Aqui propomos uma estratégia para estudar o efeito de um fator de transcrição de interesse no transcriptoma de microRNA usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento de matrizes de microRNA após a transfecção de células com pequeno hairpin (sh)RNA visando um fator de transcrição de interesse.
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Artigo de método
Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Enquanto a regulação da transcrição de genes codificadores de proteínas foi extensivamente estudado, pouco se sabe sobre a forma como factores de transcrição envolvidos na transcrição de ARN não-codificantes, especificamente de microARNs. Aqui, propomos uma estratégia para estudar o papel potencial do fator de transcrição na regulação da transcrição de microRNAs usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento. Nós usamos a assinatura epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microRNA e cromatina imunoprecipitação (CHIP) dados -sequencing do projeto ENCODE para identificar promotores de microRNA que são enriquecidos com sítios de ligação de factor de transcrição. Por células de interesse com shRNA alvo um factor de transcrição de interesse e submetendo as células a matriz microRNA transfecção, estudamos o efeito deste factor de transcrição sobre o transcriptoma microRNA. Como exemplo ilustrativo usamos nosso estudo sobre o efeito da STAT3 no transcriptoma microRNA de ly crônicaleucemia mphocytic (CLL) células.
Introdução
MicroRNAs são endógenos RNAs reguladores não codificação pequenas que normalmente funcionam como reguladores negativos de expressão do mRNA ao nível pós-transcricional. Aproximadamente 1000 não codificadora de 20 a 25 nucleótidos de comprimento microARNs são encontrados no genoma humano 1,2. MicroRNAs regular a expressão do gene através de emparelhamento de bases entre a sequência canónica de sementes do microARN e a sua sequência complementar jogo semente, que é normalmente localizado na região 3 'não traduzida (UTR) dos mRNAs alvo. Colectivamente, microARNs regular mais de 30% dos genes codificadores de proteínas 3, mas apenas pouco se sabe sobre a transcrição a partir de ADN de microARNs. Tem sido sugerido que a regulação da transcrição microARN é semelhante à do ARNm de 4,5. Em particular, semelhante à sua actividade na promoção da transcrição de genes codificadores de proteínas, factores de transcrição são pensados para activar a transcrição de microARNs 6. Factor de transcrição-microRNA interação tem sido relatada como um fator modulador da expressão do gene 7, e podem também formar feed-back e loops de feed-forward. Por exemplo, Yamakuchi et ai. Relataram um circuito de retroalimentação em que p53 induz a expressão de microRNA34a, que por sua vez inibe a tradução do SIRT p53 repressor e aumentando desse modo a actividade de p53 8.
Considerando que exemplos específicos de expressão dependente de factor de transcrição de microARNs têm sido relatados, um método aceite, o qual fornece informações sobre a forma como um factor de transcrição de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma é inexistente. O objectivo do protocolo aqui sugerida é a de fornecer uma descrição detalhada da transcrição dependente de factor de regulação do microARN-transcriptoma. Ao combinar os dados publicamente disponíveis, ferramentas de bioinformática e utilizando tecnologia de microarray, os pesquisadores que seguem este algoritmo seria capaz de capturar em uma escala genômica como qualquerfactor de transcrição de qualquer tipo de células de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma e para explorar uma contribuição putativo do factor de transcrição-regulação da expressão de ARNm em microARN.
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Protocolo
1. Identificar fator de transcrição Sites obrigatório em promotora dos genes microRNA utilizando a abordagem de Mineração de Dados
- Use o navegador do genoma da Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC) para extrair dados de imunoprecipitação (CHIP) sequenciação de cromatina gerados como parte da Enciclopédia de projeto elemento de DNA (ENCODE).
- Abra o navegador da tabela no navegador genoma UCSC.
- Use as seguintes especificações para extrair a tabela: Clade: (mamíferos), genoma: (Humana), Assembly: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), o grupo: (regulamento), da faixa (TxnFactorChIP), tabela: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), região : (Genoma), formato de saída (todos os genes da tabela selecionada).
- Salvar a saída do 1.1.2 como um arquivo .txt e em uma planilha.
- Classificar e filtrar para o factor de transcrição de interesse (por exemplo, STAT2).
- Use a lista de promotores de microRNA com base em H3K4me3 epigenética assinatura disponível em Baeer et al. 9 . Copie esta lista em um arquivo .txt.
- Para corresponder de acordo com as coordenadas sobre o genoma humano, mapear os dados de 1.1 e 1.2 (por exemplo, STAT3 vinculativa para os promotores de microRNA putativos) e determinar a afinidade de ligação mediana usando o código escrito em C sharp, conforme descrito no suplemento de codificação de arquivos 1.
2. Utilização de shRNA para sub-regular a expressão de um factor de transcrição de interesse
- Placa de 1,5 x 10 6 células de linha celular 293 de rim embrionário humano em placas de 10 cm a cerca de 50% de confluência (DMEM com FBS a 10%).
- transfectar células de linha 293 de rim embrionário humano de células com 5 ug de proteína de fluorescência verde lentivírus (GFP) contendo shRNA dirigido para o factor de transcrição de interesse e com 5 ug de vectores de embalagem usando o reagente de transfecção para células aderentes de acordo com o protocolo do fabricante.
- Como um controlo, transfectar as células de linha 293 de rim embrionário humano com célulasshRNA mexidos e os vectores de embalagem de acordo com o protocolo do fabricante.
