medida da distância entre uma mosca e seu vizinho mais próximo 10. O espaço social é consistente para uma dada população de D. melanogaster, quando as condições experimentais são preservadas (média de aproximadamente 1-2 comprimentos dentro do corpo), e varia em relação à experiência social das moscas, aumentando, se o indivíduo tenha sido mantidos em isolamento 1. Visão adequada é necessária para manter a distância social normal, mas não odorants clássicos ou CVA percepção 1. Medida do espaço social pode, portanto, serutilizado como uma ferramenta de diagnóstico para analisar as interacções sociais e quantificar o comportamento social em D. melanogaster 1. Nós descrevemos aqui em detalhes como realizar essa quantificação, e em que medida variáveis ​​experimentais comuns afeta este comportamento.

Mostra-se que a orientação da câmara em que o ensaio é realizado, bem como o número de moscas - a uma extensão - fazer afecta espaço social. Foi previamente mostrado que a geometria da câmara afeta o movimento espontâneo exploratório de moscas 11,12, e este fenômeno pode vir a ter impacto sempre que decidam estabelecer. No entanto, desde que a densidade de mosca (mosca / cm 2) e a orientação da câmara é mantida a mesma, o espaço social das moscas também permanece constante. A robustez do presente ensaio é ilustrada pelo facto de que os laboratórios independentes utilizando diferentes tamanhos de câmara, forma e orientação pode replicar o resultado apresentado por mutantes do whgene ite (que afectam a pigmentação dos olhos), que é um espaço social aumento (triângulo vertical ou horizontal em um círculo, quadrado horizontal com o fluxo de ar em 3).

Nossos resultados também indicam que a manutenção do momento em que o experimento espaço social é realizada é fundamental para a consistência dos resultados, como mostramos que machos, mas não fêmeas, são mais distantes à noite. No entanto, as diferenças observadas entre diurnas e noturnas horas não são devidas às diferenças das moscas de atividade, e discutimos argumentos indicando que os níveis de atividade não são correlacionados com o espaço social.

Finalmente, existem bases genéticas para a determinação do espaço social, como indicado pelo mutante branco já descrito 1,3, e as diferenças entre várias estirpes puras e selvagens capturados de moscas que apresentamos aqui.

Por isso, este ensaio é uma excelente ferramenta fou estudando os efeitos da genética, bem como fatores ambientais.

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Protocolo

1. Equipamentos e Reagentes Criado In-house (Veja a lista de materiais para outros)

  1. Prepare um aparelho de anestesia frio Drosophila como descrito anteriormente 8.
  2. Preparar um aspirador de mosca como previamente descrito 13.
  3. Prepare câmaras espaço social e titulares.
    1. Ordenar ou fazer painéis de vidro e espaçadores de acrílico para criar as câmaras espaço social. Cada câmara de espaço social consiste em dois painéis de vidro quadrados (17,6 cm por 17,6 cm, com uma espessura de 0,3 cm), dois espaçadores de acrílico triângulo direita (com uma altura de 16,5 cm, uma base de 8,9 cm, com uma espessura de 0,3 cm ), e dois espaços rectangulares (9 cm por 1,5 cm com uma espessura de 0,3 cm) (Figura 1A).
    2. Montar o vidro e a câmara de espaço social acrílico de tal forma que ela é idêntica à câmara na Figura 1B. Para fazê-lo, começar por colocar um espaçador triangular plana no topo de um painel quadrado de vidro de tal modo que o ângulo rectodo espaçador triangular está alinhada com um dos cantos do painel quadrado. Em seguida, coloque o segundo espaçador triangular plana na parte superior do painel quadrado, espelhando o primeiro espaçador triangular.
      NOTA: Certifique-se de usar luvas para não contaminar as peças com óleos e aromas de suas mãos.
    3. Colocar duas pequenas espaçadores rectangular plana no topo do painel quadrada, ao longo do lado do painel que não é coberta. Os espaçadores de acrílico na parte superior do avião quadrado deve agora formar uma arena triangular.
    4. Coloque um segundo painel quadrado de vidro no topo dos espaçadores acrílicos de tal forma que ele está alinhado acima do painel de vidro originais abaixo.
    5. Use quatro grampos da pasta para fixar os painéis e espaçadores em conjunto para formar a câmara de espaço social. Coloque um grampo próximo do canto, sobre o lado mais longo de cada um dos espaçadores triangulares, prendendo-os no interior das chapas de vidro. Em relação a estes mesmos lados, coloque um clipe no canto adjacente, sobre cada um dos espaçadores rectangulares, prendendo-os emno lado as vidraças.
    6. Montar um cavalete de suporte, e um balão de braçadeira de tal modo que o grampo irá manter a câmara de espaço social numa posição vertical, como a câmara de espaço social repousa sobre o seu bordo na parte superior da superfície de trabalho.
    7. Para cada repetição do experimento, montar uma câmara de espaço social e apoio de pé.
  4. Prepare um aparelho de resposta do ensaio escalada para verificar a capacidade de escalada das moscas testados.
    1. Usar um aparelho em contracorrente, como anteriormente descrito 14,15.
  5. Assegurar que as condições de iluminação homogénea, realizando a experiência com uma superfície de trabalho coberto com uma tampa de bancada branca e em frente de um fundo branco.

