Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

Summary

Este protocolo compara as afinidades relativas dos parceiros de ligação para GTPases da família Rho, incluindo Rac1. In vivo, as proteínas de ligação a Rac1 competem por uma única interface de ligação, cuja conformação é ditada por um nucleotídeo ligado. O nucleotídeo é importante e difícil de controlar experimentalmente, devido à alta taxa de hidrólise.

Abstract

Neste protocolo, demonstramos um método para comparar a competição entre proteínas de ligação à GTPase. Tal abordagem é importante para determinar as capacidades de ligação das GTPases por dois motivos: O fato de todas as interações envolverem a mesma face das GTPases significa que os eventos de ligação devem ser considerados no contexto dos concorrentes, e o fato de que o nucleotídeo ligado também deve ser controlado significa que abordagens convencionais, como imunoprecipitação, são inadequadas para a bioquímica da GTPase. O ensaio depende do uso de proteínas purificadas. O Rac1 purificado imobilizado em grânulos é usado como proteína de isca e pode ser carregado com GDP, uma versão não hidrolisável do GTP ou livre de nucleotídeos esquerdos, para que o estágio de sinalização a ser investigado possa ser controlado. As proteínas de ligação a serem investigadas são purificadas de células de mamíferos, para permitir o dobramento correto, por meio de uma etiqueta GFP. O uso da mesma etiqueta em ambas as proteínas é importante porque não apenas permite purificação e eluição rápidas, mas também permite a detecção de ambos os competidores com o mesmo anticorpo durante a eluição. Isso significa que as quantidades relativas das duas proteínas ligadas podem ser determinadas com precisão.

Introduction

O citoesqueleto de actina que determina a forma, polaridade e propriedades migratórias das células de mamíferos é regulado pela família Rho de pequenas GTPases. As GTPases da família Rho incluem RhoA que estimula a contração do citoesqueleto, Rac1 que estimula a ramificação da actina e a protrusão da membrana e Cdc42 que tem efeitos semelhantes na polimerização da actina ao Rac1 e causa a formação de filopódios ^1,2. A atividade de sinalização da GTPase é determinada pela ligação de um nucleotídeo, que controla a contração e o relaxamento dos loops de switch I e switch II que medeiam as interações proteína-proteína com reguladores e efetores. As GTPases ligadas à guanosina 5'-trifosfato (GTP) ativam os efetores a jusante, enquanto a forma ligada à guanosina 5'-difosfato (GDP) é inativa. Na célula, os ciclos de hidrólise de GTP e troca de nucleotídeos permitem a rápida renovação dos sinais de GTPase que são necessários para a dinâmica do citoesqueleto. A renovação de nucleotídeos é regulada por três mecanismos. Os fatores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs) estabilizam a GTPase livre de nucleotídeos, catalisando a troca de GDP por GTP e, assim, estimulando a atividade de sinalização da GTPase ^3,4. As proteínas ativadoras de GTPase (GAPs) catalisam a hidrólise de GTP em GDP, inibindo assim a atividade de sinalização da GTPase ⁵. Moléculas sequestradoras, como o regulador da condensação da cromatina 2 (RCC2) e os inibidores da dissociação de nucleotídeos de guanina (GDIs), obscurecem as alças de comutação e, no caso de GDIs, removem a GTPase da membrana por interação com a cauda do prenil ^6,7. Cada uma das três classes de moléculas reguladoras interage com os loops de comutação, assim como os efetores a jusante e alguns reguladores de tráfego, como a coronina-1C ⁷. O objetivo deste protocolo é medir a competição pelo local de ligação do interruptor I / II entre reguladores putativos e moléculas de sinalização a jusante. Deve-se notar que os ensaios de competição testam a ligação a um local de ligação compartilhado, de modo que este protocolo não é adequado para testar interações com outros locais, como a ligação de GDIs à cauda do prenil.

