Abstract
Forskning kring prenatal programmering i grisen har visat att kön det utvecklande embryot eller fostret kan påverka utvecklings resultatet. Därför är det nödvändigt att kunna bestämma ett embryo kön i många experiment i synnerhet när det gäller tidig utveckling. Föreliggande protokoll visar ett billigt, snabbt och icke-toxiska framställning av gris genomiskt DNA för användning med PCR. Dag 30 embryon måste humant samlas in enligt de riktlinjer som fastställts av Institutional Animal politik och välfärdskommittéerna för det nuvarande protokollet. Framställningen av hela embryot för denna PCR-baserad könsbestämning teknik innefattar helt enkelt mala den frysta embryot till ett fint pulver med användning av en i förväg kyld mortel och mortelstöt. PCR-kvalitet DNA frisätts från en liten mängd embryo pulver genom applicering av en varm inkubation i en alkalisk lysisreagens. Därefter sätts DNA-lösning blandades med neutralisering buffert och användes direkt för PCR. Två primerpar genereras för att DETECt visst kön bestämmande region av Y- kromosomen (SRY) och ZFX region av X- kromosomen med hög noggrannhet och specificitet. Samma protokoll kan tillämpas på andra långsträckta embryon (dag 10 till dag 14) tidigare än Dag 30. Dessutom kan detta protokoll utföras med 96-vällde plattorna när screening av ett stort antal embryon, vilket gör det möjligt för automatisering och hög- genomströmning sex skriva.
Introduction
Tamsvin har blivit en grundläggande forskningsämne i utveckling, genetik och näring i både mänskliga och djursektorn. Potentialen för grisar som biomedicinska modeller för mänskliga forsknings kan hänföras till deras fysiologiska likheter. I boskap, kan manipulering av könskvoten öka effektiviteten i urval och genetiska förbättringsprogram 1. Att könsbestämma individuella embryon är ett grundläggande verktyg som används i många experimentella undersökningar, inklusive men inte begränsat till genotyp, epigenetik och X inaktivering av sexuell dimorphism under tidig embryoutveckling 2.
Studier på möss tyder på att moderns kost och andra faktorer kan leda till obalans mellan könen 3. Hos svin orsakerna till könskvoten obalans inkluderar faderlig ras 4, livmoderkapacitet 5 och suggans metabola tillstånd 6. Eftersom skillnaderna som observerats i embryon och kullar kan påverkas av sigxual dimorphism, bör forskare vara medvetna om embryo kön och könskvoter innan man drar slutsatser om sin forskning. Utvecklingen av effektiva verktyg och protokoll för könsbestämning svinembryon vid dag 30 av utveckling kommer att diskuteras här.
Olika metoder av kön typning har utvecklats för genetiska studier i modellorganismer och boskap. Särskilt i boskap, identifiera manliga och kvinnliga tidiga embryon är en mycket vanligt att förbättra genetiskt urval för avelsprogram. Tidiga embryon karyotypering i gris med hjälp av Giemsa 7 eller intensiv fluorescens 8,9 tekniker har använts för sex typning. Men dessa metoder är tidskrävande och inte lämplig för snabbt och exakt blicka ett stort antal embryon.
Den mest effektiva kön typningsmetod är DNA-amplifiering med användning av ett värmestabilt DNA-polymeras och ett primerpar. DNA könsbestämning av PCR-metoden är mer specifik, snabb och känslig, only kräver en minut mängd av cellulära material. Den första PCR-baserade embryo könsbestämning utfördes på människor 10, och senare i möss 11, nötkreatur 12, buffel 13 och får 14 preimplantatorisk embryon. I grisen, var den tidigaste DNA kön typningsmetoden fastställts för preimplantatorisk embryon via ett enda par av Y-kromosomspecifika DNA-primers 15. Emellertid var de vanligaste PCR-primrar för könsbestämning vald från Y-kromosomen av manlig specifik SRY-gen 16 och den icke-köns diskriminerande region i en zinkfingergenen belägen vid både X och Y kromosom 17. Därefter har dessa primrar tillämpats för att bestämma könet på Dag 30 embryon i denna studie med förbättrad specificitet av primrarna för att detektera endast X- kromosomen hos en zinkfingergenen.
