Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Resumo

A amostragem de sangue repetida é necessária e importante na pesquisa com animais. Desenvolvemos um método novo, não letal e confiável para coleta repetida de sangue de peixe-zebra adulto e aplicamos esse método ao estudo da bioquímica do sangue, incluindo o metabolismo da glicose.

Resumo

Recolha de sangue é repetida uma das técnicas mais comuns realizados em animais de laboratório. No entanto, um protocolo não-letal para a recolha de sangue do peixe-zebra não foi estabelecida. Os métodos anteriores para a recolha de sangue a partir de peixe-zebra são letais, tais como incisão lateral, decapitação e ablação cauda. Assim, temos desenvolvido um novo método de recolha de sangue "repetida", e aqui presente um protocolo detalhado descrevendo esse procedimento. Este método é minimamente invasivo e resulta em uma taxa de mortalidade muito baixo (2,3%) para peixe-zebra, permitindo, assim, a amostragem de sangue repetidas do mesmo indivíduo. O volume máximo de recolha de amostras de sangue é dependente do peso do corpo do peixe. O volume de sangue para a amostragem repetida em intervalos deve ser ≤0.4% de peso corporal por semana ou ≤1% a cada 2 semanas, que foram avaliadas por medições de hemoglobina no sangue. Além disso, a hemoglobina, glicemia de jejum, triglicerídeos plasma (TG) e total cníveis holesterol em peixe-zebra adulto masculino e feminino foram medidos. Nós também aplicaram esse método para investigar a desregulação do metabolismo da glicose na obesidade induzida por dieta. Este método de coleta de sangue permitirá que muitas aplicações, incluindo glicose e metabolismo lipídico e estudos hematológicos, o que aumentará o uso de peixe-zebra como um modelo de doença organismo humano.

Introdução

Zebrafish estão ganhando cada vez mais popularidade como um valioso modelo de doenças humanas porque os seus órgãos e genética são semelhantes aos dos seres humanos ^1,2. No campo da biologia do desenvolvimento, muitos estudos têm demonstrado que o peixe-zebra e mostrar humana marcada semelhança na hematopoiese ^3, hemostasia ^4,5, e ⁶ myelopoiesis. Peixe-zebra adulto também são usados ​​para o estudo imunológico ^{7, 8 e} neurodegenerativa doenças relacionadas à obesidade ⁹ porque este ações organismo modelo vias comuns com aqueles interrompido em doenças humanas. Para obesidade e doenças relacionadas à obesidade (diabetes, esteatose hepática não alcoólica e e esteatohepatite aterosclerose), glicemia peixe-zebra e níveis de lipídeos, foram exaustivamente investigados em vários modelos de obesidade transgênicos e induzida por dieta ^10-13.

Coleta de sangue repetidas de animais individuais irá reduzir o uso de animais e dezembroRease diferenças interindividuais. No entanto, a recolha repetida de amostra é tecnicamente difícil em pequenos animais, tais como peixe-zebra por causa do seu volume de sangue relativamente pequena e a falta de vasos facilmente acessíveis. Vários métodos para a recolha de sangue de uma só vez a partir de peixes-zebra foram desenvolvidos, embora estes métodos têm os seus próprios inconvenientes, incluindo a letalidade, danos nos tecidos associados e volume de sangue limitado. Por exemplo, 1-5 mL de sangue pode ser colhido a partir de uma incisão lateral de aproximadamente 0,3 cm de comprimento na região da aorta dorsal ^5. Decapitação com uma tesoura de cortar o cinto peitoral pode coletar 5-10 ul sangue ^10. Outro método de amostragem de sangue conveniente é a ablação da cauda ^14. Punção cardíaca é um potencial método alternativo para a coleta de sangue repetidas do mesmo peixe, mas a quantidade muito pequena obtida (aproximadamente 50 nl) com este procedimento limita o número de análises que podem ser performed ^11. Por conseguinte, um novo protocolo é necessário para permitir a recolha de amostras de sangue não letal repetida, o que seria um avanço crítico necessário para este organismo ser um organismo modelo padrão para doenças humanas. Esta técnica permitiria testar resposta farmacológica, a descoberta de biomarcadores moleculares para o diagnóstico, determinação do prognóstico e do acompanhamento de várias doenças, tais como doenças metabólicas, doenças degenerativas e vários tipos de doenças malignas.