- Mantenha a mistura de transfecção em células durante 16 h (a 37 ° C, incubador de CO2), em seguida mudar para meios frescos 10 ml de 10% de meio DMEM com FBS a 10%.
- Esperar 48 horas pós transfecção, centrifugar a cultura de células (300 x g, 5 min) e recolher o sobrenadante infecciosa. Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 mm (25 mm de agente tensioactivo livre de celulose membrana de etilo) para remover quaisquer células flutuantes.
- Concentra-se o sobrenadante e recolher o lentivírus utilizando um dispositivo de filtro de ultra-centrifuga�o com limite de 100 kDa. Centrifugação a 950 xg durante 30 - 60 min, até que o volume foi concentrado para menos de 250 ul. Armazenar o vírus concentrada a -80 ° C.
- Transfectar as células com o lentivírus. Remover lentivírus congelado de -80 ° C congelador e descongelar até à temperatura ambiente. Transferir 100 ul de sobrenadante virai para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco.
- Bring-se o volume dentro do tubo para 1 ml com meio de soro reduzido. Adiciona-se brometo de hexadimetrina a 1 ml de suspensão de vírus para concentração final de 10 ng / mL, misturar suavemente e deixe a mistura repousar durante 5 min.
- Centrifugar 5 x 10 6 células para cada transdução suavemente e ressuspender o sedimento de células em 0,5 ml de meios contendo vírus. Deixe que as células permanecem na incubadora durante 4-24 h, depois adicionar 0,5 ml de meio com FBS a 20% a uma concentração final de 10% de FBS.
- Esperar 48 a 72 h e corar as células com iodeto de propídio (PI) e proteína fluorescente verde (GFP) de acordo com as instruções do fabricante. Proteger as células da luz e usar um classificador FACS para medir as taxas de GFP + / PI - células. Desde manchas PI única célula morta, esta taxa é uma estimativa da eficiência de transfecção em células vivas.
- Classificar a população de células positiva para a expressão GFP (GFP +) por FACS classificador como descrito anteriormente 10.
- Use Westeblotting imunológico RN como anteriormente descrito 10 para determinar os níveis de um factor de transcrição de interesse antes e depois de infectar as células de interesse (por exemplo, células CLL) com shRNA designado.
3. Determinar o nível de expressão de MicroRNA transcriptoma em células transfectadas com Fator de Transcrição-shRNA
- Isolar ARN utilizando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Rotular o ARN e que hibridizam para microARN microarray 11.
- Determine o microRNA diferencialmente expressos em células transfectadas com transcrição fator-shRNA ou com controle de vetores vazios 5.
- Validar os resultados de microarranjos para os microRNAs mais diferencialmente expressos usando PCR em tempo real 5.
4. Determinar a sobreposição entre a Bioinformática ea Abordagem shRNA Ao descrever o transcriptoma Dependente Fator de Transcrição
- para detArminho as proporções esperadas e observadas de genes microRNA que abrigam fator de transcrição sites em seus promotores vinculativo e foram reprimidos na transcrição fator-shRNA células transfectadas, faça o seguinte:
- Obter a razão de genes que abrigam o factor de transcrição de interesse no seu promotor microARN / total a partir do lista gerada no ponto 1.3. Esta lista é a proporção esperada (por exemplo, genes microRNA com sítios de ligação de STAT3 genes microRNA / total testado = 0,25).
- Determinar o número de genes que foram regulados negativamente em células transfectadas factor de transcrição-shRNA da lista gerada em 3.3 e tem factor de transcrição de locais de ligação de interesse a partir da lista gerada no ponto 1.3. Este número / número total de genes regulados negativamente é a proporção observada (por exemplo, os genes microRNA STAT3 com sítios de ligação / número total de microARNs downregulated = 0,6).
- Use χ2 estatísticas para comparar as proporções observadas e esperadas que foram gerados acima e determinar se a lista de genes que foram regulados negativamente em células transfectadas factor de transcrição-shRNA são enriquecidos com locais de ligação de factor de transcrição no seu promotor.
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Resultados
STAT3 é um factor de transcrição que normalmente induz a transcrição de genes que têm efeitos anti proliferativos 12 e apoptótica. Se STAT3 também afetam o transcriptoma RNA não-codificante é actualmente desconhecida. Em todas as células CLL STAT3 é constitutivamente fosforilada na serina 707 resíduos 10,13. Fosfosserina STAT3 serviços de transporte para o núcleo, se liga ao DNA e activa genes conhecidos por ser activada por tirosina pSTAT3 em outros tipos de célula...
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Discussão
O mecanismo subjacente a ARN polimerase II dependente de transcrição de genes codificadores de proteínas tem sido extensivamente estudada. Embora estes elementos constituem apenas 1% - 2% do genoma humano, a evidência do projecto CODIFICAR sugerem que mais de 80% do genoma humano podem ser submetidos a transcrição 17 e que regula a transcrição dos elementos de ADN não codificantes permanece largamente desconhecido 6 .
Vários estudos, o que indicava que Pol II é também r...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação CLL Global Research. A Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde através de um Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA16672).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0,45 µ m filtro de seringa | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Dispositivo de filtro ultracentrífugo Amicon com limiar de 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagente | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Linha celular humana | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Referências
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Reimpressões e permissões
