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Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)

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DOI:

10.3791/53265

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24 de dezembro de 2015

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1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center

Neste artigo

Resumo

As propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (MSC) aparecem cada vez mais relevante para a aplicação clínica. Usando um sistema de co-cultura de MSCs e leucócitos do sangue periférico de pré-corados com o éster succinimidilo corante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), descreve-se a avaliação in vitro de MSC imunomodulação em proliferação e subpopulações efectoras de leucócitos específicos.

Resumo

As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) de várias linhagens parecem ser altamente relevantes para uso clínico em uma ampla gama de doenças relacionadas ao sistema imunológico. Os mecanismos envolvidos estão sendo cada vez mais elucidados e, neste artigo, descrevemos o experimento básico para avaliar a imunomodulação das CTMs por meio do ensaio para supressão da proliferação de leucócitos efetores. Representando a ativação, a proliferação de leucócitos pode ser avaliada por uma série de técnicas, e descrevemos neste protocolo o uso do corante celular fluorescente carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFSE) para marcar leucócitos com análises citométricas de fluxo subsequentes. Esta técnica pode não apenas avaliar a proliferação sem radioatividade, mas também o número de divisões celulares que ocorreram, além de permitir a identificação da população específica de células em proliferação e a expressão intracelular de citocinas/fatores. Além disso, o ensaio pode ser adaptado para avaliar populações específicas de leucócitos efetores por seleção de marcadores de superfície de esferas magnéticas de populações únicas de células mononucleares do sangue periférico antes da co-cultura com MSCs. A flexibilidade deste ensaio de co-cultura é útil para investigar interações celulares entre MSCs e leucócitos.

Introdução

Células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) são progenitores somáticas que podem se diferenciar em linhagens mesodérmicos paraxiais as de osso, cartilagem, tecido adiposo e 1-4, bem como a um extramesodermal algumas linhagens 5. Primeiro isolada a partir da medula óssea adulta, estes progenitores multilinhagem foram agora encontrados em vários tecidos e 6-8, inesperadamente, mostraram ter fortes propriedades imunomoduladoras que aparecem altamente passível de aplicação clínica 9-12. Mecanismos detalhados envolvidos nos efeitos imunomoduladores estão ativamente sendo investigado por aplicação efectiva sobre as entidades de doenças específicas. Uma das maneiras mais simples para avaliar imunomodulação é através da avaliação para a supressão da efetoras de leucócitos proliferação 13. A maioria dos leucócitos, tais como linfócitos efectores T e monócitos proliferar prodigiously quando estimulado ou activado. Função imunomoduladora pode ser avaliado quando a supressão deproliferação é evidenciado.

Tradicionalmente, a proliferação de leucócitos efectoras foi avaliada por detecção de [3 H] timidina em ADN. No entanto, este método tem desvantagens significativas, devido às preocupações de radiação e descarte pós-uso, bem como os equipamentos complexos necessários. Embora existam ensaios não radioactivos a fim de avaliar a proliferação celular, o éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) ensaio tem outras vantagens tais como permitindo a identificação de populações celulares específicas, o que é especialmente útil em experiências de co-cultura, envolvendo vários tipos de células. CFSE é um corante fluorescente que celular pode ser avaliada por análise de citometria de fluxo. Como as células se dividem, a intensidade desta etiqueta celular é diminuída proporcionalmente; Isto não só possibilita a determinação da proliferação celular em geral, mas também permite a avaliação do número de divisões celulares até 8 divisões a fluorescência antes torna-se difícil para detect contra sinal de fundo. Além disso, a estabilidade do CFSE fluorescente in vivo permite a identificação de células que tais células marcadas podem ser visualizadas até diversos meses 14.

Este ensaio pode também ser variada para avaliar tipos específicos de leucócitos efectoras ou a função imunomodulatória de populações específicas de MSC induzida por leucócitos, tais imunomoduladores como monócitos CD14 + a interleucina-10 (IL-10), produzindo 15 efectuando magnética talão selecção de marcadores de superfície populações de células de interesse antes ou após a co-cultura, conforme adequado. Nosso protocolo descreve o ensaio de base de avaliar os efeitos imunomoduladores de MSCs em leucócitos efectoras (diagrama de fluxo mostrado na Figura 1) e uma variação deste ensaio de base para a avaliação da induzida por MSC imunomodulação de leucócitos nos linfócitos CD4 + efectoras alogénicas T (fluxograma mostrado na Figura 4).

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Protocolo

O consentimento informado do paciente conforme aprovado pelo conselho de revisão institucional deve ser obtido para o uso de células humanas.

