Circunscrito capsular infarto Modelagem usando uma técnica Photothrombotic

Resumo

Este manuscrito descreve uma técnica de modelagem de infarto capsular. Aqui utilizamos uma técnica photothrombotic modificado com baixa intensidade de luz após o mapeamento de destino pré-cirurgia. Usando esta técnica, criamos um modelo de enfarte capsular circunscrito com comprometimento motor persistente.

Resumo

O recente aumento na taxa de prevalência de acidente vascular cerebral na substância branca exige pesquisas específicas na área. No entanto, a falta de um modelo animal pertinente para o acidente vascular cerebral da substância branca tem dificultado as investigações de pesquisa. Aqui, descrevemos um novo método para criar um infarto capsular circunscrito que minimiza os danos às estruturas vizinhas da substância cinzenta. Usamos o traçado neural pré-operatório com proteína fluorescente verde de vírus adeno-associado (AAV-GFP) para identificar a organização somatotópica da área do membro torácico dentro da cápsula interna. O ajuste da intensidade da luz com base em diferentes propriedades ópticas da substância cinzenta e branca contribui para a destruição seletiva da substância branca com relativa preservação da substância cinzenta. O posicionamento preciso da interface óptico-neural permite a destruição de toda a área do membro anterior na cápsula interna, o que leva a um déficit motor acentuado e persistente. Assim, essa técnica produz lesões de infarto capsular altamente replicáveis com déficit motor persistente. O modelo será útil não apenas para estudar o AVC da substância branca (WMS) nos níveis comportamental, de circuito e celular, mas também para avaliar sua utilidade para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas e de reabilitação.

Introdução

Até recentemente, a "massa cinzenta acidente vascular cerebral (GMS) modelos" têm sido utilizados exclusivamente para entender a fisiopatologia do derrame e para orientar o desenvolvimento de novos tratamentos. No entanto, tem havido um aumento da prevalência de acidente vascular cerebral que afeta a matéria branca subcortical em indivíduos idosos, o que constitui 15 - 25% de todos os acidentes vasculares cerebrais ^1,2. Numerosos estudos têm sido realizados sobre acidente vascular cerebral utilizando modelos GMS, ao passo que há poucos estudos que usaram modelos (WMS) acidente vascular cerebral substância branca. A substância branca em roedores é substancialmente menor do que a substância branca em seres humanos ou primatas. Por conseguinte, é mais difícil de aceder selectivamente destruir e as regiões alvo na matéria branca ^3. Além disso, não há ferramentas eficazes têm sido desenvolvidos até à data para destruir selectivamente a extensão prevista da matéria branca alvo. Por conseguinte, tem havido falta de modelos adequados para o estudo de acidentes vasculares cerebrais de substância branca.

st animalmodelos Roke são muitas vezes utilizados para monitorar o progresso da recuperação motora para o desenvolvimento de novos reabilitação e métodos terapêuticos. É ideal para utilizar um modelo animal que apresenta um défice neurológico longo prazo concordantes com as alterações anatómicas demonstradas em acidente vascular cerebral humano ^4,5. A este respeito, a rápida recuperação do déficit motor e amplo envolvimento do cérebro após a lesão do infarto pode não ser realista na busca de pesquisa acidente vascular cerebral. Anteriores modelos capsular de enfarte têm sido feitos pela oclusão da carótida interna ou artérias coroideias anterior e difusão de endotelina-1 (ET-1) no interior da cápsula interna ^6-9. No entanto, exige a oclusão da artéria dissecção cuidadosa das artérias, mas produz uma vasta área de lesão do enfarte, incluindo a cápsula interna, sem déficits comportamentais persistentes. Além disso, a ET-1 não era difusa para destruir completamente a parte posterior da cápsula interna e, consequentemente, menos marcada ou persistir Behdéficit avioral.

