Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Resumo

Os autores apresentam um protocolo de coleta de lenços nasais suínos para detecção e isolamento do vírus influenza A.

Resumo

Vigilância de vírus da gripe A em suínos é fundamental para a saúde humana e animal, porque o vírus influenza A evolui rapidamente em populações de suínos e novas estirpes estão surgindo continuamente. Suínos são capazes de ser infectado por diversas linhagens do vírus influenza A, tornando-os anfitriões importantes para o surgimento e manutenção da nova gripe A estirpes de vírus. Amostragem suínos em diversas configurações, como granjas comerciais de suínos, feiras e mercados agrícolas, de animais vivos é importante para fornecer uma visão abrangente das cepas que circulam atualmente IAV. O ante-mortem técnica de amostragem padrão-ouro atual (ou seja, coleta de swab nasal) é trabalhoso porque exige contenção física dos porcos. Toalhetes nasais envolvem esfregando um pedaço de tecido em todo o focinho do porco com o mínimo de retenção do animal. A nasal limpe procedimento é simples de executar e não requer pessoal com formação profissional ou veterinária manipulação animal. While ligeiramente menos sensível do que swab nasal, as taxas de detecção e isolamento do vírus são suficientes para fazer nasal limpa uma alternativa viável para a amostragem de suínos individuais quando são necessários métodos de amostragem de baixa tensão. O protocolo de processo descreve as etapas necessárias para coletar uma nasal viável limpe a partir de um porco individual.

Introdução

Os vírus influenza A (IAV) causam doenças respiratórias em muitas espécies, incluindo aves domésticas, suínos e seres humanos. Devido ao rearranjo da evolução viral rápida segmentado genoma IAV pode ocorrer e novas cepas IAV frequentemente surgem. Suína são uma espécie que pode servir como um recipiente de mistura para rearranjo de iAVS a partir de múltiplas espécies hospedeiras. ¹ Atualmente, existem três principais subtipos de IAV normalmente circulam entre os porcos da América do Norte (H1N1, H1N2, H3N2), mas várias introduções IAV de seres humanos têm levou a extensa diversidade IAV dentro desses subtipos. ² evolução rápida da iAVS infectam suínos tem sido evidente desde 1998, quando um recombinante triplo IAV contendo segmentos de genes de vírus humanos, aviários e suínos ³ tornou-se difundido entre os porcos nos Estados Unidos. ⁴ O gene interno segmentos de que IAV recombinado triplo permanecem altamente prevalente entre iAVS atualmente infectando porcos. ⁵

"> Em todo o mundo, IAV é uma importante causa de doenças respiratórias em suínos em que os sinais clínicos típicos incluem febre, anorexia, letargia, tosse, dificuldade para respirar, espirros, corrimento nasal e pouco ganho de peso. IAV pode ser particularmente caro para semear fazendas onde reprodutiva falha devido a febre IAV induzida e leitões fracos-nascido foram documentados ^6,7. Nos Estados Unidos, IAV é comumente detectada em rebanhos suínos comerciais e extensa diversidade antigênica e genômica e evolução contínua entre IAV suína infectar tem dificultado o controle deste vírus ^8-11.

Preocupações de saúde pública sobre a emergência de uma estirpe IAV pandemia resultante do rearranjo em suínos foram realizados em 2009, quando um IAV suína-linhagem contendo segmentos de genes da linhagem suína norte-americana triple-reassortant e da linhagem suína aviária do tipo Eurasian causou uma pandemia mundial em humanos ^12. A pandemia do vírus (A (H1N1) pdm09), desde então,rearranjado com suínos endêmica IAV estirpes ^13,14 e algumas destas estirpes recentemente rearranjado foram transmitidos de volta para os seres humanos. ¹⁵ A freqüência de eventos de rearranjo e surgimento de novas cepas IAV com potencial pandêmico faz a vigilância ativa de vírus circulando IAV em suínos imperativo, especialmente na interface suína-humano.

A interface suína-humano é importante para a transmissão bi-direcional interespécies do IAV. Humano-a-suína transmissão que ocorrem na produção suína comercial é responsável por uma grande quantidade de diversidade IAV actualmente presente na população de porcos. Feiras agrícolas são os maiores configurações para o comingling de pessoas e suína nos Estados Unidos e são locais para a transmissão zoonótica do IAV ^15-21. Em 2012 conhecido, durante o surto de uma variante H3N2 IAV, 93% dos casos relatados no atendimento uma feira agrícola nos dias ¹⁵ Análise Genômica antes do início da doença.dos isolados virais de suínos de exposição em comparação com isolados humanos confirmaram transmissão zoonótica. suína ²¹ Exposição infectado com IAV muitas vezes não mostram sinais clínicos da doença, ^21-23, indicando a necessidade de testes de diagnóstico diretos.

