Usando Ex Vivo Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Regeneração de órgãos in vivo em seres humanos é muito limitada; por conseguinte, a engenharia de tecidos, o desenvolvimento dos tecidos e órgãos individuais de células doadas por um hospedeiro, é cada vez mais atraente uma terapia potencial para a substituição de órgãos. No entanto, para esta estratégia terapêutica para ser bem sucedido, os fatores e interações celulares envolvidos na morfogênese do órgão deve ser cuidadosamente estudado e bem-compreendido. Devido à incapacidade para estudar o desenvolvimento de órgãos específicos com abordagens tradicionais, os investigadores voltaram-se para alternativa embrião inteiro ou culturas de órgãos inteiros. Kalaskar et al. ¹ têm demonstrado que ex vivo toda a embriogênese cultura produz resultados comparáveis ​​(em 58% dos embriões cultivados) no desenvolvimento do útero, o que sugere que ex vivo métodos de cultura são uma alternativa viável para estudos de organogênese.

Um sistema de cultura de órgão individualizado, tal como este ex vivo droPlet sistema de cultura, permite a toda a análise de órgãos independente de efeitos sistémicos, enquanto permite a manipulação de uma via de sinalização específica ou interacções celulares através de adição de reagentes farmacológicos ou anticorpos. Tradicionalmente, o estudo do desenvolvimento dos órgãos do feto tem sido limitada às tecnologias transgénicos e knockout do rato, em adição aos reagentes farmacológicos entregues maternalmente. No entanto, existem problemas técnicos envolvendo essas técnicas e tratamentos in vivo; a maioria das preocupações giram em torno dos efeitos de influenciar vários órgãos simultaneamente, que muitas vezes resulta em letalidade embrionária. Uma preocupação adicional dos estudos manipulando o desenvolvimento do feto é farmacologicamente o efeito materno de drogas no desenvolvimento embrionário no útero (por exemplo, metabolismo materno do fármaco antes de alcançar o embrião) e se tais reagentes podem passar através da barreira da placenta.

A técnica de cultura de órgão inteiro descritoaqui foi adaptado a partir de um primeiro protocolo descrito por Maatouk et al. ^2, em que gônadas fetais inteiras são incubadas ex vivo em culturas de gotículas na posição vertical. Uma vantagem significativa da cultura gônadas fetais é que os inibidores de pequenas moléculas podem facilmente acessar todo o órgão por difusão simples. . DeFalco et ai demonstraram que utilizando este método ex vivo gota cultura em conjunto com inibidores de moléculas pequenas podem ser usados ​​para estudar processos e das interacções que ocorrem durante o desenvolvimento das gónadas ³ sinalização; estes processos seria difícil de examinar in vivo, devido aos desafios técnicos (por exemplo, a passagem das drogas através da placenta ou letalidade de afectar vários órgãos utilizando abordagens genéticas ou farmacológicos).

A cultura gota não é apenas uma melhoria em certos aspectos mais na experimentação útero, mas também é uma melhoria em relação in vitro e ex visistemas VO bem. A utilização de linhas de células para estudar a morfogénese é extremamente difícil porque lhes faltam os tipos de células diferentes, não têm componentes críticos da matriz extracelular (ECM) que permitem a formação de arquitectura de órgãos, e podem exibir artefactos em cascatas de sinalização. Embora a engenharia de tecidos fez melhorias significativas na criação de andaimes simulando ECM, a falta de conhecimento em relação aos quais são os sinais necessários para cada tipo celular durante a organogénese torna difícil construir um sistema do órgão in vitro. Outros sistemas ex vivo foram previamente estabelecido para estudar a organogênese, ou mais especificamente morfogênese, e tem sido muito bem sucedida para geração de imagens ao vivo de órgãos fetais em agar ^4, transwells ^{5, 6} filtros, e outras matrizes de andaime ^7,8. A vantagem do sistema de cultura de gotícula é que ele permite o estudo da morfogénese, proporcionando a capacidade de utilizar menos reagentes, que são Often caro, mas dando também a tensão da superfície de órgãos, o que é importante para o crescimento e capacidades de sinalização ^9.