Genomiskt DNA från svin preimplantatorisk embryon kan extraheras genom att exponera en intakt blastocyst att buffra med Proteinase K 16 eller genom att ta en biopsi av ett fåtal celler från individen tidig cleavage embryon 15 och använda dem för direkt PCR. Emellertid är frigörande av DNA från grisblod, hår, vävnader eller en stor Conceptus över några centimeter i storlek inte effektivt göras med proteinas K-metoden. DNA extraktionsmetoder för dessa material har fastställts med hjälp av antingen tidskrävande fenol / kloroform protokoll 6 eller dyr kolonn baserade kit 18. För att undvika användningen av potentiellt toxiska kemikalier, finns det en trend att utveckla billiga, enkla och fenol-fritt DNA extraktionsmetoder. Denna typ av protokoll för isolering av PCR-kvalitet genomiskt DNA från mus 19 och zebrafisk 20 vävnader har fastställts med hjälp av varm natriumhydroxid och tris (hotshot). Denna studie ger ett protokoll för att erhålla DNA med modifierade Hotshot och omgjorda duplex primerpar för PCR sex skriva direkt från cellysat av Dag 30 svinembryon medhög noggrannhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I enlighet med den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer och med godkännande av fakulteten djurpolitik och välfärd kommittén - Boskap vid University of Alberta, var dräktiga suggor avlivas av utbildad personal på ungefär dag 30 av graviditeten och embryon har samlats. Använd undersökningshandskar vid alla tidpunkter under förfarandena.
1. Provtagning och prov lagring
- Avliva sugga med hjälp av bultpistol följt av blodtappning. Bär undersökningshandskar för att samla de reproduktiva skrifter och embryon från varje avlivas sugga.
Obs: Snabb insamling av prover och embryon transfer till torris eller flytande kväve kommer att resultera i högre kvalitet vävnader för andra molekylära arbeten såsom microarray och qPCR. - Dissekera livmodern och försiktigt separera alla embryon inom sina extraembryonic placenta membran från den underliggande livmoderväggen 21. Se till att det inte finns någon maternal vävnadskontamination.
- Resladd längd och vikt av alla livskraftiga embryon före frysning.
- Samla varje enskild embryo och omedelbart slå in den i aluminiumfolie innan snäpp frysning med flytande kväve.
- Överföra de frysta embryon från flytande kväve direkt till en -80 ° C frys.
2. Slipning Embryon
- Märka alla provrör (15 ml) med provets ID behövs för det antal prover som skall analyseras.
- Fyll termisk behållare med torris till halvfullt och sätt i förväg märkt provrör i torris.
- Bär vinter handskar med ett annat par undersökningshandskar på toppen för att överföra pre-kylda mortlar och pestles från -80 ° C frys för att torka is behållare.
- Placera fryst embryo i murbruket på torris.
- Pour adekvat flytande kväve för att täcka embryot och slipa den med mortelstöten till ett fint pulver.
- Överföra embryot pulvret till en i förväg märkt provröret med en microspatula (figur 1) och placera röret i en -80 ° C frys.
- Använd en ren pre-kyld mortel för varje embryo och ändra undersökningshandskar efter slipning varje embryo för att undvika korskontaminering mellan prover.
3. Genomisk DNA Förberedelser Användning Modifierad Natriumhydroxid Method
- Label alla mikrocentrifugrör (1,5 ml) som behövs för det antal prover som skall analyseras.
- Överför provrören innehållande embryo pulver från -80 ° C frys till en behållare med torris före start.
- Pipett 180 ul av 50 mM NaOH (natriumhydroxid) i varje pre-märkt mikrocentrifugrör.
- Slå på en inkubator och värm till 95 ° C.
- Använda en tandpetare för att överföra den korrekta mängden embryopulver (ca 5-10 mg) (figur 2) från provröret in i en pre-märkt mikrocentrifugrör innehållande 50 mM NaOH-lösning.
- dra up samma tandpetare långsamt för att visualisera DNA lysat som en klibbig, sliskig, vita genomskinliga liknande substans (figur 3).
- Överför mikrocentrifugrör med DNA-lysat till den förvärmda inkubator vid 95 ° C under fem minuter. Överför omedelbart röret till en styrofoam låda fylld med is.
