Este protocolo de vídeo descreve um método sensível, confiável e rápido para avaliar os déficits neuromusculares em um modelo de camundongo transgênico de esclerose lateral amiotrófica.
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Artigo de método
Um sistema de pontuação neurológica rápida fenotípica para a Avaliação de progressão da doença na SOD1 G93A-Rato modelo de ALS
Neste artigo
Resumo
Resumo
O camundongo transgênico SOD1-G93A é o modelo animal mais amplamente utilizado de esclerose lateral amiotrófica (ELA). Na ALS TDI, desenvolvemos um protocolo de triagem fenotípica, demonstrado em vídeo aqui, que avalia de forma confiável a função neuromuscular de camundongos SOD1-G93A de maneira rápida. Este protocolo engloba um sistema de pontuação neurológica simples (NeuroScore) projetado para avaliar a função dos membros posteriores. O NeuroScore está focado na função dos membros posteriores porque os déficits dos membros posteriores são o primeiro sinal neurológico relatado de doença em camundongos SOD1-G93A. O protocolo desenvolvido pela ALS TDI fornece uma avaliação imparcial do início da paresia (paralisia leve ou parcial), progressão e gravidade da paralisia e é sensível o suficiente para identificar alterações induzidas por drogas na progressão da doença. Neste relato, a combinação de um manuscrito detalhado com vídeo minimiza as ambiguidades de pontuação e a variabilidade entre os experimentadores, permitindo que o protocolo seja adotado por outros laboratórios e permitindo comparações entre estudos realizados em diferentes ambientes. Acreditamos que este protocolo de vídeo pode servir como uma excelente ferramenta de treinamento para pesquisadores atuais e futuros da ELA.
Introdução
Desde o seu desenvolvimento em meados de 1990, o modelo de camundongo transgênico SOD1-G93A tem sido o modelo animal mais utilizado da esclerose lateral amiotrófica (ELA) 1. Este modelo de ratinho transgénico foi geneticamente manipulada para sobre-expressar uma forma mutante do gene de Cu / Zn superóxido dismutase humana 1 (SOD1) portador da ALS-glicina associada a mutação da alanina no aminoácido 93 (G93A). A mutação G93A é uma das muitas mutações no gene SOD1 que colectivamente make-up de cerca de um quinto casos de ALS familiar 2.
O modelo SOD1-G93A tornou-se uma força de trabalho de pesquisa de desenvolvimento de drogas ALS porque, além de sua óbvia ligação genética para ALS, ele recapitula muitas das características patológicas do ALS em seres humanos, como a perda do neurônio motor, fraqueza muscular progressiva e atrofia, com eventual paralisia e morte 3. Embora, como é frequentemente o caso com os modelos animais transgénicos, existe uma bi inerenteological variabilidade associada com os ratos SOD1 G93A-. Scott et ai. ter determinado que as coortes de pelo menos 24 ratinhos com equilíbrio de gênero de correspondência de maca são necessários em projetos de estudo fármaco-eficácia, a fim de superar o ruído criado pela variabilidade biológica 4. O grande número de animais necessários nestes estudos, em combinação com a progressão da doença agressiva e a necessidade de acompanhamento diário proíbe a utilização de, técnicas demoradas e potencialmente estressantes elaboradas para medir força e função neuromuscular (por exemplo, eletromiografia, força de preensão, rotorod , etc). Em vez disso, ele destaca a necessidade de uma ferramenta de triagem in vivo que avalia de forma confiável a função neuromuscular de camundongos SOD1-G93A de uma forma rápida.
No ALS TDI foi desenvolvido um protocolo que permite a avaliação confiável da função neuromuscular de camundongos SOD1 G93A-em menos de 30 segundos por rato em média. Este protocolo encompasses avaliação diária da função dos membros posteriores utilizando um sistema simples de pontuação neurológica (NeuroScore), que é descrita neste relatório na imprensa e em vídeo. NeuroScore está focada em função dos membros posteriores porque os déficits dos membros posteriores são os primeiros relatados sinal neurológico da doença nos ratos SOD1 G93A-5,6. Além disso, o protocolo desenvolvido pela ALS TDI fornece uma avaliação imparcial do início da paresia (paralisia leve ou parcial), progressão e gravidade da paralisia e é sensível o suficiente para identificar as alterações induzidas pela droga na progressão da doença.