Um modelo de enfarte do photothrombotic tem sido amplamente utilizada para gerar vários tipos de lesões de enfarte do córtex e estruturas subcorticais ^10. A técnica incluem a administração intravenosa, seguida de iluminação focal, o que leva a agregação de plaquetas nos vasos pequenos e geração de lesões enfarte ^10. Técnica Photothrombotic tem sido amplamente utilizada para criar lesões GMS, enquanto que raramente tem sido utilizado para gerar lesões WMS ^5,11. Para esta técnica, uma combinação de corante e luz de irradiação Rosa de Bengala foi demonstrado ser útil na destruição da estrutura de alvo, fazendo com que os défices funcionais correspondentes. O elemento-chave da técnica photothrombotic é irradiação de luz, uma vez que determina o tamanho das lesões de enfarte. resultados de irradiação de luz em diferentes efeitos sobre a matéria cinzenta e matéria branca, porque a dispersão da luz é mais do que 4 vezes maior em ma brancotter em comparação com a matéria cinzenta ^12; Por conseguinte, se a intensidade de luz tem uma suficientemente baixa irradiação (<1140 mW / mm ^2), pode-se limitar a extensão para a qual lesão photothrombotic afectar a extensão para a substância branca (isto é., Cápsula interna). Por exemplo, a luz de energia mais elevada pode induzir enfartes, tanto na substância cinzenta e branca, mas a luz de energia mais baixo pode induzir fototrombose apenas na substância branca. Além disso, a penetração da energia luminosa foi muito limitada. Aproximadamente 99% da energia da luz foi perdido para além de 1 mm a partir da fonte de luz ^13. Portanto, espera-se que o alvo com exactidão, a luz de menor energia induz fototrombose apenas na matéria branca, com uma interferência mínima da matéria cinzenta vizinha.

Aqui, nós descrevemos um novo método para criar lesões na área de enfarte do membro anterior da cápsula interna em roedores. Nós descrevemos o método de identificação da área do membro anterior na ca internapsule, a tecnologia de irradiação de luz, incluindo o ajustamento e a entrega de luz, e a geração de uma lesão do enfarte. Descrevemos também testes comportamentais utilizados para avaliar a integridade da modelagem capsular.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de Gwangju Instituto de Ciência e Tecnologia (GIST), e todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na GIST.