2. Preparar as moscas antes da Experiência

  1. Manter moscas em frascos contendo padrão mosca Drosophila alimentos. Mantenha-os numa câmara de incubação a 25 ° C num ciclo luz / escuro de 12 horas de luz.
  2. Um a dois dias antes de a eXperiment, recolher e sexo voa sob anestesia frio, como descrito anteriormente 8.
    1. Resfriar o aparelho de anestesia frio de -4 ° C. Lugar voa para 50 ml tubos de plástico. Totalmente submergir os tubos de plástico contendo moscas em gelo em um balde de gelo isolado, aguarde pelo menos 5 minutos para moscas para se tornar imóvel.
    2. Coloque as moscas na folha de polietileno do aparelho de anestesia frio. À TA, utilizar um estereomicroscópio para separar os machos das fêmeas. Manter moscas, em grupos, em frascos contendo padrão mosca Drosophila comida, não superior a 40 moscas por frasco.
  3. Duas horas antes do início da experiência, assegurar que a temperatura da sala onde a experiência é realizada será entre 24-25 ° C e com uma humidade de aproximadamente 50%.
  4. Transferir as moscas em novos frascos contendo comida, e coloque-os durante 2 horas sobre a superfície de trabalho, onde a experiência será executada.
    NOTA: Para estas experiments, as linhagens de moscas utilizados foram estirpes de Drosophila melanogaster: Canton-especiais ou Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (ou W - w 1118 outcrossed 10 vezes a Canton-S), Oregon e Samarkand moscas foram todos do nosso laboratório stocks 16; Elwood moscas foram coletadas no Outono de 2011 no bairro de Elwood de Huntington, em Long Island, Nova York, EUA 8. Além quando especificado em contrário, os resultados apresentados foram obtidos com Canton-S moscas (em tons de vermelho).

3. a realização do experimento

  1. Realizar o experimento doze horas - três horas (tempo Zeitgeber - o tempo em horas após o início da luz - de ZT 4-7).
  2. Prepare a câmara de espaço social para a transferência de moscas.
    1. Coloque um apartamento câmara espaço social em uma superfície de trabalho, com o lado que contém espaçadores rectangulares mais próximos ao seu corpo.
    2. Remover one clipe mais próximo de seu corpo e deslizar um espaçador rectangular para o exterior, criando uma lacuna de cerca de 1 cm entre os espaçadores rectangulares.
    3. Usando fita e um marcador, rotular a câmara de espaço social em um canto superior com o sexo, estirpe, e número de repetição. Tome cuidado para garantir a fita não cobre parte da arena triangular interior.
  3. Transferir as moscas na câmara espaço social.
    1. Transferência voa de seu frasco contendo alimentos em um novo frasco vazio. Aspirar voa do frasco vazio e transferi-los para a câmara de espaço social.
      1. Inalar para desenhar as moscas dentro da ponta do aspirador. Colocar a ponta no 1 cm lacuna entre os espaçadores rectangulares da câmara de espaço social e exalar, a uma taxa consistente para forçar as moscas para a arena triangular interna.
      2. Deslize imediatamente o espaçador rectangular de volta no lugar, fechando a base da arena triangular interior, e coloque o grampo da pasta novamente.
  4. Em uma almofada batendo, que está localizado no banco diferente de onde o trabalho experimental tem lugar, segurar a câmara de espaço social na posição vertical de modo a que os espaçadores são rectangulares na parte inferior. Libra três vezes para assegurar que todas as moscas ter caído para a parte inferior da arena.
    NOTA: Devido ao espaçador acrílico saindo do menor tamanho de câmara (Figura 1D), bang cotovelos na superfície de trabalho, mantendo uma fixação segura no aparelho, para garantir as moscas caíram para o fundo.
  5. Iniciar um temporizador.
  6. Coloque a câmara de espaço social na superfície de trabalho e usar o apoio e suporte de balão braçadeira para mantê-lo na posição vertical. Coloque uma régua ou uma etiqueta de comprimento conhecido plana contra a câmara de espaço social, mas não abrangendo qualquer parte da arena triangular interior.
    1. Para experiências posicionadas horizontalmente, não coloque a câmara de espaço social no stand de apoio; em vez colocar a câmara plana espaço social na superfície de trabalho.
  7. Quando as moscas se instalaram, geralmente após cerca de 30 minutos, tirar uma foto da câmara de espaço social. Certifique-se que o quadro contém toda a arena interior triangular, o governante, eo rótulo.
  8. Repita a experiência de cada genótipo e da condição (idealmente 3 repetições internas e 3 repetições independentes).