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Protocolo
Todos os experimentos são conduzidos de acordo com os protocolos descritos pelos Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais e foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e uso comitê do ALS TDI (IACUC).
1. Os animais, habitação e desenho do estudo
Nota: O rato colônia SOD1-G93A foi derivado do elevado número de cópias B6SJLTgN (SOD1G93A) estirpe 1Gur originalmente produzido por Gurney et al 7.. A colónia está actualmente a ser mantido pelo cruzamento de machos transgénicos C57BL / 6-SJL com o tipo selvagem fêmeas C57BL / 6-F1 SJL. Os animais F1 são gerados pelo cruzamento de SJL machos com fêmeas B6. Os ratinhos são enviados para a ALS TDI semanal em 35-45 dias de idade.
- Permitir ratinhos pelo menos uma semana de aclimatação à unidade de animais (12-h luz / escuridão a uma temperatura de 18-23 ° C e 40-60% de humidade) antes de atribuir a um estudo.
- Casa masculino SOD1 G93A-mice um rato por gaiola, desde grupo alojados machos tendem a lutar. Casa ratos fêmea SOD1-G93A até dois por gaiola. Proporcionar um enriquecimento ambiental, na forma de cabanas de plástico. Fornecer alimentos e água ad libitum, a menos que os ratos são parte de um estudo que requer a administração do fármaco em água potável / alimento. Nestes casos, ração e comida registro e água.
- Começar um estudo fármaco-eficácia em torno de 50 dias de idade e incluem 64 camundongos com equilíbrio de gênero de correspondência de maca (32 por coorte). Por fim, garantir que os investigadores realizam os estudos estão cegos para as condições experimentais.
Nota: É recomendado que um estudo típico droga-eficácia começa no dia de idade 50 Contudo, com base no tipo de intervenção terapêutica pode ser preferível começar o estudo mais cedo ou mais tarde.
Nota: Um estudo com 32 ratos por grupo é alimentado para detectar drogas efeitos específicos de cada sexo. Se não forem necessárias comparações específicas de gênero, 24 ratos por grupo deve ser suficiente para detectar drogas efeitos globais.
2. Peso Corporal
- Os pesos corporais para todos os ratinhos a ficha em estudos diariamente com uma precisão de um décimo de um grama. Nota: O peso corporal é um indicador sensível da progressão da doença e de qualquer mal-estar que pode resultar do tratamento crônico de drogas.
- Corpo pesos mouse variar consideravelmente durante o curso de um dia, sendo maior no período da manhã, assim gravá-los em torno do mesmo tempo todos os dias.
3. Neurological Scoring System (NeuroScore)
- Avaliar pontuações neurológicas (NS) para cada rato diariamente, observando o mouse sob as seguintes três condições realizadas sequencialmente: a) o mouse é suspenso pela cauda, b) o mouse é permitido andar, e após o início da paralisia c) a rato é colocado no seu lado.
- Para o teste de suspensão pela cauda, segurar o rato de cerca de 1,5 "a partir da base da cauda sobre a parte superior do fio da sua gaiola durante 1-2 segundos, para longe da bacia de alimentos, enquanto observing membros posteriores. Repita o teste de suspensão 3 vezes e registar o resultado mais consistente.
- Para o teste de caminhada, coloque o mouse sobre uma superfície limpa que fornece alguma tração e uma curta distância de 25 cm (eg., Uma toalha de papel gravada para baixo para evitar o deslize). Permitir que o mouse para andar um total de 75 cm (comprimento 3X da toalha de papel), observando a marcha.