A sutileza das diferenças de conformação entre as formas ativa e inativa, combinada com a natureza lábil do nucleotídeo ligado, dificultou o estudo dos eventos de ligação à GTPase. O papel do nucleotídeo ligado significa que os ensaios de ligação convencionais, como imunoprecipitação ou ressonância plasmônica de superfície, não são adequados para investigação, pois o nucleotídeo não pode ser controlado. Esse obstáculo é agravado pela sobreposição nos sítios de ligação de GEFs, GAPs, efetores, moléculas sequestradoras e moléculas de tráfego, o que dificulta a interpretação dos dados de ligação para uma única interação no contexto da competição que ocorrerá na célula. A imunoprecipitação, em particular, é comprometida pela competição entre parceiros de ligação, pois sob certas condições celulares, um parceiro de ligação pode ser identificado às custas de todos os outros, enquanto sob outras condições, outro parceiro pode dominar. A natureza dinâmica da sinalização GTPase é essencial para a função GTPase e deve ser considerada ao analisar as relações entre as interações de ligação de diferentes reguladores. De fato, descrevemos recentemente um caminho que dependia fortemente da vinculação competitiva. Identificamos a coronina-1C como uma molécula de tráfego que se liga aos loops de comutação do GDP-Rac1 ⁷. Em áreas de baixa atividade do GEF, o tráfico dominaria, removendo o Rac1 dessas regiões. No entanto, quando o Rac1 é entregue a regiões da célula onde a atividade do GEF é alta, o GEF superaria a coronina-1C, ativando assim o Rac1 e impedindo a remoção mediada pela coronina-1C de Rac1 dessa área. O modelo vai além, porque a ação das trocas do GEF vinculou o PIB ao GTP, deslocando o equilíbrio ainda mais longe da coronina-1C. Consequentemente, a atividade Rac1 pode ser explicada inteiramente em termos de competição e afinidade relativa.

Neste protocolo, descrevemos um método para comparar as afinidades relativas de diferentes parceiros de ligação para pequenas GTPases, usando Rac1 como exemplo. Usando uma abordagem de proteína purificada, é possível montar uma cadeia de eventos de sinalização por comparação de pares, em um experimento em que o nucleotídeo ligado pode ser controlado de perto.

Protocol

1. A purificação de GTPase marcado com GST

1. Cultura um E. coli tal como BL21 transformada com pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitação a 220 rpm, em 500 ml de meio de auto-indução (25 mM de Na ₂ HPO _4, 25 mM de KH _{2 PO 4,} 50 mM de NH ₄ Cl, 5 mM de Na _{2 SO 4,} 2 mM _MgSO4, 2 _mM de CaCl2, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 100 ug / ml de ampicilina).
2. Colheita bactérias por centrifugação durante 10 min a 10.000 xg, a 4 ° C.
3. Ressuspender o granulado em 20 ml bacteriana reagente de extracção de proteína, 1x inibidor de protease e incuba-se durante 20 min à TA com inversão.
4. Clarificar o lisado por centrifugação a 40.000 xg durante 30 min.
5. Adicionar 2 mL de glutationa esferas magnéticas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS: 10 mM de Na ₂ HPO _4, 1,8 mM _de KH 2 PO _4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM).
6. Incubar durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C.
7. Lavar os grânulos carregados de proteína-se quatro vezes com 10 ml de PBS, utilizando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada passo.
8. Grânulos em 2 ml de PBS e armazenar Ressuspender proteína-carregado a -80 ° C em alíquotas de 100 ul até ser necessário.

2. Expressão de proteínas de ligação a GTPase

1. O dia antes da experiência, os plasmídeos que codificam para transfectar proteína fluorescente verde (GFP) tagged versões de cada proteína de GTPase de ligação para um separado ^75-cm2 de frasco HEK293T como se segue. Para a validação do carregamento de nucleotídeos, transfecção GFP-tagged TrioD1 em um terceiro de 75 cm ² frasco de HEK293T.
   1. Diluir polyethylamine a 1 mg / ml em 100 ul de NaCl 150 mM estéril.
   2. Adicionar 27 ul diluída para 223 ul polyethylamine meio de soro reduzido.
   3. Adicionar 12 ug de DNA de plasmídeo a 250 ul de meio de soro reduzido.
   4. Incubar cada tubo durante 2 min à temperatura ambiente.
   5. Combinar o polyethylamine e mistura de ADN em um único tubo e vortex durante 2 min.
   6. Incubar durante 15-20 minutos à temperatura ambiente.
   7. Substituir o meio de crescimento (Meios de Eagle Modificado por Dulbecco, 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, sem antibióticos) em 90% confluentes HEK293T com 5 ml de meio de crescimento fresco.
   8. Adicionar a mistura polyethylamine / ADN combinado para o frasco e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO _2.