1. Densidade de isolamento gradiente de sangue periférico humano as células mononucleares (PBMC)

  1. Adicionar 25 ml de sangue total heparinizado em um tubo de 50 ml por uma pipeta de 25 ml.
    1. Dilui-se as células com 25 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Adicionar 15 ml de gradiente de densidade de Ficoll-Paque em um novo tubo de 50 ml, e, enquanto a inclinação do tubo, muito lentamente e cuidadosamente adicionar 25 ml da suspensão diluída de células ao longo do gradiente de densidade, de modo que não há mistura do sangue total com o gradiente de densidade, isto é., há perturbação da interface do gradiente de densidade de sangue.
  3. Centrifugar a suspensão a partir do passo 1.2 a 400 x g durante 30 a 40 min num rotor de balde oscilante-de temperatura controlada sem travão a 20 ° C.
    Nota: Três camadas distintas deve ser aparente após centrifugação: the camada superior de plasma estar; a camada clara de fundo sendo o gradiente de densidade Ficoll-Paque; e uma camada celular fina, sendo o meio PBMC
  4. Aspirar e desprezar o camada superior por sucção com uma pipeta de Pasteur, com o cuidado de não perturbar a camada de células mononucleares de interfase (isto é, linfócitos, monócitos e plaquetas).
  5. Recolher cuidadosamente a camada de células mononucleares com uma pipeta de 10 mL para um novo tubo de centrífuga de 50 ml.
  6. Encher o tubo com 20 ml de PBS, misturar bem, e centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante completamente após centrifugação.
  7. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de PBS e centrifugar a 200 x g durante 10-15 minutos a 20 ° C. Remover o sobrenadante completamente após centrifugação.
    Nota: Esta etapa remove as plaquetas-que são indesejados-nos PBMC; este passo pode ser repetido para assegurar a remoção completa das plaquetas.
  8. Se nenhuma seleção de populações específicas édesejado, sedimento de células ressuspender em leucócitos meio completo (10% soro fetal de bovino (FBS), 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina / estreptomicina, em meio RPMI-1640) para cultura após a realização de uma contagem de células 16 para suspender a 1 ml de médio por 10 7 PBMC antes de prosseguir para a próxima etapa.

2. Rotulagem magnética de Leucócitos Populações (pule para o passo 4 se nenhuma seleção de populações específicas é Obrigatório)

  1. Centrifugar a suspensão de PBMC a 300 × g durante 10 min e o sobrenadante aspirado completamente.
  2. Ressuspender o sedimento celular em 80 ul de PBS por 10 7 células totais.
  3. Adicionar 20 uL de pérolas magnéticas especificados (isto é, CD14 esferas magnéticas para isolamento de monócitos CD4, esferas magnéticas para isolamento de linfócitos T) por 10 7 células totais.
  4. Misturar bem e incubar durante 15 min a 2 a 8 ° C no frigorífico.
  5. Adicionar 1-2 ml de PBS por 10 7 células para lavar e centrifugara 300 x g durante 10 min.
  6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 8 10 células em 500 ul de PBS.

3. Seleção Magnética de subpopulações de leucócitos

Nota: Uma variedade de separadores de esférulas magnéticas e colunas estão disponíveis para o isolamento de populações específicas de leucócitos pelo marcador de superfície celular de uma série de fabricantes. O isolamento pode ser por selecção positiva com base em um ou alguns marcadores positivos ou por selecção negativa após a depleção de populações indesejadas. Uma abordagem geral de efectuar a selecção positiva usando um marcador (isto é, CD4 de linfócitos T auxiliares, ou de monócitos CD14) é descrito a seguir.

  1. Preparar e separador magnético privilegiada incluindo coluna de separação de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Aplicar tubo contendo a amostra de PBMCs rotulados. Fornecer dois tubos de centrífuga de 15 ml para recolha do e unlabel marcado positivamentefrações celulares ed, seguindo as instruções do fabricante.
  3. Contar o número de células 15 e ressuspender os leucócitos seleccionados positivamente (isto é, linfócitos T CD4 + ou CD14 + células) em meio completo de leucócitos, usando 1 ml de meio por 10 7 células.

4. CFSE Coloração de leucócitos para avaliação da proliferação

Nota: CFSE tem sido amplamente utilizada em investigações imunológicas, tanto in vivo e in vitro. Nosso protocolo foi otimizado para estudo in vitro da MSC / PBMC (ou outros leucócitos) interações. Enquanto os passos gerais envolvidos na realização de CFSE marcação in vitro são semelhantes, pode haver diferenças na dose específica e tempo do protocolo 14. Isto pode ser devido a um número de factores, isto é, o tipo específico de célula utilizado, o número de células utilizadas-que podem provavelmente afectar a intensidade do sinal fluorescente CFSE.