- Para o teste de "reflexo de endireitamento", coloque o mouse sobre o lado esquerdo ou direito e usando um cronômetro medir o tempo que leva para se endireitar-se sem ajuda de ambos os lados. Nota: Apenas um estudo deste teste é necessário.
- Determine o NS de cada membro posterior (esquerda ou direita) de forma independente em uma escala de 0 a 4. Nota: Por exemplo, uma pontuação de 0, 1 indica que o membro esquerdo NS é 0, enquanto o direito dos membros posteriores NS é 1.
- Atribuir pontuações neurológicas (0-4) que correspondem ao seguinte conjunto de observações (resumo no Quadro 1):
- Atribuir NS 0 (pré-sintomático) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior apresenta um splay normal, ou seja, ele está totalmente estendido longe da linha média lateral e permanece nessa posição por 2 segundos ou mais longo. Quando o mouse é permitido andar, marcha normal é observado.
- Atribuir NS 1 (primeiros sintomas) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior apresenta um splay anormal, ou seja, é recolhido ou ruiu parcialmente em direção a linha média lateral ou ela treme durante a suspensão da cauda ou é retraída / apertou. Quando o mouse é permitido andar, marcha normal ou um pouco lento é observado.
- Atribuir NS 2 (início da paresia) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, o membro posterior é parcial ou completamente destruídas, não se estendendo muito. (Há ainda pode ser o movimento articular). Quando o mouse é permitido andar, o membro posterior é usado para mot frenteion no entanto enrolar os dedos dos pés para baixo, pelo menos duas vezes durante a 90 centímetros caminhada ou qualquer parte do pé está se arrastando ao longo fundo da gaiola / table. Quando o mouse é colocado em seu lado esquerdo e direito, ele é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados.
- Atribuir NS 3 (Paralisia) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, há paralisia rígida na hindlimb OU movimento articular mínima. Quando o mouse é permitido andar há movimento para a frente no entanto, o membro posterior não está sendo usado para o movimento para a frente. Quando o mouse é colocado em seu lado esquerdo e direito, ele é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos de ambos os lados. Nota: Raramente, após o início da paralisia, umidade urina pode aparecer nos membros posteriores. Umidade urina não tratada pode resultar em urina "queimadura" e lesões de pele. Trate umidade urina por corte o cabelo, aplique água morna para remover absorve a urina, e secar delicadamente. Se as lesões cutâneas estão presentes aplicar antibioTic pomada.
- Atribuir NS 4 (Humane ponto final) se o seguinte é observado: Quando o mouse é suspenso pela cauda, há paralisia rígida nos membros posteriores. Quando o rato é permitido a andar, não há movimento para a frente. Quando o mouse é colocado sobre a sua esquerda e direita ele não é capaz de endireitar-se dentro de 10 segundos a partir do lado também. Ou seja, ausência de reflexo de endireitamento.
4. Entrada de Dados e Análise
- Durante o curso de um estudo de eficácia da droga, inserir os dados coletados para cada rato em um Sistema de Gerenciamento de Informações de Laboratório (LIMS) ou em um software de planilha disponível no mercado.
Nota: O software LIMS ALS TDI-desenvolvido é um repositório central de todos os dados coletados a partir de estudos internos, tornando estes dados convenientemente acessível ao longo do tempo para os pesquisadores ALS TDI. LIMS rastreia qualquer ratinho individual, com a sua identificação única, de volta à sua linhagem, peso corporal ou pontuação neurológica em todos os dias de estudo,e inclui quaisquer outras observações feitas durante a sua vida. LIMS acaba por gerar uma planilha que é usado para análises posteriores. - Após a conclusão de um estudo de drogas eficácia, ou seja, quando todos os ratos atingir o ponto final mais humano, software uso de planilha (consulte a Tabela de Materiais) para calcular a NS combinado para cada rato, para cada dia pela média do membro posterior esquerda e direita NS . Em seguida, calcular a idade média a cada NS para cada rato e do número de dias de cada rato gasta em um determinado NS.