Assim, desenvolvemos um método minimamente invasivo para a obtenção de sangue de peixe-zebra em série ^15. Aqui demonstramos o procedimento visualmente e fornecer um protocolo detalhado para esta técnica. Usando este método, foram avaliados o valor normal com base em vários parâmetros, incluindo a hemoglobina, glicemia de jejum, e lipídios no sangue de peixe-zebra adultos saudáveis. Além disso, também avaliamos se esse método é apropriado para estudos que exigem amostras de série por mONITORIZAÇÃO as mudanças temporais nos níveis de glicose no sangue durante as experiências superalimentação.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Mie o, e foram realizados de acordo com a regulamentação bem-estar animal japonês 'Ato de Bem-Estar e Gestão de Animais' (Ministério do Meio Ambiente do Japão) e tenha cumprido as normas internacionais.

1. Preparação da agulha

NOTA: Todos os experimentos foram realizados sob anestesia, e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Para a eutanásia, os peixes foram imersos num banho de gelo-água (5 partes de gelo / 1 parte de água em ≤4 ° C) durante ≥20 min.

1. Prepare as agulhas microcapilares vidro puxando um capilar de vidro de 1.0 mm de diâmetro exterior, com um puxador de agulha (Figura 1A).
2. Corte as pontas das agulhas obliquamente utilizando uma tesoura fina (Figura 1B). O diâmetro da ponta ideal deve ser de aproximadamente 100 - 200 um (Figura 1C). Se o diamete pontar é demasiado estreito, o sangue não vai entrar na agulha.
3. Dissolve-se heparina em solução salina a uma concentração de 5 mg / ml.
4. Coloque uma agulha pré-cortados no final nosepiece de um conjunto do tubo de aspirador e mantenha o bocal na boca, ou se conectar a agulha para um dispensador de lâmpada. Mergulhe a ponta da agulha para a solução de heparina, e heparinizar a agulha por sucção e soprando através da solução (Figura 1D e 1E).
   Nota: O conjunto do tubo de aspirador foi usado para a criopreservação de esperma de peixe-zebra ^16. Tubo de borracha longa pode parar qualquer sangue voando na boca. A definição de um filtro no meio do caminho do tubo pode evitar os perigos.
5. Armazenar as agulhas heparinizados em um prato de Petri de 10 cm e seco ao ar durante pelo menos 1 h. Um grande número de agulhas pode ser preparado antecipadamente.

2. Anestesia

1. Preparar a solução de anestésico numa pequena caixa de plástico através da mistura de 200 ml de água de peixe com 100 ul de 2-fenoxietanol (2-PE). A concentração final dos anestésicos é de 500 ppm.
   CUIDADO! 2-PE tem um efeito rápido.
2. Remover número desejado de peixe (estirpe AB) a partir do sistema de circulação.
3. Use uma rede para transferir o peixe para os anestésicos para 1-2 min (Figura 1F). Observar os peixes nadar gradualmente, espalhar as barbatanas peitorais horizontalmente, suspiro, e tem movimentos rápidos opérculo dentro de 1 min.
4. À medida que o tempo passa, observar o peixe estava deitado no fundo do caso e finalmente parar de nadar. O plano cirúrgico de anestesia chegará quando o peixe pára para respirar e os movimentos são lentos opérculo. Neste ponto, o peixe está pronto para a coleta de sangue.
5. Usando uma escumadeira levantar o peixe anestesiados a partir do 2-PE e suavemente coloque-o sobre uma toalha de papel embebido com os anestésicos (Figura 1G). Cubra a cabeça do peixe com papel de tecido macio também embebido com solução de 2-PE para prevenir o ressecamento dos olhos e usar outro papel de tecido macio e seco para gentilmentesecar a superfície do corpo.