No rato, a morfogênese testículo inicial ocorre entre embrionário (E) encena E11.5 e E13.5; estas fases compreendem a janela de tempo óptimo para factores que influenciam a diferenciação específicos do sexo examinar. Entre os processos críticos que ocorrem durante a formação dos testículos são a geração de arquitectura cabo de testículo e a formação de uma rede vascular específico do testículo. Utilizando este conjunto de órgãos ex vivo sistema de cultura gota, uma é capaz de alterar a vascularização específicos de macho e testículo inibir a morfogénese, através da utilização de um inibidor de molécula pequena que bloqueia a actividade dos receptores para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); Remodelação vascular mediada por VEGF é crítico para o desenvolvimento dos testículos ^10-12. Esta técnica pode ser aplicada com sucesso para outros órgãos e pode ter como alvo tempo específicojanelas de desenvolvimento. Whole-mount imagens de órgãos permite a visualização de estruturas vitais, bem como mudanças estruturais e celulares decorrentes da administração de vários inibidores. Importante, este sistema é vantajosa na medida em que o pesquisador pode ignorar os potenciais efeitos de confusão de administração da droga materna ou perturbação sistémica in vivo durante estratégias gene alvo. Assim, todo esse órgão ex vivo sistema de cultura gota pode melhorar significativamente a capacidade de compreender as interacções e de sinalização que ocorrem especificamente dentro de determinados órgãos durante o desenvolvimento fetal.

Todos os ratos utilizados nestes estudos eram ratinhos CD-1 obtidos de Charles River Laboratories. Experiências de cultura anteriores foram também realizados em outras estirpes, tais como C57BL / 6J (dados não mostrados), mas qualquer estirpe pode ser utilizada. Fêmeas adultas grávidas foram aproximadamente 2-3 meses de idade e foram sacrificados por meio de _inalação de CO2, seguido por deslocação cervical e toracotomia bilateral antes da remoção do embrião. Os ratos foram alojados em conformidade com as diretrizes do NIH, e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Hospital Medical Center de Cincinnati Children animal Institucional.

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Prepara-se uma solução de etanol a 70%. Água deionizada Autoclave (para fazer as câmaras humidificadas e para fabrico de soluções / diluição). Esterilizar instrumentos de dissecação (pinças, tesouras, e 27 g de seringas de agulha) por pulverização para baixo com etanol 70%.
2. Preparar10X de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cálcio e magnésio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, 2,4 g _de KH 2 PO _4, 6,75 ml de 1 _M de CaCl2, 3,75 ml de 1 M _MgCl2 ). Agita-se a dissolver-se em 1 L de água estéril e autoclavada em seguida o filtro com papel de filtro. Dilui-se 10 vezes com água para fazer 1X PBS.
3. Inactivar pelo calor soro fetal de bovino (FBS) a 55 ° C durante 30 minutos e filtra-se esterilizar com um filtro de seringa de 0,22? M.
4. Preparar 38 ml de 1X meio de cultura completo (DMEM completo chamado, cDMEM), que consiste de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de FBS filtrado diluição inactivado pelo calor e 1/100 de estoque de penicilina-estreptomicina. Isso geralmente devem ser usadas frescas, mas pode ser armazenado a 4 ° C durante 1 mês.
5. Reconstituir o receptor tirosina Kinase Inhibitor II (TKI II) em DMSO para uma concentração de reserva de 5 mg / ml, e diluir com estoque cDMEM para fazer uma solução de trabalho. O con definitivacentração para este estudo é 1,875 mg / ml em cDMEM. De acordo com as recomendações da empresa, soluções de reserva são estáveis ​​por até 6 meses a -20 ° C. Quanto a soluções de trabalho, fazer fresco e utilizar no mesmo dia.
   Nota: A concentração da droga na solução de trabalho deve ser duas vezes maior do que a concentração final desejada (uma vez que será diluída duas vezes na gotícula). Ao mesmo tempo, preparar o mesmo volume de cDMEM contendo o mesmo volume de DMSO para o tratamento de "controlo".
6. Prepare os reagentes de digestão da cauda (NaOH 50 mM e 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) separadamente em água destilada.
7. Faça um balanço dos iniciadores de PCR XY 25 mM (XY Atacante 5'-TGG TGA AGC TTT CTT TGA G-3 'e XY reversa 5'-CCG CTG TCT CCA AAT TTG G-3'), juntamente com água livre de nuclease.
8. Preparar tampão 50X TAE (242 g de Trizma base, 57,1 mL de ácido acético glacial, 100 ml de 0,5 M de EDTA, pH 8,5, e adicionar água a 1 L fio volume final). Preparar tampão de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluída com água até 1 L de volume total).
9. Para criar uma solução de agarose a 2,5% (0,625 g de agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de água), solução de agarose calor no microondas até ferver, em seguida, deixe esfriar até cerca de 55-65 ° C (capaz de tocar). Quando esfriar, adicione 2 ml de solução de brometo de etídio a 1%, e despeje gel.
   CUIDADO! O brometo de etídio é um agente mutagênico e teratogênico; por favor, use luvas de borracha nitrílica e protocolo de segurança adequado ao manusear. Em alternativa, outros agentes de gel de resolução potencialmente menos tóxicos ou corantes podem ser utilizados.
10. Preparar solução de bloqueio (PBS com 0,1% de Triton X-100, 10% de soro fetal de bovino [FBS], e 3% de albumina de soro bovino [BSA]) por imunofluorescência.
11. Preparar a solução de lavagem (PBS com 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, e BSA a 3%) para imunofluorescência.
12. Prepare PbTx (PBS com 0,1% de Triton X-100) por imunofluorescência.
13. Prepare as câmaras de incubação para cuLTURE. Preencha grandes pratos (100 mm de diâmetro) de Petri com 35 ml de água autoclavada. Coloque perto de onde dissecção e culturas será realizada.