3. Purificação de proteínas de ligação a GTPase

1. Lavar frascos de células transfectadas em PBS e escorrer balão durante 5 min, a aspiração de líquido livre.
2. Raspar as células em 500 ul de tampão de lise (50 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inibidor de protease) para dentro do tubo de microcentrífuga.
3. Lisar as células por misturar por inversão a 4 ° C durante 30 min.
4. Durante a lise, lavar dois lotes de esferas de 40 ul de GFP-Trap três vezes com tampão de lise fresco, grânulos que sedimentam em 2.700 xg durante 2 min entre as lavagens.
5. Esclarecer os lisados ​​por centrifugação a 21.000 xg durante 10 min.
6. Transferir o lisado clarificado de cada uma das proteínas concorrentes para separar os grânulos de GFP-trap lavadas e permitem que as proteínas de fusão GFP-para ligar durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C. Manter o lisado a partir de células de GFP-TrioD1 em gelo.
7. Lavar grânulos GFP-Trap carregadas duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), NaCl 50 mM, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 e duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), MgCl 20 mM ₂ , sedimentando esferas a 2700 xg por 2 min entre lavagens.
8. Elui-se as proteínas de fusão GFP-40 ul pela adição de 0,2 M de glicina (pH 2,5) e pipetando para cima e para baixo durante 30 seg. Imediatamente grânulos sedimento no 21.000 xg durante 60 segundos e de transferência de líquido para um novo tubo de microcentrifugadora contendo 4 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 10,4). Faça isso rapidamente para limitar os danos à proteína purificada.
9. Analisar 1 ul de cada proteína purificada por transferência de Western e detecção com um anticorpo anti-GFP para estabelecer o rendimento relativamente quantitativo utilizando um Blotting sistema de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, a determinação das concentrações de proteína pelo ácido (BCA) ensaio bicinconínico mas isso introduz erros, se as proteínas não reagem com o ensaio de uma forma idêntica ou existem proteínas contaminantes.
10. Equalizar a concentração molar da proteína pela adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl _2.

4. Nucleotide carregamento de GTPase

1. Descongelar uma aliquota de GST-Rac1 esferas magnéticas, preparado no passo 1.
2. Tomar 90 ul de esferas de GST-Rac1 e lavar três vezes com 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, utilizando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada passo.
3. Aspirar tampão dos grânulos e adiciona-se 100 ul de 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM.
4. De acordo com o PIB se, GTP ou nenhuma carga de nucleótidos é necessária para a experiência de competição, adicionar 12 ul de PIB 100 mM, 12 ul de 10 mM de guanosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTP) ou nenhum nucleótido a 60 ul de GST-Rac1 grânulos.
5. Para os controles de nucleótidos de carregamento, dividir os grânulos restantes em três alíquotas de 10 ul e adiciona-2 ul PIB 100 mM, 2 ul de 10 mM ou GTPyS não de nucleótidos para cada tubo.
6. Incubar as misturas de esferas durante 30 minutos a 30 ° C com agitação.
7. Estabilizar Rac1 ligados a nucleótidos por adição de 1 M de _MgCl2: 3 ul à mistura experimental (passo 4.4), 0,5 ul de cada uma das misturas de controlo (passo 4.5).

