Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

Summary

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Abstract

Durante a infecção de células humanas por adenovírus (Ad), o núcleo da célula hospedeira é dramaticamente reorganizado, levando à formação de microambientes nucleares através do recrutamento de proteínas virais e celulares para locais ocupados pelo genoma viral. Esses locais, chamados de compartimentos de replicação (RC), podem ser considerados domínios nucleares induzidos por vírus, onde o genoma viral é localizado e proteínas virais e celulares que participam da replicação, transcrição e processamento pós-transcricional são recrutadas. Além disso, proteínas celulares envolvidas na resposta antiviral, como proteínas supressoras de tumor, componentes de resposta a danos no DNA (DDR) e fatores de resposta imune inata também são cooptados para CR. Embora os CR pareçam desempenhar um papel crucial para promover um ciclo de replicação eficiente e produtivo, uma análise detalhada de sua composição e atividades associadas não foi feita. Para facilitar o estudo do RC adenoviral e potencialmente de outros vírus de DNA que se replicam no núcleo da célula, adaptamos um procedimento simples baseado em gradientes de velocidade para isolar o Ad RC e estabelecemos um sistema livre de células passível de conduzir estudos morfológicos, funcionais e composicionais dessas estruturas subnucleares induzidas por vírus, bem como estudar seu impacto nas interações hospedeiro-célula.

Introduction

Os adenovírus contêm um genoma de ADN de cadeia dupla que replicam no núcleo da célula infectada. Quando o ADN virai entra no núcleo, que se localiza junto a PML corpos nucleares ^1. Após expressão do gene precoce viral, a arquitetura nuclear é reorganizada de forma dramática, induzindo a formação de microambientes virais, denominado de Compartimentos replicação viral (RC) ^2. Desde adenovirus (Ad) RC são os locais onde a replicação viral genoma e expressão de genes virais final têm lugar, eles fornecem um ambiente para o recrutamento de todos os fatores virais e celulares necessários que participam nestes processos. Curiosamente, uma variedade de....

Protocol

1. HFF Cultura de Células e-infecção Anúncio

1. Propagar o vírus Ad5 WT em monocamadas de células HEK-293 e título como unidades formadoras fluorescentes (UFF) em células HFF como anteriormente descrito ^8.
2. Cresça fibroblastos de prepúcio humano (HFF) em 10 ml de DMEM / 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) em cultura estéreis placas de 100 mm a 37 ° C e _5% de CO2 num incubador humidificado. Determinar o número de células utilizando uma câmara de Neubauer por contagem de células nas quatro conjuntos de 16 quadrados. O número de células por mL é obtida através do cálculo da média do número de células nas quatro conjuntos de 16 quadrados....

Results

Uma vez que os compartimentos de replicação virai (RC) são estruturas virais induzidas subnucleares compostas por proteínas e ácidos nucleicos, semelhante a outros domínios nucleares, elas provaram ser passíveis de isolamento por gradientes de velocidade com base nas características bioquímicas. As etapas críticas no protocolo de fraccionamento são ilustrados na Figura 1. Em cada passo, as amostras devem ser monitorizada por microscopia de campo brilhante para assegurar a integridade da.......

Discussion

A fim de elucidar os mecanismos moleculares que governam a regulação das atividades celulares pela infecção viral, entender a composição e as atividades associadas ao CR seria fundamental. Portanto, para fazer uma análise detalhada do CR, estabelecemos um sistema livre de células que aproveita o tamanho e a composição bioquímica dessas estruturas induzidas por vírus, para isolar frações subnucleares enriquecidas com RC usando um procedimento simples que se baseia em gradientes de velocidade com almofadas de sacarose. As .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Quente em 37 º C banho-maria antes do uso
Soro Fetal Bovino	Gibco	12484-028
Sacarose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare uma solução estoque de 2,55 M e armazene a 4 º
Homogeneizador C Dounce	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Banho Ultrassônico	Branson	Z769533  SIGMA	Ligue 15 min antes de usar.
Anticorpo secundário anti-rato IgG1 de cabra, conjugado Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21121	Use a uma diluição de 1:2.000 em
lâminas PBS Silane-Prep	Sigma	S4651-72EA	Aberto em um gabinete de fluxo laminar
SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente	Pierce ThermoScientific	34080