2. Isolamento de Fetal Testes de Mus musculus

1. Verifique o rato fêmea para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia no dia em que é detectado o rolhão vaginal é considerado E0.5. Euthanize o mouse fêmea grávida em E11.5, de uma forma consistente com os protocolos de animais aprovados.
2. Spray para baixo abdômen rato com etanol 70%.
3. Abra a pele da barriga e do peritoneu com uma incisão em forma de V usando tesoura fina e puxe retalho de tecido para trás para expor os órgãos internos.
4. Localize os ovários em ambas as extremidades do corno uterino. Com uma tesoura, cortar no ovário e do tecido conjuntivo para separar o útero contendo os embriões a partir do corpo da mãe.
5. Abrir a parede uterina cortando cuidadosamente o lado oposto da placenta, expor os sacos de gema. Seja cuidadoso para não puncture saco vitelino de embriões para evitar danificar ou perder.
6. Corte perto da placenta para remover os sacos de gema contendo o embrião e colocá-los num prato contendo PBS com cálcio e magnésio. A presença de iões de cálcio e de magnésio ajudará a moléculas de adesão celular de suporte para manter a arquitectura do tecido e evitar que o tecido que adere às ferramentas de dissecação.
7. Com uma pinça, remover o saco vitelino e âmnio do embrião por punção cuidadosamente o saco vitelino para criar um orifício no qual o embrião pode deslizar para fora. Uma vez que o embrião está fora do saco vitelino, o corte do cordão umbilical.
8. A partir deste ponto em diante, usar um microscópio localizado num capuz de cultura de tecido estéril. Retire a cabeça do embrião e descarte por beliscar com uma pinça de cada lado do pescoço.
9. Retire a cauda e coloque em um novo tubo de microcentrífuga para análise XY PCR para determinar o sexo do embrião.
   Nota: Embora seja óptima para gónadas cultura o mais rapidamente possível após a colheita, é também possível remover ADN da cauda e executar XX / XY genotipagem antes da cultura, de modo que o sexo de cada embrião é conhecido e apenas o sexo desejado precisa de ser cultivadas. Enquanto a genotipagem está a ser feito, os embriões podem ser mantidas separadas (de modo que eles podem ser rastreados) a 4 ° C ou sobre gelo até estar pronta para a cultura. Uma ressalva é que este período fora no útero ou de cultura de condições podem potencialmente afectar a viabilidade para a cultura ou desenvolvimento posterior durante a cultura.
10. Prenda o embrião em decúbito dorsal contra a parte inferior da placa de cultura fixando as axilas de embrião com um par de fórceps (geralmente a pinça na mão fraca). Manter esses fórceps no lugar para segurar o embrião ainda durante todo o processo de dissecação.
11. Em conjunto com outro par de fórceps, retire a pele cobrindo abdômen e remover suavemente fígado, intestinos e outros órgãos para expor a parede traseira do corpo.
12. Como as gónadas será localizada na parede do corpo para trás em ambos os lados da aorta dorsal,um grande vaso sanguíneo que corre ao longo da linha média do corpo, por baixo do cume colher urogenital com uma pinça fechadas e remover o cume urogenital abrindo os fórceps e levantando-se. Como as gônadas serão livremente fixado à parede, tenha cuidado para não puxar para cima muito rápido, sem retirar essas conexões ou as gônadas pode esticar, causando danos aos órgãos.
13. Mova o cume urogenital em cDMEM em um prato para se aclimatar tecido a mídia.
14. Separa-se o complexo gónadas-mesonephros do resto do rebordo urogenital utilizando agulhas 27 G. Use uma agulha para cortar, pressionando para baixo e usar o outro para orientar o tecido corretamente para permitir a separação ideal. Evite usar um movimento de corte contra o fundo do prato, como agulhas afiadas irá criar pedaços de plástico que pode furar o tecido. Certifique-se de manter os mesonephros completamente ligados à gônada.