3. Recolha de Sangue

1. Coloque uma agulha heparinizado no final nosepiece do conjunto do tubo de aspiração (ou o bulbo dispensador) e segure a extremidade do bocal do conjunto do tubo de aspiração na boca.
2. Segure a extremidade nosepiece ea agulha juntos, e retire cuidadosamente as escalas que interferem com a ponta da agulha. Inserir a agulha em um 30 - ângulo de 45 ° para o local de coleta de sangue. Evitar a perfuração do tracto gastrointestinal (Figura 1H). Em caso de utilização de bulbo dispenser, pressione a lâmpada com o polegar eo dedo médio, e bloquear o buraco na ponta do bulbo com primeiro dedo, em seguida, inserir a agulha conforme descrito acima.
   Nota: O local para a recolha de sangue é ao longo do eixo do corpo e do posterior para o ânus na região da aorta dorsal. A aorta dorsal (DA) e a veia cardinal posterior (PCV) são apenas ventral para a coluna vertebral (Figura 2).
3. Começar a sugar obocal extremidade do conjunto do tubo de aspiração, quando a agulha é sentida tocar na coluna vertebral. Se o sangue não subir, mova a ponta da agulha sutilmente com a mão para estimular o fluxo sanguíneo. Note que quando o sangue está a aumentar na agulha, pare imediatamente a tremer e sugar delicadamente (Figura 1I). Em caso de utilização de bulbo dispensador, libertar a pressão do bolbo para aspirar o sangue.
4. Observar o sangue irá subir lentamente para dentro da agulha de uma maneira pulsátil, sem aspiração, o qual é provável, porque a pressão do sangue arterial. Assim, não é necessário para sugar se a agulha penetra correctamente a artéria.
5. Pare sucção depois o volume adequado de sangue é recolhido. Retire a agulha do peixe e pressione o local da punção usando lenço de papel macio para evitar qualquer sangramento. Observe a parada do sangramento após cerca de 10-20 segundos de pressão do dedo (Figura 1J).
6. Após o sangramento é interrompido, transferir imediatamente o peixe de volta a um cleum em água quente (~ 28 ° C) do tanque. Ajude o peixe para recuperar suavemente por água de roda para as brânquias até que ele começa a nadar.
   Nota: Mantenha-se 5 postsampling peixe em um tanque de 2 L e conecte o tanque para o sistema de circulação para oxigenar o peixe. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Manter o peixe com caixa normal e alimentação.
7. Expulsar o sangue a partir da agulha para uma área limpa de uma folha de parafilme (Figura 1K).
8. Medir glicose no sangue usando qualquer glicosímetro portátil comercial (Figura 1D).
   Nota: O glucometer usa um eléctrodo de flavina-adenina-dinucleótido-desidrogenase de glucose e exige um volume de amostra de 0,6 ul.
   1. Insira uma tira de teste completamente no medidor e directamente tocar a gota de sangue. Observe a coleta de sangue na tira de teste automaticamente e obter a glicose no sangue resultado 5 segundos na área de exibição. Anote o resultado e descartar a tira de teste. Use umnova tira de teste para cada medição.
9. (passo facultativo) Leve quantidades precisas de sangue por uma pipetagem e transferir o sangue para um tubo de microcentrífuga para análises posteriores (hemoglobina, triacilglicerol (TG), colesterol total, etc.). Se necessário, diluir o sangue total de um peixe com solução salina. Centrifugar as amostras de sangue durante 3 min a 680 xg à temperatura ambiente e recolher o plasma. Transfira o plasma para um novo tubo. Neste ponto, que está pronta para ser utilizada em análises bioquímicas.

Resultados

Este método de coleta de sangue causa lesão mínima de peixe-zebra (a <1mm punção; Figura 1J) e produz uma taxa de mortalidade muito baixa de 2,3%. Foi examinado o volume máximo de sangue que pode ser recolhido a partir de um único peixe e avaliada a relação com o seu peso corporal (Figura 3). Descobrimos que o volume de sangue coletado máximo foi linearmente correlacionado com o peso corporal (R = 0,813). O maior volume de sangue coletado de um peixe indivíduo (peso corporal = 1.071 ...

Discussão

Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado para a obtenção de sangue em série a partir de peixe-zebra adulto. Este método é simples de realizar e usá-lo no laboratório, numa base diária. Este método de coleta de sangue é baseada na inserção de uma agulha capilar de vidro em aorta dorsal do peixe-zebra. Durante este procedimento, é crítico para ter o cuidado de não fazer a ablação da coluna porque é o critério para a busca de aorta dorsal. Reduzir a lesão da coluna irá melhorar a taxa de sobrevivência. Embora esta técn...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Capilares de vidro com filamento	Narishige	GD-1	1,0 mm de diâmetro externo.
Extrator de agulhas	Narishige	PC-10	Para produzir as agulhas
Heparina	Wako Pure Chemical Industries	081-00136	Para heparinização
Conjunto de tubos aspiradores	Drummond	2-040-000	Para coleta de sangue
Dispensador de lâmpadas	Drummond	1-000-9000	Para coleta de sangue
2-fenoxietanol	Wako Pure Chemical Industries	163-12075	Para anestesiar os peixes
DRI-CHEM3500V	Fujifilm-Para		medição de hemoglobina
DRI-CHEM Slides	Fujifilm	Hb-WII	Para medição de hemoglobina
Glutest Neo Super	Sanwa Kagaku Kenkyusho-Para	de	glicose bood
Wako L-tipo TG kit	Wako Pure Chemical Industries	464-44201	Para TG medição
Wako L-tipo CHO kit Wako	Pure Chemical Industries	460-44301	Para medição do colesterol total
Parafilm M	Alcan Packaging	PM996	Para expelir o sangue em

de medição