1. etapas de pré-lesão de

1. Identificação da Área Membro Anterior na cápsula interna usando AAV-GFP
   1. Casa e lidar com ratos Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 semanas) em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais.
   2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e eletrodos usando um esterilizador apropriado (vapor ou esterilizador Plasma). Use esterilizador a vapor a 121 ° C como configuração de 30 min para a esterilização e 30 minutos para secar.
   3. Anestesiar os animais com uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) através de uma injecção intramuscular. Verifique a profundidade da anestesia por beliscar pata. Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C por meio de uma almofada de aquecimento sobo corpo do animal.
   4. Colocar o animal em um quadro estereotáxico usando uma barra de ouvido e suporte de boca.
   5. Limpar e desinfectar o local da cirurgia com álcool a 70% e solução de povidona iodo. Se infiltrar 2% de cloridrato de lidocaína sob o couro cabeludo na área do crânio incisão destina-se a reduzir a dor intra-operatório.
   6. Aplicar veterinário pomada oftálmica para evitar a secagem dos olhos. Coloque uma cortina estéril sobre o animal aos locais operatórias. Manter todos os procedimentos em condições estéreis.
   7. Realizar uma incisão na linha média do crânio de 2 cm utilizando um bisturi e retrair a pele bilateralmente com afastadores de arame. Seque o crânio com cotonetes e 30% de peróxido de hidrogênio.
   8. Faça um furo usando uma broca parte da mão sobre a área do membro anterior do córtex motor (AP: 2,5 a partir de bregma, ML: ± 2.5 da linha média) e limpar o trato com micro-currette para o vírus de injecção.
   9. Descongelar o AAV-GFP (2 x 10 ¹² moléculas de vírus / ml) em gelo e carga 1 ul davírus em uma seringa de 10 ul. Coloque a seringa no quadro estereotáxico.
   10. Mover a agulha para o orifício pré-fabricados e baixar a agulha 1 mm de profundidade dentro da dura-máter.
   11. Injectar o vírus lentamente (0,1 ul / min) usando uma microbomba alta precisão e deixar a agulha no lugar por um período adicional de 10 minutos para permitir que o vírus se difundem para fora.
   12. Depois de limpar o local da cirurgia com irrigação salina, garantir o ferimento com sutura 3-0 nylon; libertar o rato a partir da moldura estereotáxica e transferi-lo para uma câmara de recuperação. Administrar cetoprofeno (2 mg / kg) através de uma injecção intramuscular para o controlo da dor pós-operatória.
   13. Manter a temperatura do corpo (37 ° C) com a almofada de aquecimento e administrar antibióticos de segunda geração cefens-classe (0,1%, 1 ml) por meio de uma injecção intramuscular e 2% de cloridrato de lidocaína por meio de injecção subcutânea, conforme necessário. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manterdecúbito esternal. Única casa o animal até a recuperação completa.
   14. Após 2-3 semanas de recuperação, anestesiar profundamente o rato com uma overdose de cloridrato de cetamina (300 mg / kg) através de uma injecção intramuscular na capa. Confirmar a morte de animais por falta de toe beliscar resposta, pulso e respiração. Coloque o supino rato no capô.
   15. Abrir a cavidade abdominal através de uma 'incisão em forma de Y'para abrir a cavidade torácica. Prender firmemente a aorta descendente, com uma pinça hemostática e romper o átrio direito do coração de rato para a drenagem de sangue. Iniciar a perfusão para o ventrículo esquerdo do coração com frio de paraformaldeído a 1% durante 5 min (10 mL / min), seguido por paraformaldeído a 4% durante 30 min (10 mL / min).
   16. Retire a cabeça de rato a partir da carcaça usando um par de tesouras. Faça uma incisão na linha média do pescoço até o nariz e remover os músculos do pescoço usando tesoura ou rongeur modo que o crânio é exposta. Gentilmente dissecar os ossos do crânio e duras para fora do cérebro.
   17. Extrai-se a colocar o cérebro e cérebro de rato num tubo cónico de 50 ml cheio com paraformaldeído a 4% durante a noite. No dia seguinte, lava-se a cérebro com 1x PBS 3 vezes e coloca-se numa solução de sacarose a 30%.
   18. Após o cérebro completamente afunda para o fundo da solução de sacarose a 30%, colocar o cérebro no cryomold com composto OCT, a -20 ° C em Criótomo. Corte o cérebro no plano coronal com uma espessura de 40 um e um intervalo de 200 | im.
   19. Realizar a coloração imuno-histoquímica GFP utilizando o método slide ^14. Aplicar o anticorpo primário (1: 200 de anti-Proteína Fluorescente Verde, fracção IgG de coelho) com fatias de cérebro durante a noite a 4 ° C. Em 2 ^° dia, lava-se com 1% Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBST) solução de Tween-20 e 3 vezes aplicar o anticorpo secundário (1: 500 de IgG de cabra anti-coelho (H + L)) durante 1 h. Lave o slide com 1% PBST 3 vezes. Coloque a tampa de vidro sobre a fatia do cérebro.
   20. Usando um microscópio de fluorescência (comprimento de onda de excitação470 nm, comprimento de onda de emissão de 525 nm, Ampliação 5X), observar o AAV-GFP axónios transduzidas na cápsula interna. Comparar os locais de axónios transduzidas com o atlas de cérebro de rato ¹⁵ para determinar as coordenadas estereotáxicas dos axónios transduzidas
2. Ajuste da intensidade de luz adequada para capsular infarto Modeling pré-lesão de
   1. Construção da Interface Neural Optical
      1. Corte um comprimento adequado (4 cm) de uma agulha espinhal calibre 27 com um estilete dentro de usar uma broca de corte.
         Nota: O corte pode comprimir e esmagar a ponta da agulha espinhal; remover o estilete e polir a ponta de agulha espinhal para remover a porção esmagado da agulha espinhal e manter o calibre interno da agulha espinhal.
      2. Tira um comprimento apropriado (10 cm) do invólucro da fibra óptica (125 um com um núcleo de 62,5 mm) de cabo de remendo um lado.
      3. Insira o fi óptica unjackedber para o tubo metálico (diâmetro externo: 3,8 milímetros, diâmetro interno: 3,3 milímetros e o comprimento: 17 mm), que é então apertado em torno da fibra. O tubo de metal é útil para preencher o espaço entre a fibra óptica e o cubo da agulha espinhal. Prender o inferior 02/01 do tubo de metal com uma prensa de duas vezes.
      4. Aplicar o epóxi curáveis ​​por calor sobre a fibra óptica e inserir a fibra óptica para dentro da agulha espinhal. Aplicar um epóxi adicional para o espaço vazio no centro. Curar o epoxi durante 20 min a 100 ° C para a fixação estável.
      5. Clivar a fibra óptica, que se projecta para fora da agulha espinhal e polir a fibra óptica na ponta da agulha espinhal usando polimento de diamante (polimento) folhas.
      6. Ligue a parte do conector FC / PC do cabo de remendo para o acoplador do sistema de laser verde e medir a intensidade da luz da ponta da fibra óptica usando potência óptica digital e medidor de energia.