3. A cultura de Gonad com um inibidor da pequena molécula

1. Definir dois 20 μl pipetas de 15 ul cada. Cortar cerca de 1-2 mm de uma das pontas de pipeta barreira usando uma lâmina de barbear limpo, esterilizado para a transferência das gônadas e adição de controle cDMEM, enquanto a outra pipeta será usado exclusivamente para cDMEM tratado com o fármaco.
2. Alinhar com gónadas seu eixo longo paralelo para a ponta da pipeta de modo que eles podem ser facilmente pipetada utilizando a ponta de corte. Tenha cuidado com gônadas degola para o interior da ponta da pipeta.
3. Rotular um lado que a gotícula de controlo e o outro como a gota contendo o fármaco. Apenas duas gotas pode caber em uma tampa prato de 35 mm. Certifique-se de que os rótulos sobre tampas coincidir com os rótulos em microtubos contendo cauda do tecido.
4. Pipetar 15 ul de cDMEM contendo um único gónada em uma gota na tampa de uma pequena (35 mm) (prato de cultura de usar somente as tampas, como os fundos são demasiado altos para se ajustar dentro de uma câmara humidificada placa de Petri). Colocar duas gotas contendo gónadas separadas em ambos os lados do prato, FR bem separadosom uma outra. Verificar sob o microscópio para assegurar que as gónadas tenham sido transferidas para as gotículas.
5. Para a gotícula designada como controlo, adicionar um adicional de 15 ul de DMSO contendo cDMEM (feito no passo 1.5) para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilize apenas a pipeta de "controle" que não vai entrar em contato com a droga.
6. Para a outra gotícula (amostra tratada com drogas), adicionar 15 ul de TKI-II contendo cDMEM para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilizar apenas a pipeta designada para as amostras tratadas com droga.
7. Utilizando a pipeta, espalhar-se as gotículas de um padrão circular em expansão até que eles são cerca de 15-18 mm de diâmetro e da gónada é colocado aproximadamente no meio. Orientar a gônada para que ele fique do seu lado e da gônada e mesonephros são facilmente distinguíveis. Orientar o pulmão, de modo que os dois lóbulos estabelecer plana.
   1. Apesar de o diâmetro das gotículas podem variar ligeiramente, garantir que gônadas não são floating e são mantidos no lugar pela tensão superficial. Certifique-se de que as gotas não tocam um no outro, ou o lado da tampa. Sem a tensão superficial, os órgãos vão crescer sobre a tampa durante a cultura e achatar, distorcendo assim a morfologia do órgão.
8. Cuidadosamente coloque a tampa prato de cultura contendo as gotículas na posição vertical sobre a superfície da água no grande (100 mm) humidificador prato. Assegurar que não existem bolhas de ar por baixo da parte inferior da tampa e que é deitado sobre a superfície da água. Não inverter a tampa e tenha cuidado para não deixar a água tocar o topo da tampa, onde as gotas estão localizados.
9. Para criar uma pequena câmara humidificada, cobrir imediatamente com a tampa do prato maior do humidificador para delimitar as culturas gônadas. Agir o mais rápido possível para minimizar qualquer evaporação da mídia. Certifique-se de que o prato menor tem espaço entre ele ea tampa do prato maior para se movimentar livremente; caso contrário, a condensação pode fazer um selo e ba troca de ar de bloqueio para o tecido.
10. Uma vez que duas pequenas tampas são colocadas no interior da câmara, colocar imediatamente a câmara para dentro da incubadora. Incubam-se as culturas durante 48 horas de gotículas numa atmosfera humidificada com CO ₂ incubadora a 37 ° C.

