Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Resumo

A amostragem de sangue repetida é necessária e importante na pesquisa com animais. Desenvolvemos um método novo, não letal e confiável para coleta repetida de sangue de peixe-zebra adulto e aplicamos esse método ao estudo da bioquímica do sangue, incluindo o metabolismo da glicose.

Resumo

Recolha de sangue é repetida uma das técnicas mais comuns realizados em animais de laboratório. No entanto, um protocolo não-letal para a recolha de sangue do peixe-zebra não foi estabelecida. Os métodos anteriores para a recolha de sangue a partir de peixe-zebra são letais, tais como incisão lateral, decapitação e ablação cauda. Assim, temos desenvolvido um novo método de recolha de sangue "repetida", e aqui presente um protocolo detalhado descrevendo esse procedimento. Este método é minimamente invasivo e resulta em uma taxa de mortalidade muito baixo (2,3%) para peixe-zebra, permitindo, assim, a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. O volume máximo de recolha de amostras de sangue é dependente do peso do corpo do peixe. O volume de sangue para a amostragem repetida em intervalos deve ser ≤0.4% de peso corporal por semana ou ≤1% a cada 2 semanas, que foram avaliadas por medições de hemoglobina no sangue. Além disso, a hemoglobina, glicemia de jejum, triglicerídeos plasma (TG) e total cníveis holesterol em peixe-zebra adulto masculino e feminino foram medidos. Nós também aplicaram esse método para investigar a desregulação do metabolismo da glicose na obesidade induzida por dieta. Este método de coleta de sangue permitirá que muitas aplicações, incluindo glicose e metabolismo lipídico e estudos hematológicos, o que aumentará o uso de peixe-zebra como um modelo de doença organismo humano.

Introdução

Zebrafish estão ganhando cada vez mais popularidade como um valioso modelo de doenças humanas porque os seus órgãos e genética são semelhantes aos dos seres humanos ^1,2. No campo da biologia do desenvolvimento, muitos estudos têm demonstrado que o peixe-zebra e mostrar humana marcada semelhança na hematopoiese ^3, hemostasia ^4,5, e ⁶ myelopoiesis. Peixe-zebra adulto também são usados ​​para o estudo imunológico ^{7, 8 e} neurodegenerativa doenças relacionadas à obesidade ⁹ porque este ações organismo modelo vias comuns com aqueles interrompido em doenças humanas. Para obesidade e doenças relacionadas à obe....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Mie o, e foram realizados de acordo com a regulamentação bem-estar animal japonês 'Ato de Bem-Estar e Gestão de Animais' (Ministério do Meio Ambiente do Japão) e tenha cumprido as normas internacionais.

1. Preparação da agulha

NOTA: Todos os experimentos foram realizados sob anestesia, e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Para a eutanásia, os peixes foram imersos num banho de gelo-água (5 partes de gelo / 1 parte de água em ≤4 ° C) durante ≥20 min.

1. Prepare as agulhas microcapil....

Resultados

Este método de coleta de sangue causa lesão mínima de peixe-zebra (a <1mm punção; Figura 1J) e produz uma taxa de mortalidade muito baixa de 2,3%. Foi examinado o volume máximo de sangue que pode ser recolhido a partir de um único peixe e avaliada a relação com o seu peso corporal (Figura 3). Descobrimos que o volume de sangue coletado máximo foi linearmente correlacionado com o peso corporal (R = 0,813). O maior volume de sangue coletado de um peixe indivíduo (peso corporal = 1.071 .......

Discussão

Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado para a obtenção de sangue em série a partir de peixe-zebra adulto. Este método é simples de realizar e usá-lo no laboratório, numa base diária. Este método de coleta de sangue é baseada na inserção de uma agulha capilar de vidro em aorta dorsal do peixe-zebra. Durante este procedimento, é crítico para ter o cuidado de não fazer a ablação da coluna porque é o critério para a busca de aorta dorsal. Reduzir a lesão da coluna irá melhorar a taxa de sobrevivência. Embora esta técn.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Capilares de vidro com filamento	Narishige	GD-1	1,0 mm de diâmetro externo.
Extrator de agulhas	Narishige	PC-10	Para produzir as agulhas
Heparina	Wako Pure Chemical Industries	081-00136	Para heparinização
Conjunto de tubos aspiradores	Drummond	2-040-000	Para coleta de sangue
Dispensador de lâmpadas	Drummond	1-000-9000	Para coleta de sangue
2-fenoxietanol	Wako Pure Chemical Industries	163-12075	Para anestesiar os peixes
DRI-CHEM3500V	Fujifilm-Para		medição de hemoglobina
DRI-CHEM Slides	Fujifilm	Hb-WII	Para medição de hemoglobina
Glutest Neo Super	Sanwa Kagaku Kenkyusho-Para	de	glicose bood
Wako L-tipo TG kit	Wako Pure Chemical Industries	464-44201	Para TG medição
Wako L-tipo CHO kit Wako	Pure Chemical Industries	460-44301	Para medição do colesterol total
Parafilm M	Alcan Packaging	PM996	Para expelir o sangue em

de medição