5. Concorrência vinculativo.

1. Configure 6 tubos de microcentrífuga, cada uma contendo:
   200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 jul experimentais contas de Rac1 carregado de nucleotídeo (a partir do passo 4.7)
   5 jul proteína Rac1 de ligação A (proteína de ligação constante)
2. Para cada tubo, adicionar 0, 1, 2.5, 5, 10 ou 20 ul de proteína de ligação a Rac1 B (proteína de ligação variável). Estes volumes assumir umaproximadamente iguais concentrações banco de proteínas de ligação constante e variável e pode precisar de ser ajustada.
   1. Ajustar o volume de proteínas de ligação A e B se existirem grandes diferenças nas afinidades de ligação das duas proteínas e isto deve ser determinado empiricamente através das repetições experimentais. Perfazer o volume total da mistura de ligação a 235 ul, por adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl _2.
3. Configurar um tubo de microcentrífuga contendo:
   200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 jul experimentais contas de Rac1 carregado de nucleotídeo (a partir do passo 4.7)
   10 ul de proteína Rac1 de ligação A (proteína de ligação constante)
4. Configure o PIB, GTPyS e sem tubos de controle de nucleotídeos:
   200 ul de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 _mM de MgCl2
   10 esferas de Rac1 controle ul carregado no passo 4.5 com o PIB, GTPyS ou nenhuma nucleotídeos e estabilizado na etapa 4.7.
   180 ul de HEK293T GFP-TrioD1 lisado, preparado como no passo 3.6
   4 ul de 1 M _MgCl2
5. Incubar a mistura durante 2 h, misturando por inversão a 4 ° C.
6. Lavar as pérolas três vezes com 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl _2.
7. Eluir proteínas ligadas, em 20 ul de tampão de amostra redutora (50 mM de Tris-HCl (pH 7), SDS a 5%, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol).

6. Análise da concorrência

1. Resolver 10 ul de a proteína ligada (passo 5.6) por electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e transferência de Western.
2. Incubar a membrana a 4 ° CO / N em anticorpo anti-GFP diluído 1/1000 em tampão de bloqueio diluído em PBS 1x, 0,1% de Tween-20 para detectar ambas as proteínas de ligação a GTPase marcados.
3. Lava-se a membrana três vezes durante 10 min com PBS, 0,1% de Tween-20.
4. Incubar a membrana durante 30 minutos à temperatura ambiente em 800 DyLight-seg conjugado anti-coelhoanticorpo secundá-, diluído a 1 / 10.000 em tampão de bloqueio diluído em PBS 1x, 0,1% de Tween-20.
5. Lava-se a membrana três vezes durante 10 min com PBS, 0,1% de Tween-20.
6. Digitalizar a membrana usando um sistema de imageamento infravermelho, usando o software para medir a intensidade da banda de acordo com o protocolo do fabricante.
7. Traçar a intensidade da banda de cada proteína contra volume do concorrente variável (Proteína B).
8. Dividir o volume de competidor variável no ponto em que as linhas se cruzam pelo volume de competidor constante (Proteína A, 5 uL) para determinar a razão de competidor no qual é conseguido o equilíbrio.
9. Para a validação do estado de carregamento de nucleótidos, para membranas de sonda activada por p21 quinase 1 (PAK1) (um efector) e GFP-TrioD1 (um GEF), conforme descrito nas etapas 6.1-6.6.

Results

Este protocolo é concebido para calcular as afinidades relativas dos parceiros de ligação para Rac1, sem a necessidade de conhecer a concentração exacta dos concorrentes (Figura 1). Determinação da concentração de proteína e introduz erros quando se considera a concorrência entre moléculas de uma via de sinalização não é necessária. No entanto, é importante saber que os dois competidores têm a mesma concentração molar das soluções de reserva para permitir proporções simples para ser calculada ao adicionar diferentes volumes de ensaio. 40 ul de contas de GFP-Armadilha têm uma capacidade de ligação de ~ 300 pmol de modo confluente 75 centímetros ^{2 frascos} de altamente células que expressam irá saturar as contas, com o resultado que os preparativos das duas proteínas de ligação diferentes será semelhante antes do ajuste (Figura 2A). Se uma das proteínas fracamente expressa, este problema pode ser superado através da purificação de proteínas a partir de que mais de um frasco de células.

8 (Figura 2B). GEFs ligam-se preferencialmente ao nucleótido-livre GTPase para estabilizar o estado de transição. Como GEFs são de baixa abundância, normalmente inativo e freqüentemente apagar mal, é melhor para sobre-expressar uma GEF GEF ou fragmento de teste GTPase livre de nucleótido. Nós freqüentemente usam o primeiro homologia Dbl de Trio, expresso como uma fusão GFP (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (Figura 2B), mas qualquer GEF iria funcionar. As proteínas que se ligam ao GTPase carregado-PIB são mais raros. Recentemente, relatou RCC2 como uma tal proteína ^7, ou PIB-carregamento pode ser validado como simplesmente binding a GEF nem nem efectora.