4. Polymerase Chain Reaction para determinar o sexo de embriões

1. Adicionar as caudas embrionárias a parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicionar a cada tubo 200 ul de NaOH a 50 mM.
3. Coloque a 95 ° C durante 15 minutos ou até que o tecido está completamente dissolvido.
4. Adicionar 50 ul de 1M Tris-HCl e vortex levemente e brevemente.
5. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, fazer um novo PCR master mix multiplicando cada volume ao número total de amostras: 0,5 ul de solução de primário de 25 um, com 2,5 uL 10X tampão Taq, 0,5 ul de dNTPs 10 mM (nucleótidos), 19,3 ul de nuclease água livre, 0,2 ul Taq DNA polimerase. Misture bem.
6. Adicionar 23ul de PCR Master Mix para PCR tubos contendo 3 ul de lisado de caudas digeridos.
7. Flick tubos para misturá-los, em seguida, realizar uma breve centrifugação para trazer as amostras para o fundo do tubo.
8. Execute programa XY (Short) PCR (Tabela 1).
9. Coloque as amostras com corante (5x) e escada em um gel de agarose a 2,5% em tampão TAE 1X.
10. Executar a electroforese em gel de agarose até XX e XY bandas pode ser resolvido.
11. Imagem do gel com a imagem de captura de luz UV e.
12. Analisar o vs bandas específicas do cromossomo Y X-específica cromossomo (cromossomos X = 331 pares de bases [bp] e XY = 302 bp) ^13; XY amostras (male) terá duas bandas de 331 e 302 pb, enquanto XX amostras (feminino) aparecerá como uma única banda 331 pb.

5. Whole Imunofluorescência Mount Organ

Dia 1:

1. Retirar as gónadas a partir da cultura, utilizando uma pipeta de 1000 mL com uma ponta de corte. Se desejado, podem sercolocada num prato de PBS para lavar meios e reagentes. Colocar em PBS num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Quanto menor o tamanho do tubo vai economizar reagentes e torná-lo mais fácil de manter o controle de amostras no tubo.
   1. Certifique-se de manter o controle e amostras tratadas, bem como amostras XX e XY, em tubos separados e removê-los da cultura com conjuntos separados de pipetas para evitar a contaminação potencial da droga.
2. Lavam-se as gónadas duas vezes com PBS. Deste ponto em diante, este protocolo pode usar 1X PBS sem cálcio e magnésio. Lavá-los, permitir que as gônadas para desviar para o fundo do tubo (pela gravidade) e, em seguida, remover o líquido acima. Tenha cuidado para não perder gônadas pipetando muito perto deles.
3. Remover o máximo possível de PBS do tubo. Adicionar 250 uL de paraformaldeído a 4% em PBS contendo 0,1% de Triton X-100, e deixar incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo. Alternativamente, esta fixação pode ser feita durante 2 horas a 4 ° C num agitador rotativo. CUIDADO! Paraformaldehyde é uma substância tóxica, então siga o protocolo de segurança ao manusear.

Dia 2:

4. Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx em RT.
5. Lavam-se as gónadas 3 vezes com 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo.
6. Bloquear as gônadas, pelo menos, 1 hora em 250 mL solução a RT em uma cadeira de balanço de bloqueio.
7. Corar as gónadas o / n a 4 ° C num agitador rotativo em 250 uL de anticorpo primário diluído em Solução de Bloqueio.

Dia 3:

8. Lavar as gônadas duas vezes em 250 mL Solução de Lavagem.
9. Lave as gônadas 3 vezes com 250 mL Solução de Lavagem por 10 min cada em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço.
10. Bloquear as gônadas 1 hora em 250 mL de bloqueio Solução na RT em uma cadeira de balanço.
11. Cobrir o tubo de microcentrífuga com folha de alumínio para proteger os anticorpos secundários fluorescentes da luz.
12. Incubar as gônadas 2-4 horas à temperatura ambiente no arocker em 250 uL de anticorpo secundário diluído em Solução de Bloqueio contendo Hoechst 33342. Alternativamente, executar anticorpo secundário e Hoechst 33342 incubação O / N a 4 ° C no balancim.
13. Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx.
14. Lavam-se as gónadas 3 vezes em 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo.
15. Usando uma pipeta de ponta de corte, transferir gônadas em um slide com líquido mínimo. Retire o excesso de líquido com pipeta, mas certifique-se que o tecido não seque.
16. Orientar as gônadas na forma desejada com uma pinça, e rapidamente adicionar uma gota de meio de montagem para montar as gônadas no slide. Certifique-se os casacos de mídia de montagem todas as amostras completamente; é fundamental para evitar que as amostras sequem.
17. Use lamelas (número 1,5 estilo) de tamanho apropriado para cobrir suavemente amostras. Vamos montar propagação mídia entrar em contato com a superfície inteira da lamela. Se necessário, muito pressionar ligeiramente nos cantos de modo que a lamelanão existem grandes bolhas de ar.
18. Selar as lâminas com unhas polonês claro em torno das bordas para reduzir a evaporação do meio de montagem. Loja slides montados no escuro a 4 ° C.