  1. Dilui-se a solução de estoque de CFSE (10 mM) em PBS para a concentração de trabalho pretendida de 10 ^ M (solução de trabalho CFSE-). Prepare 10 7 células (isto é, PBMCs ou células T) para marcação com a solução CFSE-working.
  2. Centrifuga-se a 300 x g durante 10 minutos para se obter uma pelete de células e o sobrenadante aspirado.
  3. Ressuspender as células suavemente em 1 ml de solução de pré-aquecido (37 ° C) CFSE-trabalho e incubar as células durante 10 min a 37 ° C.
  4. Para lavar o excesso de CFSE, diluir a suspensão de células com 10 vezes (em volume) de pré-arrefecida (4 ° C), meio RPMI contendo 10% de FBS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pelete de células desta forma duas vezes mais.
  5. Re-sedimentar as células por centrifugação e contar o número de células 15. Ressuspender 10 7 células (quer PBMCs ou células T) em 1 mL de meio completo pré-aquecido de leucócitos fresco.

5. Co-cultura de MSCs com leucócitos e activação de leucócitos

  1. Pré-quente MSC meio completo (10% de FBS (pré-testados para o crescimento óptimo MSC), 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina / estreptomicina, em meio DMEM-baixo teor de glucose) a 37 ° C durante não mais do que 30 min.
  2. MSCs semente a 50.000 células em 1 ml de MSC meio completo em placas de 24 poços (densidade MSC: 25.000 células / cm2) para a ligação O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora, permitindo para as células estaminais para alcançar 80% de confluência.
  3. Meio aspirado, e com base em números de MSC sem sementes, adicionar PBMC CFSE-marcadas (previamente marcado com consulte protocolo Passo 4 acima) para as MSCs cultivadas (semeadas no dia anterior em placas de 24 cavidades) em 1 ml de leucócitos meio completo a uma 01:10 (índice de célula) rácio co-cultura de MSCs para PBMC.
  4. Adicionar o mitogénio fito-hemaglutinina (PHA), um activador de leucócitos não específica, a uma concentração final de 10 ug / ml em um volume total de 1 ml de leucócitos meio completo por poço.
    1. AlternativEly, para estimular a activação de linfócitos T especificamente: a-usar CD3 / 28 micropérolas e adicionar à co-cultura de duas células para obter uma razão de 1 talão de linfócitos-T-a: 1.
  5. Para controlo negativo, placa 500.000 PBMCs / poço (ou uma população efectora específica de leucócitos; densidade celular: 250.000 leucócitos / cm2) numa placa de 24 cavidades com 1 ml de meio completo de leucócitos única; para o controlo positivo, para além do plaqueamento o mesmo número de PBMC / cavidade, adicionar PHA a uma concentração final de 10 ug / ml.
  6. No terceiro e quinto dia da experiência de co-cultura, avaliar a proliferação de leucócitos marcados com CFSE (colocados em tubos de fundo redondo) por análise de citometria de fluxo 17 com 488 nm de excitação e emissão adequados para filtros de fluoresceína.
    Nota: Coloração de citocinas intracelulares para a análise de citometria de fluxo pode também ser realizada para estes leucócitos marcados com CFSE, neste ponto, para avaliar alterações no perfil de expressão de citoquinas de leucócitos como MOdulated por MSCs. Desde CFSE é avaliada com um filtro adequado para a fluoresceína, os anticorpos seleccionados para avaliar várias citocinas precisa ser conjugado com fluoresceína ou com excepção espectro semelhante fluorocromos (isto é, ficoeritrina, proteína peridinina clorofila complexo (PerCP)).

6. Variação: Effector Suppression Ensaio Magnetic Bead-selecionado, MSC-induzida imunomoduladora leucócitos ativados em CFSE rotulados células efetoras T CD4 +