A saída a partir da experiência será uma mancha de Western que descreve os dois parceiros de ligação marcado com GFP ligados ao GTPase. Ao utilizar um único anticorpo para detectar ambas as proteínas, as concentrações em que quantidades similares de ambos os competidores se ligam podem ser determinados e, por conseguinte, as afinidades relativas inferida. Neste exemplo, a competição entre o domínio de hélice da proteína Rac1 de tráfico, coronin-1C (Rac1 de ligação de proteína A), e a proteína Rac1-sequestrante, RCC2 (Rac1 proteína de ligação B), é demonstrada (Figura 3A). Usando um volume constante de hélice coronin-1C (5 mL), e adicionando volumes crescentes de RCC2, podemos ver a partir da GFP blot que o equilíbrio é alcançado em 1,25-2,5 l de RCC2 (asterisco), demonstrando que tem um forte RCC2 afinidade para Rac1 que coronin-1C. Ao medir a intensidade das bandas utilizando transferência de Western quantitativa, e traçando os valores médios para cada competitoR, o ponto de equilíbrio pode ser calculada com precisão, identificando os volumes em que as curvas cruzam (Figura 3B).

Um dos possíveis obstáculos a um ensaio de competição é bem sucedido se os parceiros de ligação se ligam uns aos outros, bem como a ligação a Rac1. Na Figura 3A + B demonstramos concorrência entre RCC2 eo domínio hélice de coronin-1C, em vez de full-length coronin-1C. A razão para o uso do coronin truncado que é coronin-1C, também se liga RCC2 através do domínio da cauda. Quando full-length coronin-1C é titulada contra RCC2, a ligação de ambas as proteínas for detectada, devido à formação de complexo ternário, em detrimento da concorrência (Figura 3C). Se a concorrência está ocorrendo, a ligação de uma proteína irá aumentar, enquanto o outro diminui, e total ligada GFP-fusão permanecerá constante. Nos casos em que um complexo ternário forma que é necessário para truncar uma das proteínas de ligação de modo a que a GTPase competitors não interagem.

Figura 1. Fluxo de Trabalho. Representação esquemática do fluxo de trabalho para determinar a afinidade de proteínas de ligação GTPase usando ensaios de competição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Validação de proteínas purificadas. (A) purificada Rac1 proteínas analisadas por Western blot de ligação, sondagem com anti-GFP para determinar o rendimento relativo das duas proteínas GFP. Este tipo de equalização durante a experiência permite que a concentração das duas proteínas de ser ajustada de modo a que eles correspondem na experiência de ligação. (B) GDP, GTPyS e não carregado de nucleotídeo GST-Rac1 foi incubado com ligado de HEK293T expressando GFP-TrioD1 e proteínas detectadas por conspirar para PAK1 endógena ou overexpressed GFP-TrioD1 obrigado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Análise de Western blot de proteínas em relação vinculativa. Saídas Exemplo de ensaios de ligação da concorrência. (A) GDP-carregado Rac1 foi misturado com 5 jul GFP-coronin-1C domínio hélice e volumes crescentes de GFP-RCC2 foram titulados. Por proteínas ligadas Western blotting para GFP, problemas com a detecção diferencial das duas proteínas são evitados e o sinal GFP relata a proporção molar entre as duas proteínas de fusão. Os asteriscos indicam as relações de concorrência no eithelado r do ponto de equilíbrio. (B) intensidades das bandas de proteínas de fusão GFP encadernados de três experimentos independentes foram medidos por Western blot quantitativa, utilizando anticorpos e médias secundárias fluoróforos conspiraram para calcular a quantidade de RCC2 necessário para alcançar o equilíbrio. (C ) Exemplo de saída a partir de uma experiência em que as proteínas de ligação a Rac1 ligar uma à outra e formam um complexo ternário, em vez de competir. Rac1 foi misturado com 5 jul GFP-RCC2 e volumes crescentes de GFP-coronin-1C full-length carregado PIB foram titulados. O aumento no limite GFP-coronin-1C sem perda de limite GFP-RCC2 indica a formação do complexo ternário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve um método para comparar as afinidades relativas de pares de pequenas proteínas de ligação à GTPase. As principais etapas são a preparação de proteínas purificadas de ligação à GTPase e o carregamento de nucleotídeos da GTPase. O uso de proteínas de ligação à GTPase com a mesma marca GFP permite que as concentrações nas quais quantidades semelhantes de cada competidor se ligam sejam determinadas com precisão. O uso de GTPase carregada com nucleotídeos recombinantes permite a interrogação das propriedades de ligação da GTPase sob condições específicas de atividade. Esta etapa também é a mais sensível, pois os nucleotídeos hidrolisam e se desprendem da GTPase se as condições de magnésio não forem mantidas com precisão.