A cultura ex vivo permite que uma gotícula de manipular órgãos inteiros, tais como a gónada, para estudar as interacções celulares e dinâmica. A Figura 1 mostra de uma forma passo a passo como preparar uma cultura E11.5 gonadal gota. Os primeiros passos do protocolo de cultura incluem a remoção inicial do útero contendo embriões de rato a matriz (Figura 1A e 1B). Após a remoção do útero da mãe, a parede uterina é cortado e os embriões são libertados a partir do saco vitelino em PBS durante mais dissecção (Figura 1C-E). Após a remoção de órgãos viscerais, o cume urogenital é claramente visível ao longo da parede do corpo de volta do embrião (Figura 1F) e é isolado (Figura 1G). O complexo gónadas-mesonephros é, em seguida, dissecado a partir do cume urogenital (Figura 1H), e está colocada em cultura de gotículas com um inibidor de molécula pequena (Figura 1I,esquerda: "T" para o tratado) e sem inibidor de pequena molécula (Figura 1I, direito: "C" para o controle). Os pratos contendo as pequenas gotículas são colocadas numa câmara humidificada tornar-shift (Figura 1J) e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 horas.

Após 48 horas de incubação os órgãos em cultura são removidos, lavados com PBS, e são submetidos a um protocolo de imunofluorescência conjunto de montagem para avaliar a eficácia da cultura e o tratamento da toxicodependência; Alternativamente, eles podem ser processados ​​para a extracção de RNA para análise de expressão génica. Inteiras fetais gónadas-mesonephros complexos (E11.5 e mais velhas) têm uma elevada taxa de sobrevivência quando transferidos para meio de cultura imediatamente após uma dissecção limpo e cultivadas sob condições normais (37 ° C e 5% de CO 2) durante 48 horas (mas pode potencialmente ser cultivadas durante mais tempo, se necessário). Comparações de gônadas E11.5 sob brightfield microscopy a incubação inicial versus depois de 24 ou 48 horas de cultura revelam uma mudança dramática na forma gônada eo aparecimento de estruturas cordão de banda, como no controle das gônadas XY (Figura 2). Portanto, após a cultura, durante 48 horas, o desenvolvimento é comparável à de E13.5 em gónadas utero (Figura 2). Além disso, o pulmão fetal E11.5 cresce e exibe aumento da ramificação que normalmente ocorre durante esta fase do desenvolvimento (Figura 2). O processo de cultura resulta geralmente em órgãos menores, em comparação com in utero, o mais provável devido ao fato de que as condições de cultura não são tão óptimo para o crescimento em relação ao ambiente no útero (ver discussão).

Embora o tamanho dos órgãos resultantes da cultura de 48 h difere da de no útero -desenvolvida órgãos, órgãos ex vivo em cultura de tecidos mostram arquitectura semelhante e pode servir como substitutos razoáveis ​​(Figures 3 e 4). Para caracterizar a arquitetura do órgão e morfogênese, marcadores que especificamente rotular tipos de células de órgãos críticos foram utilizados, tais como SOX9 para para as células de testículos de Sertoli e células pulmonares ramificação, E-caderina para as células epiteliais do pulmão, PECAM1 para as células germinativas e vasculatura, e caspase 3 clivada células apoptóticas (Figuras 3 e 4). Sox9, codificando um factor de transcrição, desempenha um papel importante na proliferação de órgãos fetais, a diferenciação e a formação da matriz extracelular. Portanto, em ambos os órgãos, SOX9 é utilizado como um marcador de arquitectura comum que rotula células de Sertoli, localizadas dentro das cordas testículo 14-16 e estruturas ramificadas dentro dos pulmões 17.