- Tillsätt 20 ul av 1 M Tris-HCl direkt in i mikrocentrifugröret och blanda det genom att försiktigt knacka på röret. Använda en pH-papper för att säkerställa att pH är cirka 8,0 (figur 4) före centrifugering.
Obs: När man arbetar med ett stort antal preparat prov, är det acceptabelt att slumpvis plocka några prover för att kontrollera pH. - Centrifugera röret med DNA-lysatet vid 2000 xg i en mikrocentrifug under två minuter vid rumstemperatur för att avlägsna olöst vävnadsrester.
- Överföring 150 pl den övre klara supernatanten till ett nytt rör eller plattor med 96 brunnar.
Obs: Den klara DNA lysatet är redo att använda som en mall i PCR reaktion och det är stabilt vid 4 ° C under två veckor, eller det kan hållas vid -20 ° C i ett år.
4. Design Sex specifika PCR-primers
- Skaffa numren för porcint sex bestämmande region Y (SRY) (NM_214452.3) och och zinkfingerprotein X-kopplad (ZFX) gener (XM_005673501.1) från NCBI webbplats http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
- Kopiera och klistra in dessa NCBI accessionsnummer till en online-primer designverktyg.
Obs: Den bästa primers information, inklusive längd, Tm och GC% samt PCR-produkt storlek (bp) kommer att genereras på datorskärmen (Figur 5). - Validera specificiteten hos dessa primers använder nukleotid Blast program (BLASTN) mot strömmen svin iska databas 104 för att säkerställa att dessa sekvenser endast ligger på X och Y-kromosomen för SRY och ZFX respektive (Figur 6).
5. Genom-DNA PCR direkt från DNA Lysaten
- Användningendast 1 | il av DNA-lysat som en mall för en 15 | al PCR-reaktion.
Notera: En high throughput screening metod för 96-brunnsplattor PCR kan utföras på liknande sätt med användning av en flerkanalspipett. - Gör så här bara för den första PCR: förbereda ett PCR-rör för ingen mall negativ kontroll och ytterligare två rör för positiva kontroller genom att tillsätta en il (0,5 ng) av kommersiellt erhållen kända sex svin genomiskt DNA. Senare, inkluderar ett prov från den senaste framgångsrika könsbestämning analys som en positiv kontroll och drivs tillsammans med den nya PCR-reaktionen för könsbestämning.
- Använd någon HotStart färdigblandad PCR enzym och förbereda en Master Mix genom att lägga till primers och sterilt vatten beroende på det totala antalet PCR-reaktioner. Tillsätt 1 pl av DNA-lysat till en redan existerande PCR-rör med 14 | il av PCR-masterblandningen. Lägg primers så att den slutliga koncentrationen av primrar från två könsspecifika gener är 0,3 | iM i totalt 15 | al PCR-reaction.
- Inrätta följande PCR-program i en anordning för cyklisk värmebehandling: 95 ° C under 3 min, 35 cykler var och en med en 20 sek smältningssteg 98 ° C, följt av en 15 sek glödgningssteg vid 65 ° C, följt av en 15 sek förlängningssteg vid 72 ° C. I ett sista steg, inkubera reaktionerna för en min vid 72 ° C och fortsätta att inkubera vid 4 ° C fram till avlägsnande av PCR-rör för gelelektrofores verifiering för att bestämma könet.
Obs: PCR-förhållanden och optimering är enligt manualen för PCR-kit som nämns i materialtabellen. - Tillsätt en lämplig mängd av giftfri växthus fluorescerande SYBR DNA gel fläck vid framställning av en 2% TBE agarosgel.
Obs: Etidiumbromid kan ersätta växthus fluorescerande fläck om den inte är tillgänglig. - Tillsätt 1,5 pl av laddningsfärg (10x) i PCR-röret och blanda väl genom att pipettera den PCR-reaktionsbuffert upp-och-ner.
- Belastning 10 pl av provet i brunnen och run agarosgelen med lämpliga inställningar spännings (liten gel-apparat vid 100 V, 96 brunnar gel-apparat vid 150 V tills färgen bandet löper halvvägs genom gel).