Amostragem de suínos visivelmente doente por si só não irá identificar com sucesso prevalência IAV em suínos e não pode ser invocado para identificar novas cepas de IAV emergentes entre suína. A vigilância ativa é absolutamente necessário para a detecção de estirpes emergentes da IAV nos suínos e para avaliar sua ameaça tanto para suínos e de saúde pública. A maioria das actividades de fiscalização do IAV são voluntárias e, portanto, são necessários métodos minimamente perturbadoras. Os três principais procedimentos de coleta de amostra ante-mortem para IAV infectar suínos são: swab nasal, fluidos orais e nasais toalhetes. As actuais recomendações para a amostragem suína indivíduo para detectar a inserção lista IAV-de fibra sintética com ponta cotonetes nas narinas como o método preferidopara recolher secreções nasais e células epiteliais. ^24,25 Porque os porcos podem tentar evitar este procedimento, uma equipe de pessoal treinado deve conter suínos manualmente ou com um laço, dependendo do tamanho do animal. ²⁶ O processo de contenção é trabalhoso para o pessoal e estressante para os porcos. Além disso, exposição suína estão freqüentemente envolvidos em várias competições em uma feira de modo a percepção de stress em um animal de competição pode fazer proprietários resistente aos esforços de vigilância.

Com probabilidades de detecção IAV que variam de 80-100% em IAV rebanhos infectados, fluidos orais tornaram-se uma alternativa popular para nasal swabs para a detecção molecular do IAV em populações de suínos. ^27,28 Além disso, líquidos orais podem fornecer uma janela mais ampla de IAV detecção de swab nasal após a infecção inicial. No entanto, IAV isolamento a partir de fluidos orais tem sido problemática com apenas 50% das tentativas de isolamento de vírus, resultando em IAV recuperação. ²⁹

Usando toalhetes nasais em vez de swab nasal durante a vigilância IAV em suínos supera as limitações descritas acima. Toalhetes nasais não requerem o uso de uma armadilha de restrição e pode ser realizada sem perturbar os animais testemunhas ou do procedimento. Treinamento técnico mínimo é necessário para coletar limpezas nasais, que permite que os profissionais não-veterinários, incluindo os proprietários de suínos, para recolher as amostras de vigilância. Toalhetes nasais foram comparadas anteriormente para esfregaços nasais para a detecção e isolamento de vírus influenza A e ³⁰ do protocolo detalhado para este método não-invasivo de amostragem é descrito abaixo.

Protocolo

Todos os suínos utilizados na coleta dos seguintes dados estavam protegidos sob O Comitê Animal Care Institucional e Use Ohio State University (uso de animais protocolo número 2009A0134-R1).

1. Preparação de Transporte Viral Médio e Coleta de Amostras Vials

1. Adicionar 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de água purificada e misturar cuidadosamente com uma vareta de agitação e um agitador magnético, enquanto se aquece a 70 ° C para dissolver completamente o pó.
2. Autoclave o caldo a 121 ° C durante 15 min. Legal na bancada até que o caldo atingir a temperatura ambiente. Refrigerar a 4 ° C durante a noite se necessário.
3. Dissolve-se, por mistura com uma vareta de agitação magnética, 6,02 g de sal de sódio da penicilina G e 10 g de sulfato de estreptomicina em 50 ml de água purificada, à temperatura ambiente. Adiciona-se água purificada adicional para levar o volume total a 100 ml. Filtrar a solução através de uma membrana de polietersulfona de 0,22 um para um frasco estéril.
4. Adicionar assepticamente a penicilina filtrada e estreptomicina solução para o resfriado Brain Heart Infusion caldo e misture bem (barra de agitação ou redemoinho frasco à mão) para fazer o meio de transporte viral.
5. Assepticamente testar o pH do meio de transporte viral; se necessário, ajustar o pH para 7,4 ± 0,2 com HCl ou NaOH.
6. Realizar testes de controlo de qualidade sobre o meio de transporte viral por meio de testes para influenza A proteína da matriz do vírus por TRr-PCR, tal como descrito por Zhang e Harmon. ²²
7. Dispensar 5 ml do meio de transporte viral em frascos de polietileno de alta densidade estéreis com a capacidade de 8 ml. Rotular os tubos de ensaio para utilização no campo.
8. Armazenar os frascos prontos para uso em caixas padrão crio a -20 ° C até a coleta de amostras.