Culturas gônadas em particular recreate in utero morfogênese efetivamente. A gônada rato é especificado na embrionário (E) estágio E10.0 e é inicialmente morfologicamente idênticas em XY (masculino) e XX (female) embriões. A expressão da (região Sex determinação do cromossomo Y) Sry gene em XY gônadas a partir de E10.5 impulsiona grandes mudanças moleculares e morfológicas que ocorrem rapidamente entre E11.5 e E13.5 no testículo fetal 19, incluindo: a especificação de células de Sertoli, a linhagem de células de suporte do testículo; a formação de cordões testículos, os quais são constituídos por células de Sertoli e germinais e são os precursores fetal para adulto túbulos seminíferos; e grande remodelação vascular. No remodelamento vascular específico do sexo masculino, as células endoteliais libertados de um plexo vascular nas mesonephros vizinhos migram para a gônada para formar um sistema arterial 4,20 específicas do testículo. Immunofluorescent análises revelam estruturas da medula testículos bem desenvolvidos e vasculatura em E13.5 em testículos útero em relação a E11.5 testículos (Figura 3). Como as imagens da Figura 3 mostra, o sistema de cultura gota pode recriar testículo diferenciação eventos ex vivo, como é possível visualizar as células de Sertoli SOX9-positivo em gônadas XY em cordões que formam túbulos semelhante vasculatura e que formam ao longo do órgão. Com relação aos pulmões, de 48 hr resultados da cultura em aumento da ramificação de SOX9 / E-caderina ramos epiteliais double-positivos ao longo de 2 dias (Figura 4). Além disso, vemos níveis semelhantes de apoptose no controlo cultivadas e em gónadas útero, enquanto houver algum aumento nas células apoptóticas nos pulmões, nas mesmas condições de cultura (Figuras 3 e 4), sugerindo que a gónada é particularmente sensível às condições de cultura.

Inibidores de moléculas pequenas podem ser usadas para estudar o desenvolvimento dos órgãos, afectando localização celular, proliferação, e o estado do ciclo celular, bem como a arquitectura de órgãos e várias cascatas de sinalização. O ex vivo método gota órgão inteiro permite ao pesquisador para administrar reagentes farmacológicos facilmente a feTal órgãos em um volume muito pequeno de meio de cultura. Para examinar os efeitos da vascularização e remodelação vascular na diferenciação testículo e morfogénese, utilizou-se o inibidor de molécula pequena-TKI II, um reagente que interrompe o desenvolvimento vascular testículo 3, bloqueando a actividade dos receptores de VEGF; a formação de arquitectura testículo fetal ocorre de um modo dependente-vascular, agindo através de crescimento vascular endotelial, factor A (VEGFA) 11,12. Enquanto vascularização do testículo é crítica para a exportação de testosterona que impulsiona virilização do embrião, é também um importante factor de cabo de testículo morfogénese: trabalho anterior demonstrou que, quando sinalização VEGFA é bloqueada na ou antes E11.5, células de Sertoli não particionar a partir circundante células intersticiais e não há estruturas do cordão formar 3,12. Os resultados apresentados aqui demonstram que a ruptura da remodelação vascular no testículo fetal é eficaz no sistema de cultura de gotícula, e subsequent defeitos na morfogénese testículo (isto é, formação anormal cabo de testículos) pode ser visualizada (Figura 3). Deve notar-se que PECAM1, um marcador para as células endoteliais, é também expressa por células germinais (Figura 3); Esta coloração de células germinativas é um controlo interno que demonstra que a falta de coloração vascular em gónadas tratada não é devido a razões técnicas, e demonstra também que outros tipos de células, tais como células germinativas não são afectadas pelo tratamento com drogas. Dado que a maioria morfogênese testículo inicial ocorre entre E11.5 e E13.5, estes estágios são a janela ideal para factores que influenciam a diferenciação específica do sexo, em particular, o papel do VEGF e remodelação vascular na gônada determinante.

O uso de TKI II durante o desenvolvimento do pulmão entre E11.5 e E13.5 mostra que pequenas moléculas de inibição da vascularização pode ser reproduzida de um outro órgão (Figura 4). Estes resultados mostram a eficácia de tele ex vivo gota de sistemas de órgãos modelo de cultura fetal ea capacidade de usar inibidores de pequenas moléculas para alterar as vias de sinalização dentro dos órgãos. Dada a facilidade, flexibilidade e eficácia deste protocolo, a cultura gota fornece uma alternativa adequada para questões experimentais em relação ao desenvolvimento de órgãos que não podem ser tratadas in vivo.