- Observera och justera bandets intensiteter under fluorescerande ljus inställningen med en laserscanner och fånga en bild av gelen. Notera: Common gel avbildare kan användas i stället för etidiumbromid gel.
- Bestämma könet av de svinembryon genom att identifiera embryon med ett band som en hona och två band som en manlig (Figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt resultat av könsbestämning från 345-DNA-lysat screening genom PCR visas i fig 7 och sammanfattas i Tabell 1.
Såsom kan ses i figur 7, är den primers glödgningstemperaturen vid 65 ° C det optimala tillståndet i denna PCR-protokoll generera liknande intensitet och predicated amplikon storlekar (figur 5) mellan olika prover.
Två förstärkta produkter SRY (400 bp) och ZFX (506 bp) visas i gelén bilden (Figur 7). Manliga embryon visade två DNA-fragment med rätt storlek på den övre (400 bp) och nedre (506 bp) band. Intensiteten hos dessa två band visades vara lika i de flesta manliga individer. Alla kvinnliga embryon visade endast ett enda DNA-fragment motsvarande den ZFX-genen ligger i denX-kromosomen.
DNA-lysat som erhållits från den modifierade 50 mM NaOH kan användas direkt för PCR med ett bra resultat och noggrannhet. DNA-lysaten visade inte någon PCR-reaktion inhibition efter screening 345 embryon. Endast tre personer inte var könsbestämmas och andelen kvinnliga embryon var något högre än män (tabell 1).
Figur 1:. Embryo Pulver Transfer Överföra embryo pulver till en 15 ml rör.
Figur 2: Samla och överföra Embryo Pulver med en tandpetare (A) En överdriven mängd embryo pulver som vidhäftar till tandpetare.. (B) Rätt mängd avembryopulver fastnat på tandpetare som skall överföras till den alkaliska lyseringsreagenslösningen. (C) En otillräcklig mängd embryo pulver som ansluter sig till tandpetare.
Figur 3:. DNA visualiseringsteknik långsamt dra upp tandpetare, efter att ha lagt embryot pulvret, för att avgöra om embryot DNA har upplösts som en klibbig SENTIMENTAL vita genomskinliga liknande substans.
Figur 4:. PH Bekräftelse (A) pH-värdet i natriumhydroxid (alkalisk lys-reagens) lösning är 12,0. (B) Efter tillsats neutraliseringsbuffert till lysbufferten, färg är indikation på pH-papper grönt och pH bör ligga runt 8,0.
Figur 5:.. Sex-specifik primer informationssekvens namn, Sekvenser och amplikonet längd erhålls från primer designverktyg Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kartläggning av Svin könsspecifika Primers på kromosom X och Y. (A) Placering av framåt och omvända primers som anges på ZFX-genen. (B) Placering av framåt och omvända primers som anges på SRY-genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:. PCR-förstärkning av Svinkönsspecifika gener från dag 30 Embryon 2% TBE agarosgel färgad med SYBR DNA gel fläcken med de kända positiva kontrollerna indikeras med manliga och kvinnliga symboler. Två band anges som män och ett enda band som kvinnor. Röd stjärna indikerade eventuell kontaminering provet i brunnen med uppkomsten av en mycket svagt undre bandet (400 bp) jämfört med övre bandet (506 bp) PCR-produkt som orsakas av SRY Y-specifika primers. Röd pil anger ingen mall PCR negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| könsbestämning PCR | embryo Count | |
| ♀ | 185 | 53,60% |
| ♂ | 157 | 45,50% |
| Okänd | 3 | 0,90% |
| Total | 345 | 100% |
Tabell 1: Andel av kvinnlig, manlig och Okänd efter PCR könsbestämning bland 345 Dag 30 embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta av de befintliga protokoll i samband med svinembryon DNA sex typning är endast lämpliga för tidigt preimplantatorisk skede 15,16. Vi har framgångsrikt utvecklat ett protokoll som lämpar sig för svin embryo screening under sen dräktighet. Baserat på studier med liknande utvecklingsstadier av embryon från tidigare studier 6,18, är det nuvarande protokollet anses vara säkrare och låg kostnad.
Detta protokoll är också lämplig för ett stort antal prover för sex typning med PCR genom överföring av DNA-lysaten i en 96-brunnar. Plattan formatet kan high-throughput screening genom att tillåta överföring 1 pl DNA lysat för PCR-reaktionen med hjälp av en flerkanalspipett.