2. PhotothromBotic infarto a lesão na cápsula interna

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e eletrodos usando um esterilizador apropriado (vapor ou esterilizador Plasma). Use esterilizador a vapor a 121 ° C como configuração de 30 min para a esterilização e 30 minutos para secar.
2. Anestesiar o animal (~ 400 g, 11 - 13 semanas) com uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) através de uma injecção intramuscular. Verifique a profundidade da anestesia por beliscar pata. Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C por meio de uma almofada de aquecimento sob o corpo do animal.
3. Colocar o animal em um quadro estereotáxico usando uma barra de ouvido e suporte de boca.
4. Limpar e desinfectar o local da cirurgia com álcool a 70% e solução de povidona iodo. Se infiltrar 2% de cloridrato de lidocaína sob o couro cabeludo na área do crânio incisão destina-se a reduzir a dor intra-operatório. Aplicar veterinário pomada oftálmica para evitar a secagem dos olhos.
5. Aplique uma cortina estéril sobre a umaimal e expor os locais operatórias. Manter todos os procedimentos em condições estéreis.
6. Realizar uma incisão na linha média do crânio de 2 cm e retrair a pele bilateralmente com afastadores de arame. Seque o crânio com swaps de algodão e peróxido de hidrogênio.
7. Ajuste a altura do grampo do nariz até o bregma e lambda são alinhados no mesmo nível. Passo crítico: Este alinhamento é crítico para abordar correctamente uma estrutura mais profunda, tal como na realização de uma lesão do enfarte na cápsula interna na experiência principal.
8. Fazer um furo (diâmetro: 2 mm; AP: -2,04 partir bregma; ML: ± 3.0 a partir da linha média) usando uma broca para induzir fototrombose.
9. Polonês e limpar a ponta da fibra óptica da interface óptica. Fixar a ONI para o quadro estereotáxico sem dobrar. Verifique a ponta da ONI e eliminá-lo de forma clara, antes e após a inserção da interface óptica.
10. Medir a intensidade do laser a partir da ponta da fibra óptica antes da inserção do Optical interface para o local alvo do cérebro de rato. Ajustar a intensidade do laser de 3,5 mW, tal como foi confirmado por medidas de pré-cirurgia, na ponta da fibra óptica.
11. Inserir o ONI dentro da área alvo da cápsula interna (-7,8 mm confirmados a partir do passo de pré-cirurgia) através do orifício de broca.
12. Manter a temperatura do corpo a 37,5 ± 0,5 ° C durante fototrombose. A temperatura do corpo mais baixa pode não produzir o grau esperado de infarto. Injectar Rosa de Bengala (2 ml / kg) através da veia da cauda.
13. Ligue a 532 nm laser verde para 90 seg 1 min após a injeção Rose Bengal. Após a irradiação, remova cuidadosamente a ONI do cérebro. Depois de limpar o local da operação, garantir a ferida garantir a ferida com sutura 3-0 nylon; libertar o rato a partir da moldura estereotáxica e transferi-lo para uma câmara de recuperação.
14. Para o grupo de operação simulada (SOG), realizar um procedimento de tomada de lesão idênticos, exceto para a injeção de solução salina (0,2 ml / 100 g) em vez de Rose-Bengal.
15. Manter a temperatura do corpo (37 ° C) com a almofada de aquecimento após a cirurgia e administração de antibióticos de cefalosporina de segunda geração (, 0,1%, 1 ml) por meio de uma injecção intramuscular. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva animais pós-cirúrgicos para a gaiola ocupados por outros animais até que esteja totalmente recuperado.
    NOTA: experiência preliminar foi realizada nos mesmos procedimentos para encontrar a intensidade de luz óptima de 1 mW a 5 mW e o procedimento pode ser exigido para adquirir o grau satisfatório de lesão em condições diferentes.