Figura 1. Etapas do vitro órgão inteiro protocolo cultura gota in. (A) Eutanizado rato grávida com cavidade peritoneal aberta. (B) corno uterino com embriões fechados. (C) Close-up da parede uterina abriu com a exposta saco vitelino contendo embrião. (D) Um único embrião (e) está ligado para a placenta (P) fechado dentro do saco vitelino (y). (E) Embrião separados f placenta rom e saco vitelino. (F) embriões dissecado com órgãos viscerais removido e cume urogenital expostos (gônadas dentro cume urogenital esboçado no preto). (G) Close-up de isolado de cume urogenital (-mesonephros gônada complexos esboçado no preto). Asterisk indica a aorta dorsal em G e H. (H) A separação do complexo gônadas-mesonephros do cume urogenital (dissecção representado pela linha tracejada preta). g, gônadas; m, mesonephros. (I) Set-up de gotas de culturas dentro de 35 mm tampa prato de cultura. Setas pretas apontam para gônadas dentro das gotículas. T, tratada; C, controle. (J) Duas tampas prato de cultura gotículas colocados dentro de uma câmara úmida aberta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Desenvolvimento de ex vivo gota órgãos de cultura em relação ao de órgãos útero imagens de campo claro:. E11.5 in-utero- desenvolvido órgãos (gônadas e pulmões) (primeira coluna); E11.5 órgãos após 24 horas (segunda coluna) e 48 hr cultura de controlo de gota (terceira coluna); Órgãos E11.5 cultivadas durante 48 horas com inibidor TKI II VEGFR (quarta coluna); e E13.5 in-utero- desenvolvido órgãos (quinta coluna). Gônadas são orientados com gônadas (estrutura clara) acima dos mesonephros (estrutura opaca). Gônadas E11.5 são bipotential e aparecer morfologicamente idênticas em XY (masculino) e XX (feminino) amostras. Barra de escala, 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Ex vivo testículos cultura gota são comparáveis ​​em arquitetura do tecido e morte celular para contrapartes em utero- desenvolvidos imagens de imunofluorescência de:. E11.5 in-utero -desenvolvida testículos fetais (primeira coluna); testículos controle E11.5 após 48 h de controle ex vivo cultura gota (segunda coluna); E11.5 testículos após 48 horas de cultura ex vivo gota com TKI II inibidor VEGFR (terceira coluna); e E13.5 in-utero- desenvolvido testículos (quarta coluna). As linhas tracejadas indicam gônadas-mesonephros fronteira (gônada é orientada em cima). SOX9 é um marcador de células de Sertoli e é usado para visualizar arquitectura cabo testículo; PECAM1 é expresso em células germinativas e células endoteliais vasculares (por conseguinte, de coloração remanescente PECAM1 em gónadas tratada é quase exclusivamente células germinais); e cleavEd caspase 3 é um marcador de células apoptóticas. Gônadas controle cultivadas mostraram formação semelhante cabo de testículo, vascularização específica do testículo (setas em todo figura), e os níveis de apoptose em relação a contrapartes em utero- desenvolvidos, enquanto gônadas TKI-II-cultivadas exibiram interrompido vasculatura anormal e morfogênese cabo de testículo. Os parênteses indicam domínio de superfície da gónada vasculatura onde normalmente está presente mas não é detectado em amostras tratadas. Pontas de flechas apontam para morrer aglomerados de células vasculares em testículos tratados com TKI-II. Barra de escala, 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Outros órgãos fetais (pulmão) cultivadas ex vivo em gotículas são comparáveis > In- utero- órgãos desenvolvidos imagens de imunofluorescência de:. E11.5 in-utero pulmões -desenvolvida (primeira coluna); E11.5 pulmões após 48 h de controle ex vivo cultura gota (segunda coluna); E11.5 pulmões após 48 horas de cultura ex vivo gota com TKI II inibidor VEGFR (terceira coluna); e E13.5 in-utero- desenvolvido pulmões (quarta coluna). Etiquetas SOX9 ramificação células; E-caderina marcas epiteliais estruturas tubulares; PECAM1 etiquetas endotélio vascular; caspase 3 clivada e marcas de células apoptóticas. ex vivo em cultura de órgãos de controlo mostram arquitectura semelhante e expressão de SOX9, E-caderina, e em órgãos PECAM1 cultivadas em comparação com utero- desenvolvida órgãos, mas quantidades variáveis ​​de morte celular. Após o tratamento com inibidor da tirosina quinase II, o desenvolvimento vascular está significativamente reduzida nos pulmões (como revelado pela coloração PECAM1). Barra de escala, de 100 mm.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Programa de Análise de PCR XY Parâmetros de ciclo para "(Short) XY" programa de PCR utilizado para XX / XY genotipagem de embriões..

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.