  1. MSCs semente a 250.000 células em 3 ml de MSC meio completo em placas de 6 poços (densidade MSC: 25.000 células / cm2) para a ligação O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora, permitindo para as células estaminais para alcançar 80% de confluência. Pelo menos 3 placas de 6 poços são necessárias para garantir PBMC MSC-cocultivadas suficientes para a seleção sub-população.
  2. Aspirar o meio e adicionar PBMC separados de acordo com Passo 1, mas em placas de 6 poços, a 2,5 x 10 6 células / poço (densidade celular: 250.000 leukocytes / cm 2) com 3 ml de meio completo de leucócitos. A co-cultura durante 48-72 horas numa incubadora a 37 ° C.
  3. Magnetic talão-selecionar população específica de leucócitos induzidos imunomoduladores-MSC (ou seja, CD14 + células) como por secções 2-3.
    Notas: a coloração de citocinas intracelulares para a análise de citometria de fluxo pode ser realizada neste ponto para avaliar mudanças no perfil de expressão de citoquinas de leucócitos, isto é, a expressão de interleucina-10 como modulada por MSC.
  4. Adicionar CFSE marcado com células T CD4 + alogeneicas gerados como por secções 2-4 em placas de 24 poços em 1 ml de leucócitos completo (densidade de células T: 250.000 células / cm 2) forma a leucócitos induzida por MSC seleccionado por esferas em várias proporções , ou seja, 1:10, 1: 5, 1: 2 e 1: 1 (célula para célula) as proporções.
  5. Para estimular as células T CD4 +, adicionar cc-CD3 / 28 micropérolas conjugados para obter uma razão talão-a-célula de 1: 1.
  6. Para um controlo negativo, a chapa 500.000 células T CD4 + / poço num (a densidade de células T: 250000 células / cm 2) de 24 poços da placa com 1 ml de meio completo de leucócitos única; para o controlo positivo, para além do plaqueamento o mesmo número de células T CD4 + / cavidade, adicionar a-CD3 / 28 micropérolas conjugados para obter uma razão talão-a-célula de 1: 1.
  7. No dia 3 de co-cultura de, avaliar a proliferação de células T CD4 + CFSE-marcados (colocados em tubos de fundo redondo) por análise citométrica de fluxo 16 com 488 nm de excitação e emissão adequados para filtros de fluoresceína.

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Resultados

A Figura 1 indica o esquema geral do experimento, e A Figura 2 demonstra a aparência das várias condições de cultura de células tal como visualizado por microscopia de contraste de fase invertida. MSC são células aderentes com um fibroblástica, morfologia fusiforme, enquanto que PBMCs e leucócitos são pequenas células não-aderentes redondos. Estes dois tipos de células morfologicamente diferentes pode ser claramente visto na co-cultura. No fim do ensaio, quando os PBMC (ou leuckotyes) são aspiradas para cit...

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Discussão

Cada vez mais, as propriedades imunomoduladoras das CTMs estão sendo traduzidas em uso clínico mais rapidamente do que a capacidade multilinhagem dessascélulas-tronco 18-20. Assim, técnicas de co-cultura de CTMs com leucócitos e ensaios para avaliar a função imune são importantes para delinear ainda mais os mecanismos específicos envolvidos nessas propriedades para otimizar a aplicação terapêutica eficaz.

Um dos aspectos técnicos mais críticos para o sucesso nesses ensaios é ter nú...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por doações da NHRI (CS-104-PP-06 para B.L.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare71-7167-00 AGDensidade grandiente para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
Kit Vibrante de Traçador de Células CFDA-SE (CFSE)Life TechnologiesV12883Etiqueta celular para detecção de divisão celular
Fitoaglutinina (PHA)SigmaL8902Ativação de PBMCs humanos
Dynabeads Human T-Activator CD3/28Life Technologies111.32DAtivação de linfócitos T humanos, e.g. CD4+ células T, CD8+ células T, etc.
autoMACS™ SeparadorMiltenyi BiotecautoMACS™ SeparadorSeparador de célula baseado em magnético
autoMACS® ColunasMiltenyi Biotec130-021-101colunas de separação
CD14 microesferas, humanas Miltenyi Biotec130-050-201Para seleção positiva de monócitos e macrófagos CD14+ de
microesferas CD4 PBMCs, humanas Miltenyi Biotec130-045-101Para seleção positiva de linfócitos T humanos CD4+ de PBMCs
RPMI 1640 MediumLife Technologies11875PBMC humano/meio de cultura de leucócitos
DMEM, baixa glicose, piruvatoLife Technologies11885Meio de cultura de células-tronco mesenquimais humanas (MSC)
L-glutaminaLife Technologies25030-081Suplementação para MSC meio completo
Penicilina/StreptomycinLife Technologies15070-063Suplementação para PBMC/leucócitos e MSC meio completo
Soro fetal bovino (FBS)1) Hyclone, para cultura MSC                                    2) Life Technologies, para todas as outras células (ou seja, PBMCs, populações específicas de leucócitos)1) SH30070.03M 2) 10091-148Lotes de pré-teste para suporte de MSC in vitro placa
de cultura de células de 24 poços Placaco-culturaCorningCOR3524
Tubo de centrífuga de 50 mlPBMCs de isolamento de 430291 de sangue total por tubo de centrífuga Ficoll-Paque PLUS
de 15 ml Corning430766Coleção das frações celulares marcadas e não marcadas
Tubos de fundo redondoBD Falcon 352008Coleta de células para análise por citometria de fluxo
de

Referências

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