Na célula, o grande número de proteínas de ligação à GTPase combinadas com a rápida renovação de nucleotídeos torna essas vias difíceis de interpretar. A simplicidade deste método em comparar apenas pares de proteínas de ligação e usar condições de carregamento de nucleotídeos cuidadosamente controladas permite que as vias de sinalização sejam elucidadas. No entanto, a maior força do protocolo é também a maior fraqueza, pois é uma simplificação da situação in vivo . Ensaios de competição podem ser usados para construir uma hipótese robusta, mas isso deve ser testado em células por experimentos de knockdown.

Existem três características que devem ser consideradas ao selecionar as proteínas de ligação à GTPase marcadas com GFP a serem usadas no experimento. Primeiro, as proteínas de fusão devem se expressar bem em células de mamíferos, como HEK293T, pois os ensaios de competição requerem uma quantidade razoável de proteína. Em segundo lugar, deve ser possível purificar a proteína recombinante sem degradação significativa e, quando isso não for possível, a clonagem de um fragmento de ligação à GTPase deve ser considerada. Terceiro, as duas proteínas de ligação à GTPase devem se resolver uma da outra em SDS-PAGE para permitir a análise na seção 6.

Há uma série de ressalvas potenciais para o experimento que precisam ser consideradas e possivelmente abordadas:

Possível desnaturação de proteínas purificadas de ligação à GTPase durante a etapa de eluição ácida ou impedimento estérico pela etiqueta GFP. Em nossas mãos, isso não foi um problema, mas deve ser testado. As proteínas purificadas podem ser testadas em ensaios funcionais ¹⁰. Agora existem kits comerciais para testar a atividade de GEFs ou GAPs sem a necessidade de nucleotídeos marcados com isótopos. As proteínas sequestrantes, por sua natureza, protegem as GTPases da atividade de GEF ou GAP, portanto, podem ser usadas como inibidores competitivos nos ensaios comerciais de GEF ou GAP, como fizemos em nossa recente publicação ⁷. A característica relevante das proteínas que trafegam GTPase é a capacidade de se ligar à GTPase, e isso pode ser testado facilmente em um ensaio pulldown Uma abordagem alternativa para testar a integridade da proteína que é aplicável a todas as proteínas de ligação é titular a proteína eluída das esferas da armadilha de GFP com glicina com a mesma proteína removida das esferas da armadilha de GFP por clivagem enzimática. O experimento seria analisado sondando a proteína marcada com GFP e clivada com um anticorpo contra a própria proteína. Se a proteína não for danificada pela eluição, o equilíbrio deve ser alcançado na proporção de 1:1. Essa abordagem também indicaria se a presença da própria etiqueta GFP compromete as propriedades de ligação da proteína candidata, embora isso exija a produção de uma construção com um local de clivagem enzimática entre a etiqueta e a proteína de ligação. Se a proteína é comprometida pela etiqueta ou pela etapa de eluição, o problema pode ser resolvido modificando o protocolo para usar um método de purificação alternativo. Em vez de GFP, as proteínas de ligação podem ser marcadas com His, purificadas usando Ni-NTA e analisadas usando um anticorpo contra a marca His. A característica importante é que ambas as proteínas de ligação devem compartilhar uma etiqueta comum, embora, se necessário, duas marcas possam ser adicionadas a uma proteína, uma para purificação e outra para detecção.