3. Avaliação da capsular infarto a lesão

1. Testes comportamentais e Agrupamento animal
   1. Execute pellet única atingindo tarefas como descrito por Whishaw et al. ¹⁴ para avaliar o déficit motor do membro anterior a cada dia durante 1 semana após a modelagem acidente vascular cerebral. Realizar uma única tarefa pellet chegar(SPRT) em animais com restrição de alimentos (90% do controle de peso corporal) usando Plexiglas claras (30 x 15 x 35 cm de altura) com uma fenda de 1 cm de largura e uma prateleira de alimentos na frente do meio da parede anterior.
   2. Colocar um pellet na prateleira de alimentos obliquamente contralateral ao membro anterior preferida. Administrar 20 pelotas por sessão durante 3 semanas.
      NOTA: Um número bem sucedida de SPRTs é definido como um alcance no qual o animal apreende uma pelota de alimentos e coloca-lo na boca, sem deixá-la cair.
   3. Calcular a pontuação como uma percentagem de sucesso atinge, o qual é definido pela seguinte fórmula:
      
      NOTA: Nós dividir os animais em 3 grupos: o grupo de operação simulada (SOG), grupo de recuperação moderada (MRG), e um grupo de recuperação pobres (PRG). Se uma pontuação SPRT pós-AVC> 50%, classificamos os ratos como a MRG, o que indica a presença de uma lesão substancial, mas a destruição não completa do target. Se a pontuação SPRT pós-AVC é <50% em comparação com o resultado SPRT pré-acidente vascular cerebral, podemos classificar o grupo como PRG, o que indica a lesão completa no alvo.
2. Confirmação neuro-histológicos de infarto a lesão
   1. Realização de perfusão cardíaca com paraformaldeído a 4%, como descrito anteriormente. Após o cérebro afunda completamente na solução de sacarose a 30%, realizar corte coronal com uma espessura de 10 um e um intervalo de 200 um utilizando um micrótomo ou Criótomo ^4.
   2. Mancha com H & E, Nissl, Luxol fast blue-PAS, neurofilamento proteína-G ou coloração proteína ácida fibrilar glial e observar os achados histológicos para determinar a intensidade da luz ideal que pode cobrir toda a largura da cápsula interna na área alvo para observar coloração ^4,17.
   3. Utilizando o software ImageJ, medir o volume da área de enfarte photothrombotic da cápsula interna sobre as lâminas do cérebro.
      1. Para medir o volume da área de enfarte, inicie o software "ImageJ". Para abrir os arquivos a serem empilhados, selecione "Imagem para Stacks '(' Imagem '→' Stacks '→' Image to Stacks '). Editar nome do arquivo e selecione "Definir a escala" ( "Analisar" → "Definir a escala ') para editar escala.
      2. Em 'Plugins', selecione "Meça Stacks 'para calcular o volume ou área de imagens. Insira o intervalo de distância de 2 imagens em 'Slice Espaçamento'. Faça um desenho do ROI (Região de Interesse) de todas as imagens e clicar em 'Medida'.
         NOTA: O software "ImageJ" calcula automaticamente a área eo volume de cada imagem e volume total deles.