2. Recolha de Nasal Wipes de suínos

1. Descongele o número apropriado de frascos imediatamente antes da coleta da amostra; será necessário um frasco para injectáveis ​​por suíno amostrados. Descongelamento na salatemperatura leva aproximadamente 30-45 min. Manter os tubos descongelados arrefecer em blocos de gelo até o uso.
2. Don equipamento de proteção individual como ditadas pela situação (por exemplo, fato-macaco, capas para botas, máscara, protetor auricular, etc.).
3. Entre na área de animal. Se necessário, limitar o porco a uma pequena área mas não conter. Não despertar descansando animais.
4. Coloque em um par de luvas de exame descartáveis. Tome cuidado para não contaminar as luvas por porcos tocando, pessoas ou objetos inanimados.
5. Use uma mão enluvada para remover um estéreis 5,08 cm x 5,08 cm (2 pol. X 2 pol.) Gaze de algodão de sua embalagem. Compressas de gaze estéreis deve ser usada sempre que possível. Compressas de gaze embrulhados individualmente são mais convenientes de usar do que aqueles envolvidos com duas almofadas de gaze por pacote.
6. Segure a gaze de algodão com as pontas dos dedos de uma mão expor tanto da almofada possível para amostragem.
7. Limpe a gaze em todo o focinho do porco, tendocuidado extra para entrar nas narinas externas, se possível. Recolhe secreções nasais visíveis (aproximadamente 1 ml) com a mesma almofada de gaze.
8. Usando o mesmo lado, dobre a compressa de gaze sobre si mesmo para facilitar a colocação no frasco contendo meio de transporte viral.
9. Utilizando outro lado, remover a tampa do frasco e colocar a almofada de gaze dobrada para dentro do frasco. Recapitular o frasco e agite o frasco para garantir a mistura do compressa de gaze e meio de transporte viral.
10. Retire as luvas e coloque em um recipiente apropriado. Mudar de luvas entre cada porco.
11. Verificar o identificador do frasco. Número recorde de identificação porco, idade, sexo, sinais clínicos, e outras notas consideradas necessárias ao investigador.
12. Refrigere as amostras imediatamente após a coleta. Considere fazer alíquotas da amostra antes de congelar para evitar múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Tão rapidamente quanto possível após a colheita, colocar as amostras em gelo seco durante o transporte para o laboratório. Armazenar os tubos a -80° C até que o teste é iniciado.

3. Detecção do vírus influenza A Ácido Nucleico

1. Descongelar as amostras num banho de grânulo seco 37 ° C durante 5 min e em seguida terminar o descongelamento das amostras no cimo da bancada à temperatura ambiente durante 20-30 min. A adição simultânea de vários frascos para os grânulos irá fazer com que o banho ao calor; recomenda-se precaução, para não superaquecer os frascos.
2. Retirar 100 ml de meio de transporte viral para extração de RNA.
   1. Usar um de alto rendimento (96 formato de placa de poço) plataforma esférulas magnéticas para a extracção de ARN a partir de um grande número de amostras. ³¹
3. Use em tempo real PCR transcriptase reversa para a influenza A detecção rápida do vírus. ³¹

4. O isolamento do vírus influenza A partir nasais Wipes

1. Descongelar as amostras tal como descrito acima na Secção 3.1
2. Trate amostras descongeladas com sulfato de gentamicina (1000ug / ml), anfotericina B (22,5 ug / ml), e sulfato de canamicina (325 ng / mL).
3. Inocular em Madin-Darby de rim canino (MDCK) células epiteliais como descrito anteriormente. ³²

Resultados

A utilização bem sucedida deste método produz TRr-PCR resulta que, acompanhada com a utilização de um controlo interno durante a extracção de ARN e TRr-PCR, mostram amostras não contêm inibidores de PCR a partir de quaisquer detritos apanhados ambiente durante a amostragem. Após a inoculação de exemplo, os poços de isolamento de vírus deve ser livre de detritos ambientais visível a partir da amostra. Há um consenso razoável entre os resultados rRT-PCR e os resultados de isolamento de vírus com o entendimento de que a PC...

Discussão

Coleta de amostras de suínos utilizando swab nasal com ponta de poliéster tem se mostrado útil para conduzir a vigilância IAV; no entanto, a utilização do procedimento de swab nasal dificulta os esforços de vigilância devido ao uso obrigatório de um laço à contenção. Toalhetes nasais representam um refinamento de técnicas de amostragem suína atuais para minimizar o estresse sobre as pessoas e suínos durante a coleta de amostra. Enquanto o método tem sido desenvolvido e validado para exposição em ambientes de suínos, ele...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicilina G Sal de Sódio	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Sulfato de Estreptomicina	AMRESCO LLC	0382
Solução de Gentamicina	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Solução de Anfotericina B	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Sulfato de Canamicina	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Frascos de Diagnóstico Nalgen	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE com fecho PP branco
Esponja de Gaze Dermacea, 8 camadas		Covidien 441211	5.08 cm & 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Luvas de exame de nitrilo	Saftey Choice	19-170-010 (AD)