4. Analisando os Dados Espaço Social

  1. Importe os seguintes Macros em ImageJ 17
    1. ImageJ está disponível aqui: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
    2. Você pode criar um comando 'Distâncias Medidas "no menu Plugins, salvando as macros abaixo em um arquivo chamado' Measure_Distances.txt 'na pasta ImageJ / plugins, na subpasta macro, e usando Ajuda> comando Menus Update'.
    3. Cópia em um arquivo .txt as macros que são fornecidos em dados suplementares e foram originalmente publicados em três.
  2. Upload de imagens para um computador, e abra um picture usando ImageJ.
    1. Criar uma escala desenhando uma linha a partir dos 0 cm a 1 cm de marcas na régua na imagem, e sob a guia Analisar, escolha o recurso Escala Definir para definir uma escala de 1 cm para que a distância (mesma abordagem para o adesivo de comprimento conhecido). Escolha a opção global antes de aplicar a escala para a imagem.
    2. Recortar a imagem usando a função Corte sob a guia Imagem de tal forma que inclui todas as moscas, ao remover tanto quanto do resto da imagem possível.
    3. Fazer o retrato preto e branco, escolhendo 8-bit a partir da opção Tipo na guia Imagem.
    4. Remova todo o ruído de fundo da imagem, indo para o recurso Threshold sob a opção de Ajuste da guia Imagem. Arraste as barras deslizantes para melhorar ou remover o contraste para que o corpo de cada mosca pode ser visto claramente, sem quaisquer outras marcações na imagem. Se houver marcas que não são moscas, capturá-los com a ferramenta rectangular e excluí-los.
    5. Colocou omedições usando a ferramenta Definir Medidas sob a guia Analisar. Selecione Area, Centro de Massa, Centroid, e Rótulo de Exibição. Em seguida, escolha as partículas Analisar apresentam sob a guia Analisar para criar uma lista numerada de todos os pontos negros representam moscas.
      1. Ao utilizar partículas Analise; set tamanho 0,01-0,1 (não escolher unidade pixel); circularidade 0,00-1,00; mostrar contornos; apresentar resultados, e adicionar a gerente.
      2. Certifique-se de que cada mancha preta (cada partícula) é uma representação precisa das moscas que estão na imagem original, através da comparação da lista numerada para a imagem original.
        NOTA: Se algumas moscas que estão muito perto em conjunto que está sendo contado como uma partícula, desenhar manualmente uma linha em branco para separar as duas moscas na imagem binária.
    6. Enquanto a lista está seleccionada, utilize o vizinho mais próximo - Lista Distâncias macro sob a segunda opção Macros na aba Plug-ins para criar uma nova lista contendo as distâncias, em centímetros, a partir da EAch voar para o seu vizinho mais próximo.
  3. Copie as distâncias vizinhos mais próximos de ImageJ e colar em uma coluna de um programa de planilha.
    1. Compilar todos os dados de cada repetição na mesma planilha e organizar pelo genótipo e condição.
  4. Executar análise de dados usando o software estatístico. Neste experimento, Graph Pad Prism (versão 6 para MacOSX, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com) foi utilizado para realizar one-way ANOVA e testes de Kruskal-Wallis, Tukey e de post-hoc testes de Dunnet.
  5. A distribuição das distâncias segue uma distribuição não paramétrica 1, e os dados estão representados como a caixa de bigodes e Tukey (para eliminar valores extremos).