Dock bör flera steg som ingår i förfarandet göras noggrant. För att utföra den modifierade 50 mM NaOH lysmetoden mer effektivt, har den individuellt fryst embryo som skall jordas till fint pulvermed användning av en i förväg kyld (-80 ° C) mortel och mortelstöt. Undvik att spilla embryopulver på torris, genom att försiktigt och långsamt skrapa pulvret i 15 ml rör, såsom visas i figur 1. Ändra undersökningshandskar efter varje prov rekommenderas starkt att undvika pulver på handsken överföring till en annan embryoprov.
Lämplig mängd embryo pulver som ska läggas till den modifierade 50 mM NaOH lys lösning visas i figur 2B. Är en överdriven mängd embryo pulver som presenteras i figur 2A och bör undvikas. Likaså i figur 2C, kan mängden embryo pulver vara otillräcklig för förfaranden nedströms. Även väga embryot pulvret för varje prov är möjligt, är det inte praktiskt när screening embryo sex i en storskalig studie med över hundra embryon.
Mängden DNA kan vara synligt kontrolleras med hjälp av en tandpetare för att kontrollera den klibbiga gooey liknande substans såsom visas i figur 3, om det är tveksamt om den lämpliga mängden av pulver tillsattes i det föregående steget.
Tillsätta rätt mängd neutralisation lösning är viktigt efter lyse embryot pulvret. Figur 4 visar den pH-förändringen efter och före tillsats av neutralisation lösning. Detta steg är viktigt att se till att pH är svagt alkaliskt (omkring 8,0) och därför liknar de flesta PCR-reaktionsbuffertar.
Specificitet oligo primers är det viktigaste elementet för riktigheten i DNA könsbestämning under PCR. Specificiteten av oligo primers kan bekräftas genom NCBI BLASTN-programmet. En enda plats kommer att detekteras på X-kromosomen vid 3'-icke-kodande regionen av ZFX genen för varje primersekvens (figur 6A) för kvinnlig. En liknande situation detekteras endast på Y-kromosomen vid den kodande regionen av SRY-genen (Figur 6B
Felfrekvens grund av att ingen kön identifiering kan vara mycket låg (<1%) som visas i tabell 1, när alla steg gå försiktigt och korrekt. Men i vissa sällsynta fall, är korskontaminering mellan DNA-lysat av två olika prover möjligt och kan detekteras genom PCR såsom indikeras med en röd stjärna i gelén (figur 7). Denna typ av bandmönster i hona kan tolkas som korskontaminering med en manlig prov.
Det är osannolikt att uppkomsten av ett mycket svagt undre bandet beror på primern konkurrensen om PCR-reagens. I detta fall är den mindre amplikon (400 bp) i samband med SRY-genen kommer att generera mer PCR-produkt snabbare än det högre bandet som svarar mot ZFX genen. I detta protokoll, är en nackdel bestämningen av korskontaminering av en manlig provet med en hona. Eftersom vårt huvudsakliga mål är inte kvantifiering av antalet kopior för varje målgen, en litenmängd pulver från den kvinnliga provet skulle inte vara lätt att visualisera på gelén.
DNA könsbestämning Protokollet presenteras här är den mest kostnadseffektiva metoden att identifiera embryo sex under sen dräktighet och kan tillämpas på andra stora boskapsdjur såsom nötkreatur, getter och får. Dessutom har liknande DNA könsbestämning metoden använts hos grisar i samband med suggor metabola tillstånd 18. Ett annat forsknings undersökning med DNA könsbestämning skulle kunna tillämpas för att studera genetisk prägling mekanismen under prenatal programmering av postnatal utveckling i grisen 22. Ett brett spektrum av tillämpningar inom boskap med hjälp av DNA-PCR könsbestämning är möjliga såsom pre kön val avelsprogram och epigenetiska effekter av nutrition och infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för samarbetet och ekonomiska bidrag följande forskningsfinansiär: Alberta boskap och kött Agency Ltd, fläsk CRC, Alberta fläsk, Hypor A Hendrix Genetics Company och NSERC CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used - quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
References
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).