O protocolo é projetado para investigar a competição entre as interações com os domínios I / II do switch. Embora a maioria das interações GTPase sejam mediadas por esse motivo, existem algumas exceções, principalmente as interações de GDIs que se ligam à cauda do prenil, além de obscurecer os domínios de troca. Em princípio, o protocolo poderia ser adaptado para usar GTPase purificada de células de mamíferos, de modo que a GTPase seja prenilada, no entanto, a presença de múltiplos sítios de ligação ou efeitos alostéricos complicam a interpretação dos dados de ligação à competição. Outros problemas associados a tal modificação são que os GDIs co-purificam com GTPase de células de mamíferos, comprometendo a pureza das proteínas isoladas e a natureza hidrofóbica dos grupos prenil significa que as GTPases preniladas estão associadas a GDI ou membrana lipídica e tais fatores precisariam ser considerados no experimento.

A quantidade de GST-Rac1 sendo usada no ensaio. A proteína de ligação constante à GTPase deve estar em uma concentração maior do que a Rac1, ou quando o competidor é adicionado, ela simplesmente se ligará ao Rac1 livre. Será imediatamente óbvio se isso aconteceu quando a ligação do competidor, sem perda da proteína constante, será detectada da mesma forma que quando as duas proteínas concorrentes se ligam uma à outra, conforme mostrado na Figura 3B. Como controle adicional (Etapa 5.3), uma reação de ligação contendo o dobro da quantidade de proteína de ligação constante e nenhuma proteína de ligação variável deve ser incluída (Etapa 5.3). Se o Rac1 no experimento de titulação estiver saturado, dobrar a quantidade de proteína de ligação constante não terá efeito na saída. Os volumes sugeridos no protocolo devem ser apropriados, mas a quantidade de Rac1 pode ser facilmente reduzida. Se for observada a ligação do competidor sem perda do parceiro de ligação constante, deve-se tentar reduzir a quantidade de Rac1 antes de tentar mapear os locais de ligação para evitar a formação de complexos ternários.

Interação não específica de proteínas de ligação à GTPase com o GST ou bead, bem como especificamente com Rac1. Este problema se manifestaria pela ligação residual da proteína de ligação constante à GTPase, mesmo quando a proteína variável de ligação à GTPase atingiu um platô em alta concentração. A identificação desse problema será auxiliada pela realização de experimentos recíprocos em que as proteínas de ligação à GTPase constantes e variáveis são trocadas. Experimentos recíprocos também melhorarão muito a precisão da estimativa do ponto de equilíbrio, portanto, devem sempre ser incluídos. Em casos de ligação não específica, as concentrações relativas nas quais o equilíbrio é alcançado ainda podem ser calculadas comparando a intensidade da banda entre os máximos e mínimos para cada proteína, ou medindo a extensão da ligação não específica usando grânulos GST como isca, em vez de GST-Rac1.

Ensaios pull-down usando diferentes condições de carga de nucleotídeos devem ser usados para complementar o ensaio de competição descrito neste protocolo. Determinar a preferência de nucleotídeos dos parceiros é importante tanto para entender os eventos de competição quanto para entender a via de sinalização na qual a proteína de ligação à GTPase está envolvida. Na Figura 2B , analisamos a ligação de proteínas com preferência estabelecida por GTPase carregada ou livre de nucleotídeos como meio de validar o carregamento de nucleotídeos. No entanto, é sensato investigar o efeito da carga de nucleotídeos em cada um dos competidores também. Se os concorrentes hipotéticos mostrarem preferências diferentes, a competição contribuirá menos para a via de sinalização e, de fato, a renovação de nucleotídeos provavelmente será o mecanismo que direciona a troca das proteínas de ligação.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
Inibidor de protease COMPLETO	Roche	05 056 489 001
Grânulos magnéticos de glutationa	Pierce	88821
Polietilenonimina, ramificada, média Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamina	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Altamente instável. Alíquota e armazenar a -80 imediatamente após a reconstritução
GTP & gama; S	Sigma Aldrich	G8634	Altamente instável. Alíquota e armazene a -80 imediatamente após a reconstritução
Buffer de bloqueio	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma	Aldrich P9416
Anticorpo anti-GFP	Colors	632592	Use na diluição de 1/1000
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado DyLight 800		da Fisher Scientific
	Uso de sinalização celular	2602S	em diluição de 1/1000
Odyssey SA Sistema de imagem infravermelha	Li-cor	9260-11PC