5. Escalada Assay (Comportamento de Controle)

  1. Use um ensaio escalada como um controle para moscas de teste de escalada capacidade 14,15,18.
    1. Use o aparelho em contracorrente de tal forma que três ensaios cum ser executado em paralelo.
  2. Transferência de 50 a 100 moscas virgens de tratamento (moscas que não tenham sido testadas antes) em três frascos de ensaio diferentes, e encaixá-los no 1º, 3º e último ranhuras na parte inferior do aparelho em contracorrente, com frescos frascos vazios nos locais opostos.
  3. Coloque fresco, em frascos vazios os espaços vazios na parte inferior do aparelho.
  4. Toque para baixo do aparelho de três vezes, de modo a que todas as moscas estão na parte inferior de cada tubo, para iniciar a experiência.
  5. Inicie o cronômetro para 15 segundos (tempo suficiente para ~ 100% de 3-7 dias de idade Canton-S para chegar ao topo vial - veja a Figura 3F).
  6. Deslize a porção superior do dispositivo de contra-corrente, para deslocar os melhores frascos por uma ranhura.
  7. Recolha moscas tocando no aparelho para baixo, para trazer todas as moscas nos frascos de fundo.
    1. 1º e 2 tubos nd (ou 3º e 4º, 5º e 6º) correspondem, respectivamente, as moscas que não atingiram a parte superior e as moscas que atingiram o topo do frasco.
  8. Calcule o Índice de Desempenho (PI).
    1. Contar o número de moscas em cada frasco.
    2. O PI é a percentagem de moscas capaz de subir no tubo superior.
    3. Os meios de PI seguem uma distribuição normal 1, e os dados são representados como gráficos de coluna de média mais ou menos o erro padrão da média (SEM).
      NOTA: Como alternativa, o PI pode ser calculada como a percentagem de moscas que possam atingir a parte superior do frasco inferior (por moscas mais velhos, 5 segundos é o tempo suficiente para quantificar a diferença na escalada capacidade entre infectado e não infectado 12 dias de idade Canton-S quantificados a partir de uma imagem estática: ver resultados). Outros usaram diferentes medidas de desempenho em geotaxis negativos induzida por sobressalto, que também são apropriados para quantificar escalada capacidade 19-22.

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Resultados

A câmara de espaço social pode ser usado como uma ferramenta para quantificar o comportamento social de Drosophila melanogaster. Espaçadores acrílico e chapas de vidro são cortadas em conjunto para formar uma arena triangular interna que proporciona uma área bidimensional em que voa podem formar grupos estáveis ​​sem a presença de diversos estímulos potencialmente de confusão. Quando as moscas são transferidos para a arena vertical, eles são surpreendidos por ser batido para baixo, e eles respondem por um compo...

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Discussão

Neste protocolo, um procedimento detalhado para a quantificação do espaço social foi descrita. Alguns passos cruciais para garantir o experimento for bem-sucedida são: 1) usar sempre luvas durante a limpeza e configuração do aparelho, para manter seus próprios óleos e aromas fora da câmara interna do aparelho, 2) garantir moscas são coletadas, pelo menos, um dia antes o experimento para reduzir os efeitos potenciais da anestesia frio, 3) 2 horas antes do experimento fornecer novos frascos contendo alimentos frescos para...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores querem agradecer ao Dr. Tadmiri Venkatesh por seu incentivo para preparar este manuscrito, Dova Brenman e Selwyn Chui por seus comentários construtivos, Elyssa Burg e Wayne Rasband por projetar a macro em ImageJ para todas as distâncias de intervoo e para distâncias vizinhas mais próximas. Os autores também querem agradecer aos revisores por seus comentários construtivos.

A.A.A, M.C.C. e A.F.S foram responsáveis pelo desenho da pesquisa; S.N.J., A.A.A, M.N., Z.R. e A.J.M. realizaram os experimentos. A.A.A, M.N., A.J.M. e M.C.C. e A.F.S. analisaram os dados; A.R.M. e A.F.S. escreveram o manuscrito.

Este trabalho foi apoiado por prêmios de pesquisa PSC-CUNY, financiados conjuntamente pelo The Professional Staff Congress e pela The City University of New York para a A.F.S.; por financiamento interno da Western University para a A.F.S.; por uma bolsa de estudos de Matemática, Biologia, Química e Geologia para professores em treinamento e por uma bolsa de estudos da Louis Stokes Alliance for Minority Participation para a A.A.A.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio Zoom Estéreo Nikon   SMZ-645Qualquer outro escopo padrão para manuseio de moscas funcionaria
Pincéis pequenos para empurrar moscas
Jazz-mixFisher33545qualquer outro alimento padrão de drosófila funcionaria
Mini-Alarme Temporizador/Cronômetro
  Canetas
Fita Adesiva
Clipes de fichário de tamanho médioGrampospara manter as câmaras juntas: clipes médios de 1-1/4" (32mm) com capacidade de 5/8"
pequenos suportesCarolina 707161para segurar as câmaras em uma orientação vertical
Bureta apertaCarolina707362
Câmera DigitalNikon  Coolpix S8000para tirar as fotos estáticas
Réguapara poder dimensionar a placa de três
dobras da imagem e a tampapara fornecer um fundo branco e uma luz homogênea.
batendo padqualquer mouse pad funciona.
Prisma 6GraphPad Software Inc.Prism 6 para Mac OS XQualquer software de análise estatística com teste t, unidirecional e dois ANOVA funcionaria
Sharpie pequena do banco branco

Referências

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