Resultados

O método aqui apresentado destina-se a criar um enfarte capsular circunscrito com um déficit motor. Portanto, é crítico para determinar correctamente o alvo no interior da cápsula interna na etapa de pré-cirurgia. O mapeamento somatotopic de fibras piramidais na cápsula interna não foi resolvido até o momento. Para identificar corretamente o alvo dentro da cápsula interna, a área do membro anterior devem ser delimitadas. Uma injecção de AAV-GFP para a área do membro anterior do córtex mo...

Discussão

O modelo do infarto capsular aqui apresentado demonstra uma lesão-alvo com comprometimento motor acentuado e persistente na função de membro anterior. Modelos anteriores de AVC capsular subcortical demonstraram um grau insuficiente de comprometimento motor e uma ^6,8,9 processo de recuperação rápida. Neste sentido, este modelo se assemelha os casos clínicos capsular de enfarte que exibem insuficiência funcional a longo prazo.

Os passos mais críticos no desenvolvimento de um modelo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Controlador de temperatura DC	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.
Instrumentos Estereotáxicos Digitais	STOELTING CO.	51900
Estimulador Elétrico	CyberMedic Corp.	EMGFES 2000
Epóxi	Produtos de fibra de precisão, INC.	PFP-353ND1	Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) por peso  Cronograma de Cura: 1 min @150 ° C 2 ~ 5 min @120 ° C 5 ~ 10 min @100 ° C 15 ~ 30 min @80 ° C
Scribe de Fibra Óptica	THORLABS, INC	S90R
Cabo de remendo de fibra	COREIA OPTRON Corp.		Diâmetro externo: 3 mm Ø 200 µ m 0.39 NA FC/PC-FC/PC Fonte
de alimentação a laser	CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.	MGL-FN-532nm-200mW-14010196
Anel de crimpagem	DAWOOTECH CO., LTD.		Comprimento: 19 mm Diâmetro interno: 3 mm Diâmetro externo: 3,8 mm Material:
Controlador de bomba de seringa SUS Micro4-micro	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	95100
Medidor de Potência Óptica	THOLABS, INC	PM100D
Folha de lapidação (polimento) de diamante	THORLABS, INC	LF3D	Grão : 3 µ m
Folha de lapidação (polimento) de diamante	THORLABS, INC	LF6D	Grão : 6 µ m
Rosa Bengala	SIGMA-ALDRICH CO. LLC.	330000
Agulha para raquianestesia com ponta de lápis (Agulha espinhal)	B.BRAUN MELSUNGEN AG	4502027	Tamanho: 27 G Comprimento: 88 mm Agulha: 0,40 mm
Lixa impermeável	DEERFOS CO.,LTD	CC261	Grit: 1,000 µ m
Nanofil 10  µ WORLD	PRECISION INSTRUMENTS, INC	NANOFIL
Nanofil 33  Agulha G BVLD	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NF33BV-2 AAV-GFP
vírus	UNC Vector Core	AAV2-CamKIIa-eYFP	2 x 1012 moléculas de vírus/ml
Proteína Fluorescente Anti-Verde, fração IgG de coelho	Life Technologies, INC	A11122	anticorpo primário (1:200)
IgG anti-coelho de cabra (H + L)	Life Technologies, INC	A11034	secundário anticorpo (1:500)
Ceftezol	GUJU Pharma CO.,LTD.	A27802741	0,1%, injeção
cloridrato de lidocaína	JEIL PHARMACEUTICAL CO., LTD.	A04900271	2%, 1 ml
Broca de Peça de Mão	Seshin
Medidor de energia óptica digital	THORLABS, INC	PM100D
Cetoprofeno	UNIBIOTech