- Analisar as mudanças globais em NS ao longo do tempo, importando os dados do software de planilha eletrônica para o software estatístico (ver Tabela de Materiais). Caber estes dados utilizando um modelo de regressão logística ordinal que estima o NS esperado, com idade média no NS e de tratamento da toxicodependência como efeitos na regressão. Usando o teste do qui-quadrado de log-rank estimar a probabilidade efeito probabilidade e determinar se o efeito da droga-tratamento sobre a progressão NS é estatísticaly significativa (ver arquivo de código suplementar para obter instruções passo-a-passo).
Nota: Um valor de p <0,05 é considerado estatisticamente significativo.
Nota: Este método de análise estatística respeita a natureza ordinal dos dados NS e à natureza variável das trajetórias NS para ratos individuais. É preferível porque as trajetórias individuais NS pode ser marcadamente diferente resultando em NS médias de grupo associado em tempo que não são suficientemente reflexiva de respostas NS. Além disso, em alguns casos NS pode flutuar, particularmente quando na gama de zero a um. - Finalmente, o uso de software de gráficos (ver Tabela de Materiais) para gerar "ordinal esperado NS vs Idade mediana no NS" gráficos para animais tratados com a droga e controle (Figura 2; consulte Código Suplementar arquivo para obter instruções passo-a-passo). Use estes gráficos para estimar convenientemente deslocamentos entre os grupos tratados com o fármaco e de controlo pela interpolação do eixo-y a idade média de início da doença (i.e., NS 2) no eixo dos x.
Nota: A diferença na idade média entre os dois grupos representa uma mudança induzida por drogas e é considerado como uma medida prática da magnitude do efeito.
Nota: desvios para a direita na curva de NS vs idade mediana esperada indicam retardou a progressão da doença sintomática. Por outro lado, os desvios para a esquerda na NS vs a curva idade mediana esperada acelerado indicam a progressão da doença sintomática.
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Resultados
Os dados da contagem neurológicos para 90 do sexo masculino e 94 do sexo feminino não-tratados ratos SOD1 G93A-estudou em ALS TDI durante 2014 foram avaliados. Os resultados mostram que os ratos macho têm tipicamente uma progressão da doença mais agressivo do que os ratos do sexo feminino, tal como evidenciado por uma proporção maior da sua vida útil no NS 1 em comparação com as fêmeas. NS 2 e 3 NS ocorrem com praticamente a mesma frequência de diferentes sexos. 0 NS foi excluído da análise, porque é considerado um fenó...
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Discussão
Neste relatório, nós descrevemos um protocolo de vídeo rápido e simples que, se aplicada corretamente, é capaz de avaliar de forma confiável a progressão da doença em camundongos SOD1-G93A e identificar as alterações induzidas pela droga. Embora diferentes grupos desenvolveram sistemas de pontuação fenotípicas para ratos SOD1 G93A-8-10, que muitas vezes não fornecem detalhes suficientes sobre o procedimento e são insuficientes para replicação. Como resultado, sistemas de pontuação são raramente utilizadas for...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Beth Levine pela revisão crítica do manuscrito, Valerie Tassinari pelo desenvolvimento do protocolo de genotipagem e Matt Ferola e Carlos Maya por seus excepcionais cuidados com os animais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cepa B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Cepa de camundongos usada neste estudo |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Manutenção de colônias | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Modelo N14120 | Usado para pesar camundongos |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | Comida úmida fornecido a camundongos doentes | |
| Dieta Irradiada para Animais de Laboratório | Harlan, Indianápolis, IN | 2918-111914M | Dieta para ração |
| Sani-chips de grau laboratorial | Harlan Teklad, Indianápolis, IN | 7090 | Roupa de cama |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, Carolina do Norte | ; v10.0.2 | Software estatístico |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Software de planilha |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Software gráfico |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | Para enriquecimento ambiental |
Referências
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Reimpressões e permissões
